PLACE DES TESTS SEROLOGIQUES DANS LE DIAGNOSTIC DE LA COVID-19

GENERALITES SUR LE SARS-COV-2

Définition 

Le SARS-CoV-2 est le nom officiel du nouveau coronavirus identifié le 9 janvier 2020 dans la ville de Wuhan, chef-lieu de la province du Hubei en Chine. Il est l’agent étiologique de l’épidémie de pneumopathie infectieuse qui s’est répandue en Chine et dans le monde à partir de fin décembre 2019. Cette maladie a été nommée COVID-19 par l’OMS, le 11 février 2020.

Classification

Le virus SARS-CoV-2 appartient, comme le virus du SRAS, à l’espèce SARSCoV (Severe acute respiratory syndrom-related Coronavirus), au genre Betacoronavirus et à la famille des Coronaviridae ( Figure 1 ). La morphologie des virions est typique de celle des coronavirus [1], avec notamment le halo de protubérances constituées de péplomères de protéines virales « Spike » (spicule), qui leur a donné leur nom (« virus à couronne »). Le nombre de génomes isolés et séquencés croît rapidement ainsi que leurs origines géographiques ; ils sont plus de 5 000 au 10 mai 2020 [2] (les premiers génomes séquencés, originaires de Wuhan, l’ont été par le CDC chinois, l’Institut de biologie des agents pathogènes et l’hôpital Wuhan Jinyintan) [3]. Ceci a permis de rapidement montrer que SARS-CoV-2 a des similitudes avec les Betacoronavirus trouvés chez les chauves-souris [4]. Il forme une souche virale génétiquement distincte des autres coronavirus humains MERS ou d’autres espèces plus bénignes, mais appartenant à la même espèce biologique que le SARS-CoV, dans le sous-genre Sarbecovirus.

Structure 

Le sars-cov-2 est un virus enveloppé à ARN monocaténaire positivement polarisé de 29,9 kb [6]. Les deux tiers du génome codent pour un vaste gène réplicase (composé de orf1a et orf1b) qui sera traduit en deux polyprotéines, par la suite clivées en seize protéines non structurales indispensables à la réplication virale [7]. Le tiers restant du génome code essentiellement pour les protéines de structures du virus dont quatre glycoprotéines membranaires, la protéine spike (s), l’hémagglutinine-estérase (he), les protéines de membrane (m), d’enveloppe (e) et la protéine de capside (n) (figure 2).La nucléocapside, hélicoïdale, formée de la protéine de capside (n) complexée à l’ARN viral, est protégée par une enveloppe phospholipidique dans laquelle sont enchâssées les glycoprotéines de surface (s, he, m et e). La protéine s est la protéine qui lie le récepteur cellulaire du sars-cov-2 (ACE2) et permet l’entrée dans la cellule. Elle est formée de deux sous-unités : s1 qui contient le domaine de liaison au récepteur cellulaire, et s2 qui est essentiel pour la fusion du virus à la membrane cellulaire (figure 3).

