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Les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium : EDHF
En plus de l’action vasorelaxante du NO et de la prostacycline, il existe un autre mécanisme de relaxation induit par des agents vasoactifs, tels que l’acétylcholine et la bradykinine, dépendants de l’endothélium. Il se caractérise par une hyperpolarisation du muscle lisse induite par des facteurs libérés par l’endothélium (EDHF : endothelium-derivated hyperpolarizing factor). Ce mécanisme persiste après l’inhibition des voies impliquant la NOS et les COX mais se trouve inhibé par l’application d’inhibiteurs de canaux potassiques, suggérant que l’hyperpolarisation passe par l’activation de ceux-ci [61].
L’identité de ces facteurs endothéliaux est encore mal définie et fait l’objet de nombreuses investigations. Dans tous les cas, il y a une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire de la cellule endothéliale. Cette augmentation est associée au niveau des artères à une activation des canaux IKCa menant à une hyperpolarisation des cellules endothéliales et à une augmentation de la concentration extracellulaire en potassium [21].
Cette hyperpolarisation est transmise sur une distance relativement longue d’une part entre les cellules endothéliales par les gap junctions et d’autre part par les canaux de la famille des Kir (Kir2.1) exprimés au niveau endothélial et activés par l’augmentation en potassium extracellulaire. Ces derniers permettent ainsi d’amplifier le signal ionique déclenché par d’autres conductances potassiques et participent à la transmission de l’hyperpolarisation le long des cellules endothéliales de la microcirculation [22].
Au moins 3 voies de transmission de l’hyperpolarisation vers les myocytes vasculaires sont concernées par le mécanisme d’EDHF :
La phase d’hyperpolarisation pourrait être transmise au muscle lisse par les ions K+ libérés par les canaux IKCa des cellules endothéliales en activant les canaux Kir et la pompe Na+/K+ATPase des myocytes. L’ion K+ pourrait donc agir comme un EDHF et constituer la première voie comme indiqué sur la Figure 8 [22]. La transmission de l’hyperpolarisation et du signal vasorelaxant aux myocytes vasculaires serait aussi permise par la présence de jonctions myoendothéliales (myoendothelial gap junction) correspondant à la deuxième voie indiquée. Ces contacts s’établissent de manière discontinue au travers de la lame élastique interne et sont d’autant plus exprimés que le diamètre des vaisseaux diminue [22].
Les variations du potentiel de membrane des cellules endothéliales sont transmises aux myocytes, qui sont connectés entre eux par les gap junctions, induisant une coordination des réponses entre les cellules endothéliales et les myocytes menant à la modulation globale du tonus vasculaire [21].
Enfin, des études récentes ont proposé l’existence d’une troisième voie possible impliquant des produits du métabolisme de l’acide arachidonique par le cytochrome P-450 monooxygenase au sein de la cellule endothéliale, les acides epoxyeicosatriènoiques (EETs) (Figure 9). Ils joueraient le rôle d’EDHF en permettant d’induire, suite à leur libération, une vasorelaxation soit par l’activation des canaux BKCa par l’intermédiaire d’une protéine G (Gsα) soit par l’activation des canaux Kir et de la pompe Na+-K+-ATPase des myocytes. Une activation indirecte des BKCa par les TRPV4 est aussi observée menant là aussi à une hyperpolarisation du myocyte [13].
Les facteurs vasoconstricteurs
Endothélines
La famille des endothélines comprend trois peptides: endothéline-1 (ET1), endothéline-2 (ET2) et endothéline-3 (ET3). Ces 3 peptides ont tous 21 acides aminés, dont les séquences ne diffèrent entre elles que sur quelques résidus. Les principales particularités entre ces trois iso formes tiennent de leur profil d’expression tissulaire et de leur affinité pour les deux récepteurs membranaires de l’endothéline: le récepteur ET-A et le récepteur ET-B.
L’endothéline 1 (ET1), identifiée par Yanagisawa en 1988 dans les cellules endothéliales d’aorte de porc, est le plus puissant vasoconstricteur connu jusqu’à présent [79].
• Biosynthèse de l’ET1
Les endothélines sont synthétisées principalement par les cellules endothéliales mais elles sont aussi produites par les leucocytes, les macrophages, les cellules musculaires lisses, les cardiomyocytes et les cellules mésangiales [58].
L’ET1 provient d’un précurseur, le prépro-ET1 (Figure 10). Après le clivage d’un peptide signal, le prépro-ET1 est converti en un intermédiaire biologiquement inactif de 38 acides aminés, le Big ET1, par une enzyme de type convertase. Le Big ET1 est ensuite clivé au niveau du pont Trp21-Val22 pour donner l’ET-11-21. Cette réaction est catalysée par une enzyme de conversion, l’Endothelin Converting Enzyme-1 (ou ECE-1) dont il existe 4 isoformes (a, b, c et d) dont la traduction protéique s’effectue à partir d’ARN messagers provenant d’épissage alternatif à partir d’un gène unique.
D’autres enzymes, comme les chymases et les métalloprotéases autres que les ECE peuvent également convertir le Big ET1 en ET1. Par ailleurs les chymases clivent le pont Tyr31-Gly32, aboutissant à la synthèse d’un peptide de 31 acides aminés, l’ET-11-31, dont le rôle physiologique est inconnu [33].
• Libération de l’ET-1
Après sa synthèse, l’ET1 n’est pas stockée dans les vésicules de sécrétion à l’intérieur des cellules endothéliales. Cependant la cascade de réactions aboutissant à la synthèse de l’ET1 à partir du gène codant son précurseur, le prépro-ET1 s’effectue en quelques minutes permettant un ajustement très rapide de la production d’ET1.
L’ET1 est principalement libéré dans le milieu extracellulaire par le pôle basal des cellules endothéliales, en regard des cellules musculaires lisses, suggérant un mécanisme d’action essentiellement paracrine lorsque l’ET1 se lie aux récepteurs du muscle lisse vasculaire. Cependant, une action autocrine de l’ET1 est également possible lorsqu’il active des récepteurs endothéliaux [58].
• Mécanismes d’action
L’ET1 exerce ses effets en se liant à des récepteurs membranaires dont il existe deux types distincts: le récepteur ET-A et le récepteur ET-B. Tous deux appartiennent à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires, couplés aux protéines G. Le récepteur ET-A possède une affinité 100 fois plus grande pour l’ET1 et l’ET2 que pour l’ET3. Le récepteur ET-B possède la même affinité pour les trois iso-formes d’endothéline. La liaison de l’endothéline à son récepteur active une protéine G, de type Gq, couplée à la phospholipase C. Cette dernière hydrolyse des phospholipides membranaires, donnant naissance à l’inositol triphosphate (IP3) d’ une part, et au 1-2 diacylglycerol d’autre part. Par des voies de transduction intracellulaires différentes, ces deux messagers intracellulaires entraînent une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium et active la voie de la protéine kinase C favorisant la prolifération cellulaire [33].
Dans le système cardiovasculaire, le récepteur ET-A est exprimé principalement à la surface des cellules musculaires lisses et des cardiomyocytes tandis que le récepteur ET-B est localisé à la fois sur les cellules endothéliales et sur les cellules musculaires lisses [7]. Le récepteur ET-B présent à la surface des cellules endothéliales jouerait un rôle dans la clearance de l’ET1 plasmatique [80].
• Effets cellulaires de l’endothéline
L’ET1 participe, par son effet vasoconstricteur, à la régulation du tonus vasculaire basal et de la pression artérielle systémique [73].
In vitro, l’ET1 active la prolifération des cellules musculaires lisses, stimule la synthèse de protéines de la matrice extracellulaire, et potentialise effets du facteur de croissance, TGFβ (Transforming Growth Factor β) et du PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) [19]. Son pouvoir mitogénique sur les cellules musculaires lisses est dépendant de la présence respective des récepteurs ET-A et ET-B [65].
L’ET1 possède également des propriétés pro-inflammatoires [41].
A des concentrations nanomolaires, l’ET1 possède des effets chronotropes et inotrope [38. L’ET1 entraîne la synthèse du NO et de la prostacycline par les cellules endothéliales, via la stimulation des récepteurs endothéliaux de type ET-B [35].
Les endothélines sont impliquées dans de nombreuses pathologies où leur concentration plasmatique est élevée ; c’est le cas notamment de l’hypertension artérielle pulmonaire, de l’insuffisance cardiaque chronique aigue, de l’ischémie myocardique [26].
Thromboxane A2
Au niveau de l’artère basilière de chien, l’acétylcholine induit une contraction dose dépendante. Cette contraction est abolie par la destruction de l’endothélium vasculaire montrant le caractère endothélium-dépendant de ce phénomène [70]. Cette contraction endothélium-dépendante est réduite en présence d’inhibiteurs de cyclooxygenase (cox) (aspirine, indométacine) suggérant l’implication des métabolites des cox.