Caractères antigéniques 

Comme tous les autres coronavirus, le génome du CoV-2 du SRAS (2019- nCoV) code pour la protéine de pointe, la protéine d’enveloppe, la protéine de membrane et la protéine de nucléocapside.
✯ Protéine de pointe S – Antigènes (Protéines et peptides) Cette protéine transmembranaire de type I est présente sur l’enveloppe virale sous la forme d’un homotrimère. Chaque monomère se compose de 2 sousunités, S1 et S2. La sous unité S1 contient un domaine RBD (receptor binding domain) qui se fixe au récepteur ACE2 sur la membrane de la celle hôte. La sous-unité S2 est activée par la liaison entre S1 et le récepteur ACE2 et contient les éléments nécessaires à la fusion membranaire. La protéine S joue donc un rôle important dans l’infection par le SARS-CoV-2 ainsi que dans l’induction des réponses des anticorps de neutralisation et des cellules T et dans l’immunité protectrice.
✯ Protéine de nucléocapside N – Antigènes (Protéines et peptides) La protéine de nucléocapside ou protéine N ou ribonucléoprotéine est la protéine la plus abondante des coronavirus. Cette protéine de 50 kDa codée par le gène ORF9b est une phosphoprotéine hautement immunogène également impliquée dans la réplication du génome viral et dans la modulation des voies de signalisation cellulaire. Lors de l’assemblage du virion, la protéine N se lie à l’ARN viral et entraîne la formation de la nucléocapside hélicoïdale. En raison de la conservation de la séquence de la protéine N et de sa forte immunogénicité, la protéine de nucléocapside du coronavirus est choisie comme outil de diagnostic ou comme cible potentielle pour la mise au point de nouveaux vaccins.
✯ Protéine d’enveloppe E La protéine d’enveloppe, ou protéine E, est un petit polypeptide de 100 résidus qui contient au moins un domaine transmembranaire hélicoïdal α et un groupe de 2-3 cystéines juxta membranaires. Elle intervient dans plusieurs processus du cycle de vie du virus, tels que l’assemblage, le bourgeonnement, la formation de l’enveloppe et la pathogénèse. La protéine E a une activité de perméabilisation de la membrane, ce qui pourrait justifier l’inhibition in vitro de l’activité des canaux ioniques de certaines protéines E synthétiques du coronavirus, ainsi que de la réplication virale. Elle agit comme une viroporine et s’auto-assemble dans les membranes de l’hôte en formant des pores protéino lipidiques pentamérique qui permettent le transport des ions.Elle joue également un rôle dans l’induction de l’apoptose, active l’inflammasome NLRP3 de l’hôte, ce qui entraîne une surproduction d’IL-1 bêta.
✯ Hélicase (Protéine H) La protéine non structurelle 13 (nsp13) du SARS-Cov-2 est une hélicase qui sépare l’ARN ou l’ADN double brin d’une polarité de 5′-3′, en utilisant l’énergie de l’hydrolyse des nucléotides. Une caractérisation biochimique de base de la nsp13 a démontré qu’elle peut dérouler l’ADN et l’ARN double brin dans une direction de 5′-3′, et qu’elle peut hydrolyser tous les désoxyribonucléotides et ribonucléotides triphosphates. Les hélicases sont des protéines motrices qui utilisent l’énergie dérivée de l’hydrolyse des nucléotides pour dérouler les acides nucléiques double brin en deux acides nucléiques simples brins. Au départ, on considère que les hélicases étaient uniquement des moteurs moléculaires qui déroulaient les acides nucléiques pendant la réplication, la recombinaison et la réparation de l’ADN. Des études récentes ont montré qu’elles sont également impliquées dans d’autres processus biologiques, notamment le déplacement des protéines de l’acide nucléique, le mouvement des jonctions de Holliday, le remodelage de la chromatine, la catalyse des changements conformationnels des acides nucléiques, plusieurs aspects du métabolisme de l’ARN, y compris la transcription, l’épissage de l’ARNm, l’exportation de l’ARNm, la traduction, la stabilité de l’ARN et l’expression des gènes mitochondriaux[12].
✯ Protéase de type papaïne (PLPro) Les protéases des coronavirus, comme le SARS-CoV-2, la protéase de type papaïne (PLpro pour papain-like protease) et la protéase de type 3C (3CLpro pour 3C-like protease), sont des cibles antivirales intéressantes car elles sont essentielles à la réplication des coronavirus.

La PLPro est une protéase localisé dans la protéine non structurale 3 (NS3) du polypeptide viral. La PLpro a la fonction supplémentaire de retirer l’ubiquitine et l’ISG15 des protéines des cellules hôtes pour aider les coronavirus à échapper aux réponses immunitaires innées de l’hôte. En effet, l’action de la PLPro perturbe les voies de signalisation de l’INF beta et de NF-kappa B. Le ciblage de la protéase de type papaïne avec des médicaments antiviraux peut avoir un avantage non seulement en inhibant la réplication virale, mais aussi en inhibant le dérèglement des cascades de signalisation dans les cellules infectées qui peuvent conduire à la mort cellulaire dans les cellules environnantes non infectées.

Caractères physico-chimiques 

➤ Les substances virucides
Le coronavirus Sars-Cov-2 est un virus à enveloppe très facilement détruit ou inactivé par un grand nombre de substances antiseptiques, de détergents ou autres produits(savon, liquide de vaisselle et de lessive etc)[14].
➤ La température
Plusieurs études montrent que le Sars-cov-2 et plusieurs autres coronavirus sont sensibles à l’augmentation de la température, sans doute en raison de l’action de cette dernière sur les protéines du virus. Il est très stable à 4°C et sa résistance sur des supports secs comme dans les sérums destinés à les conserver diminue progressivement avec la chaleur. Il est inactivé à 60° en 30 minutes [14].
➤ L’humidité
Plusieurs études laissent penser que le virus aurait une persistance plus faible dans les milieux humides [15].
➤ Le pH
Nombre de virus sont sensibles au pH de leur environnement. Cependant, le coronavirus SAS-Cov-2 semble cependant très résistant aux milieux acides et basiques. Il résiste bien à des pH entre 2,2 et 12. Il incomplètement inactivé par un pH 13[15].
➤ Persistance sur les surfaces
Les études montrent une plus faible résistance de Sars-Cov-2 et/ou Sars-cov sur deux types de supports :
● sur le cuivre qui a des propriétés chimiques naturellement biocides
● sur les supports poreux : papier, carton, textile Il résiste plus longtemps (jusqu’à 3 jours) sur des supports tels que le plastique, le métal, etc[16].