La contraction endothélium dépendante induite par l’acétylcholine est également atténuée en présence d’un inhibiteur de la thromboxane A2 synthétase (OKOY-046) ou d’un antagoniste des récepteurs au thromboxane A2.
Parallèlement à l’acétylcholine, d’autres substances vasoactives testées telles que angiotensines I et II, l’ATP, l’histamine et la bradykinine pouvaient entrainer une contraction endothélium-dépendante due au thromboxane A2.
En plus de l’artère basilaire canine, l’artère intra pulmonaire de lapin pouvait faire l’objet d’une contraction endothélium-dépendante due au thromboxane A2 [66].
Les Leucotrienes
Les travaux de Jino ont montré qu’en présence d’un inhibiteur de la NO synthase (1-NAME), l’acétylcholine entrainait une contraction dose-dépendante de l’artère coronaire de lapin [39]. Cette contraction endothélium-dépendante est atténuée en présence d’inhibiteurs de la 5-lipooxygenase [L663, 536] et [BAYX1005], d’antagonistes de récepteurs aux leucotriènes [ONO-1078 ETSET F104535] par contre elle n’est pas affectée par la présence d’inhibiteurs de thromboxane A2 synthétase [OKY-046] et d’antagonistes aux récepteurs de thromboxane A2 [ONO-3708]. De ces résultats, il découle que la contraction endothélium-dépendante induite par l’acétylcholine avec l’artère coronaire de lapin est bien due aux leucotriènes.
Le muscle lisse vasculaire
Mécanisme de vasomotricité de la Cellule musculaire lisse vasculaire
L’état de contraction des CML dépend de la concentration en Ca2+ cytoplasmique et de la sensibilité de l’appareil contractile au calcium. La CML doit être capable d’augmenter la concentration de Ca2+ rapidement, et de la diminuer tout aussi rapidement. Il s’avère que la concentration de Ca2+ cytoplasmique est plus faible que la concentration extracellulaire et que la concentration à l’intérieur des stocks intracellulaires (majoritairement le réticulum sarcoplasmique). La hausse du taux de Ca2+ va donc être un phénomène plutôt passif alors que la baisse va demander une dépense d’énergie.
• Effets du calcium intra cellulaire
Dans les CML la concentration cytoplasmique en Ca2+ est d’environ 0,1 µM alors que pour le compartiment extracellulaire elle avoisine 1 à 2 mM et 10 à 15 mM pour le réticulum sarcoplasmique [15]. Malgré ce gradient de concentration et un potentiel de membrane favorable (-80 mV), l’entrée du calcium dans la cellule est très faible car les canaux calciques voltage-dépendant sont fermés et que la diffusion passive à travers la bicouche lipidique est négligeable. Ce gradient de Ca2+ est maintenu par différents mécanismes de transport :
• Transport de Ca2+ à travers la membrane plasmique
Ce transport est assuré par une Ca2+ -ATPase bien caractérisée [13].Son expression est variable dans les CMLV : elle est faible ou absente dans les petits vaisseaux et plus abondante dans les CML des grosses artères ou grosses veines [49. Cette enzyme est considérée comme étant neutre d’un point de vue du potentiel de membrane, pompant 2 ions H+ pour chaque ion Ca2+ expulsé, mais importante en ce qui concerne la régulation du pH intracellulaire [6], [14].
• Transport à travers les membranes intracellulaires
Parmi les différentes organelles de la CMLV, les mitochondries jouent un rôle important dans l’homéostasie calcique uniquement dans les cellules avec un taux de Ca2+ pathologiquement élevé [74].
Le rôle possible du noyau dans le stockage du calcium intracellulaire est encore controversé, et seul le reticulum sarco/endoplasmique joue un rôle primordial dans la régulation du Ca2+ intracellulaire. Le réticulum sarcoplasmique (RS) ne représente que 1,5 à 7,5 % du volume cellulaire total. Il est typiquement plus abondant dans les vaisseaux toniques (comme l’aorte ou les artères élastiques) que dans les vaisseaux phasiques (comme la veine porte) où il ne représente que 1,5 à 2 % du volume cellulaire [72]. Dans les CML artérielles son abondance diminue proportionnellement à la taille de la lumière du vaisseau [74]. Le pompage du Ca2+ dans le réticulum est assuré par des ATPases Ca2+ – dépendantes du RS (Sarco Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase : SERCA) qui peuvent représenter jusqu’à 90 % des protéines de la membrane du réticulum.
Régulation de la vasomotricité de la CMLV
Régulation par le système nerveux sympathique
Les fibres sympathiques participent au tonus vasculaire et ont une influence vasoconstrictrice. L’existence de fibres vasoconstrictrices fut mise en évidence dès 1851 par Claude Bernard. La noradrénaline libérée au niveau des fibres post-ganglionnaires sympathiques peut agir sur des récepteurs α-adrénergiques des cellules musculaires lisses vasculaires et provoquer une vasoconstriction. La section de l’innervation sympathique ou l’administration d’α-bloquant provoque une augmentation du flux sanguin significative : à débit constant, c’est à dire activité cardiaque constante en termes de force et de fréquence, la vitesse augmente si le calibre diminue. La vasodilatation induite par une baisse de l’activité des fibres sympathiques est importante et participe à la vasodilatation autant que l’activation du système antagoniste : le système parasympathique. A pression artérielle normale (125 mmHg/75 mmHg) les vaisseaux sont sous ” tonus sympathique ” : c’est le système sympathique qui est en activité.
L’action de la noradrénaline sur des récepteurs de type β-adrénergique provoquerait au contraire une vasodilatation. C’est donc l’expression de l’un ou de l’autre type de récepteurs qui détermine la réponse de la CML au système sympathique. Cette distinction pharmacologique des récepteurs adrénergiques a été mise en évidence par Ahlquist dès 1948 [2].
• Effets des récepteurs alpha adrénergiques
Il existe deux types de récepteurs α-adrénergiques, les récepteurs α1 et les récepteurs α2, distingués pharmacologiquement selon leurs affinités pour divers agonistes et antagonistes. Les travaux de biologie moléculaire ont démontré que les récepteurs α1 étaient couplés à une production d’IP3 via l’activation d’une PLC par une protéine Gq/11 [ 31].
On retrouve les récepteurs α1 notamment sur les artères irriguant les reins, les territoires splanchniques et la peau. Dans ces organes, la fixation des catécholamines provoque une vasoconstriction et donc une diminution du débit sanguin local.
Les récepteurs α2 se retrouvent quant à eux essentiellement au niveau des veines où leur activation provoque également une faible vasoconstriction qui favorise le retour veineux. Ils agiraient en activant une protéine Gi, qui inhiberait l’activité des adenylyl cyclase (AC), mais aussi par inhibition de l’ouverture des canaux calciques voltage dépendant (CCVDs), et activation des canaux potassiques [31].
• Effets des récepteurs béta adrénergiques
Comme pour les récepteurs alpha, il existe plusieurs iso formes de récepteurs β-adrénergiques : les récepteurs β1, β2 et β3 [47] .On retrouve les récepteurs ß1 au niveau du cœur et des artères coronaires où la fixation des catécholamines provoque une dilatation des artères coronaires et au niveau du cœur un effet ionotrope. On retrouve les récepteurs β2 au niveau des artères des muscles squelettiques. Tous les récepteurs β-adrénergiques sont couplés à une protéine Gs qui va activer la production d’AMPc par une AC [31].
Dans certains cas cependant, les récepteurs β-adrénergiques sont couplés à une protéine Gi qui va inhiber la production d’AMPc dans les cellules.
Régulation par le système parasympathique
Les fibres parasympathiques ont une influence vasodilatatrice. Leur rôle est moins important que celui des fibres sympathiques puisque à l’état basal, l’organisme est sous tonus sympathique. C’est encore Claude Bernard qui démontra dès 1858 l’existence d’une vasodilatation induite par la stimulation d’un nerf.
• Fibres cholinergiques
Le système nerveux parasympathique cholinergique innerve principalement au niveau du système vasculaire les artères cérébrales et les artères coronaires. Ces fibres ne sont pas spontanément actives, mais vont libérer de l’acétylcholine (Ach) en cas de stimulation. L’Ach agit ensuite au niveau des récepteurs muscariniques sur la CMLV mais aussi sur les cellules endothéliales. Sur les CMLV, l’activation de récepteurs muscariniques de type M3 induit une élévation du Ca2+ cytoplasmique consécutive à l’activation d’une PLC, qui va aboutir à une contraction de la cellule. Cependant, au niveau des cellules endothéliales, l’Ach provoque une libération de NO, aboutissant à la vasorelaxation. L’Ach en injection intraveineuse provoque ainsi une baisse de la pression artérielle par vasodilatation nette. L’effet des afférences parasympathiques est moins univoque : il serait vasodilatateur dans le cas où l’épaisseur de la média est faible ou lorsque la libération d’Ach est abondante, permettant la diffusion de l’Ach vers les cellules endothéliales. Cet effet vasodilatateur pourrait aussi être dû à une diminution de la libération de noradrénaline au niveau des terminaisons sympathiques (par effet sur des récepteurs muscariniques pré-sympathiques). Sur les CML non vasculaires comme, par exemple, les CML gastro-intestinales ou bronchiques, l’Ach a des effets clairement constricteurs. C’est donc la présence des cellules endothéliales qui est responsable de son effet vasodilatateur.