Caractères culturaux 

Une culture de virus pousse de façon extrêmement rapide avec un délai de 4 jours. Mise en culture se fait sur ces cellules (Vero E6) les prélèvements trouvés positifs pour ce virus [17]. (Figure 4).Le résultat de la culture dépend de :
➤ La charge virale qui doit être importante
➤ La qualité des prélèvements

Multiplication virale

Le virus est un pathogène intracellulaire obligatoire, et doit pénétrer dans une cellule hôte pour pouvoir se multiplier (Figure 5). La première étape de ce processus est donc l’entrée du matériel viral dans le cytoplasme après avoir franchi la membrane cellulaire. L’étape d’entrée débute par l’attachement de la particule virale à la surface de la cellule. Celle-ci repose sur l’interaction entre les spicules à la surface de la particule virale (protéine S du SARS-CoV-2) et la glycoprotéine angiotensine converting enzyme 2 (ACE2) qui agit en tant que récepteur d’entrée. Après fixation à ACE2, la spicule virale (S) est coupée en deux parties par une protéase (enzyme qui coupe les protéines) de la cellule hôte. Cet évènement moléculaire est nécessaire pour exposer une partie de la séquence polypeptidique de S appelée « peptide de fusion » qui s’insère dans la membrane cellulaire. S’ensuit un rapprochement entre l’enveloppe du virus et la membrane cellulaire, toutes deux formées par une bicouche lipidique qui fusionneront. Parmi ces protéases, la molécule TMPRSS2 qui est présente à la surface de la cellule permet la fusion du virus avec la membrane plasmique de la cellule hôte. Le virus peut également entrer par « endocytose »: la fixation de Spike à ACE2 va induire une invagination de la membrane plasmique, englobant le virus qui rentre dans un « endosome » où une protéase, activée par l’acidité de ce compartiment, permettra de déclencher la fusion entre la membrane endosomale et la membrane virale. La fusion entre les membranes cellulaires et virales libère l’ARN viral dans le cytoplasme cellulaire où se met en place la réplication du virus. La présence du récepteur viral est un déterminant majeur de la reconnaissance spécifique entre le virus et l’hôte (ou tropisme), c’est-à-dire la cellule, le tissu ou même l’espèce animale dans laquelle le virus peut se multiplier. SARS CoV-2 peut donc infecter les cellules humaines exprimant ACE2 : cellules du poumon, des artères, du cœur, des reins et de l’intestin. Une fois à l’intérieur de la cellule hôte, le virus va détourner les processus cellulaires (on parle aussi de machineries) de production de protéines (traduction) au profit de la synthèse de ses propres composants. L’ARN viral est traduit par les ribosomes (usines où l’ARN messager contenant l’information génétique est converti en protéine fonctionnelle). Ce processus met en jeu les ARN de transfert cellulaires (ARNt) qui mettent en correspondance un « codon » de trois nucléotides et un acide aminé donné. Dans une phase précoce de la traduction, deux poly-protéines précurseurs (pp1a et pp1ab) sont produites. Celles-ci possèdent une activité protéase responsable de leur auto-clivage en plusieurs protéines maturées, dites non structurales (car ne participant pas à la formation de la particule virale). Ces protéines forment le complexe réplicase-transcriptase (CRT) nécessaire à la multiplication du génome viral. Parmi elles on trouve l’ARN polymérase ARN-dépendante ou réplicase (RdRp), qui permet de faire de nouvelles copies du génome viral ARN. Au sein du CRT, de petits transcrits viraux dit subgénomiques sont aussi  produits. Ils codent les protéines structurales (M, E, S et N) qui composent la particule virale. Dès qu’elles émergent des ribosomes, les protéines M, E et S sont insérées dans la membrane du réticulum endoplasmique cellulaire. La protéine N (ribonucléoprotéine) est responsable de la reconnaissance et l’empaquetage du génome viral répliqué pour former la nucléocapside. Via la protéine N la nucléocapside va aussi interagir avec la protéine M pour initier la formation de la nouvelle particule virale. Ainsi, des vésicules composées des protéines virales membranaires, et englobant la nucléocapside, émergent dans le lumen (l’intérieur) d’un compartiment dérivé du réticulum endoplasmique, appelé « ERGIC » (processus appelé bourgeonnement) (2). Au cours de cette étape la protéine S est incorporée dans la particule virale naissante. Les virus ainsi constitués sont acheminés à la surface de la cellule infectée en suivant la voie de sécrétion (appareil de Golgi, puis vésicules sécrétoires) puis libérés dans le milieu extracellulaire par « exocytose », prêts à infecter d’autres cellules. Le virus détourne donc à son profit tant les ribosomes et les ARNt, que toutes les organelles et machineries mis en jeu dans la voie de sécrétion des protéines (acheminement du réticulum endoplasmique à la surface cellulaire ou au milieu extérieur).

Physiopathologie

Les déterminants de la réponse immunitaire immédiate au SARS-CoV-2 ne sont pas encore connus, mais peuvent être extrapolés à partir des modèles d’infection virale (Figure 6). L’infection des cellules épithéliales et immunitaires du tractus respiratoire génère plusieurs signaux de danger, reconnus par différents récepteurs (Pattern Recognition Receptors, ou PRRs) liant l’ARN viral (TLRs 3, 7, 8, RIG-1, MDA-5) ou des protéines de surface virales (TLR 2, TLR 4). Ces récepteurs vont ensuite activer des facteurs de transcription (IRF-3, IRF-7, AP-1, NF-KB) [19]. Cette activation entraîne la sécrétion de cytokines (TNF-a, IL-1, IL-6) entraînant une hyper perméabilité capillaire et l’attraction de cellules inflammatoires, et d’interférons de type I (IFN-1), qui promeuvent l’expression de gènes cibles (ISG, pour interferon stimulated genes) [20]. Ces interférons vont promouvoir l’expression de gènes cibles (ISG pour interferon-stimulated genes), par liaison à leur récepteur IFNAR, signalant par JAK/STAT [21]. La voie des interférons de type I est centrale dans la réponse antivirale initiale, et permet notamment d’inhiber la réplication virale, de protéger les cellules non-infectées et de stimuler l’immunité lymphocytaire antivirale (lymphocytes T CD8, NK) conduisant à la lyse des cellules infectées [22]. L’activation des facteurs de transcription entraîne une sécrétion cytokinique initiale par les cellules infectées (interférons, TNF-a, IL-1, IL-6, chimiokines). Les antigènes viraux sont internalisés par les cellules présentatrices d’antigène, apprêtés puis présentés via les complexes majeurs d’histocompatibilité de type 1 (pour l’ARN viral) et de type 2 (pour les protéines de surface) aux lymphocytes T CD4, CD8 et lymphocytes B, polarisés par la sécrétion cytokinique initiale, assurant l’instauration d’une immunité durable.

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : GENERALITES SUR LE SARS-COV-2
I.1. Définition
I.2. Classification
I.3. Structure
I.4. Caractères antigéniques
I.5. Caractères physico-chimiques
I.6. Caractères culturaux
I.7. Multiplication virale
I.8. Physiopathologie
I.9. Épidémiologie
I.10. Diagnostic Biologique
I.10.1. Prélèvements
I.10.2. Détection de l’acide nucléique
I.10.3. Isolement et culture du virus
I.10.4. Détection d’anticorps de sérum
I.10.5. Diagnostic paraclinique
CHAPITRE II : PLACE DES TESTS SEROLOGIQUES DANS LE DIAGNOSTIC DE LA COVID-19
II.1. Définition
II.2.Cinétique des anticorps
II.2.1. Évolution des anticorps sériques
II.2.2. Puissance et persistance de la réaction immunitaire
II.3. Les tests sérologiques
II.3.1. les Tests automatisables Elisa (enzyme-linked immunosorbent assay)
II.3.2. Les tests sérologiques de diagnostic rapide (TDR)
II.3.3. Les tests rapides de détection des antigènes du virus sars-cov-2
II.3.4. Autres tests
II.4. Prélèvements
II.5. Indications des tests sérologiques
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
I. MATERIEL ET METHODES
I.1.Type et cadre d’étude
I.2. Population d’étude
I.3. Prélèvements
I.4. Paramètres étudiés
I.5. Méthodes
I.5.1. Composition des TDR
I.5.1.1. kit SARS-CoV-2 Antibody Test (Fabricant: Wondfo®)
I.5.1.2. kit 2019-nCOV/COVID-19 IgG/IgM Rapid Test Device (Fabricant: REALY TECH)
I.5.2. Réalisation du test
I.5.3. Interprétation des résultats
I.5.4. Exploitation statistique
RESULTATS
II. RESULTATS
II.1. Caractéristiques générales des échantillons testés
II.2. Evaluation de la spécificité clinique
II.3.Evaluation de la sensibilité Clinique
II.3.1. 2019-nCOV/COVID-19 IgG/IgM Rapid Test Device
II.3.2. SARS-CoV-2 Antibody Test
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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