Dysfonctionnement endothélial
Définition
L’endothélium joue un rôle capital dans la régulation du tonus vasculaire et du contrôle de l’hémostase ainsi que dans la pathogénèse de l’athérosclérose. Les malades présentant un ou plusieurs facteurs de risques cardiovasculaires développant une dysfonction endothéliale qui se manifeste par une atténuation de la réponse dilatatrice aux stimuli qui agissent en libérant du NO de l’endothélium.
Causes
Dans la plupart des pathologies vasculaires cet équilibre va être rompu par atténuation de la fonction vasodilatatrice de l’endothélium (vanhoute 1989…) on parle alors de dysfonctionnement endothélial. Elle peut se manifester suite à une diminution de sécrétions des facteurs vasodilatateurs et ou par l’augmentation des facteurs vasoconstricteurs au sein de l’endothélium (Figure 11). Elle peut aussi être la conséquence d’une diminution de la sensibilité des cellules musculaires pour les facteurs comme le NO, la prostaglandine ou L’ EDHF. L’augmentation des espèces réactives de l’oxygène au niveau des cellules endothéliales et musculaires lisses est très certainement une cause majeure de dysfonction endothéliale mais ne saurait à elle seule expliquer la dysfonction endothéliale.
Cette dysfonction endothéliale est une étape précoce dans les pathologies installées comme l’athérosclérose, l’insuffisance cardiaque [5],[10],[8] et [16] Nous savons que les mécanismes du dysfonctionnement endothélial sont complexes et que l’étiologie exacte de ce processus est toujours au cœur de la recherche actuelle, mais le stress oxydant en serait le dénominateur commun [29],[30]. Le stress oxydant est caractérisé par la formation accrue de ROS, principalement des radicaux libres oxygénés. Ces principaux radicaux sont l’anion superoxyde ; oxyde(O2); et le radical hydroxyle(OH). D’autres ROS tel que le peroxyde d’hydrogène (H2O2); le peroxynitrite (ONOO); le dioxyde d’azote (NO2); l’acide hypochloreux (HOCl) ne sont presque pas considérés comme des radicaux libres mais ont des pouvoirs oxydants contribuant ainsi au stress oxydatif. Dans une situation physiologique l’anion superoxyde peut être formé par différentes enzymes telle que la NADPH oxydase, la xanthine oxydase, les coxs et lipoxygenases, les NOSs, les cytochromes P450 et les enzymes de la chaine mitochondriale [11, 12, 60]; à des concentrations qui normalement devraient être réduite par les superoxydes dismutases (SOD) [19]. Les SOD représentent un mécanisme de défense important vis à vis des O2-Elles dismutent les anions superoxydes en H2O2 qui lui-même peut être dégradé en eau et oxygène par la catalase ou glutathion peroxydase [4, 18].
Dans les conditions physiologiques normales il existe une balance en production et dégradation des ROS.
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Table des matières
Première partie: Rappels bibliographiques
Chapitre1: Généralité sur le vaisseau
I. Définition des vaisseaux
II. Structure de la paroi des vaisseaux sanguins
II.1. Intima
II.2. Média
II.3. Adventice
III. Vascularisation et innervation
III.1. Le Vasa vasorum
III.2. Innervation
IV. Organisation fonctionnelle de la paroi vasculaire
IV.1. L’Endothélium
IV.1.1. Les facteurs vasorelaxants
IV.1.1.1. Le Monoxyde d’Azote (NO)
IV.1.1.2. Les prostacyclines
IV.1.1.3. Les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium : EDHF
IV.1.2. Les facteurs vasoconstricteurs
IV.1.2.1. Endothélines
IV.1.2.2. Thromboxane A2
IV.1.2.3. Les Leucotrienes
IV.2.Le muscle lisse vasculaire
IV.2.1. Mécanisme de vasomotricité de la Cellule musculaire lisse vasculaire
IV.2.2. Régulaton de la vasomotricité de la CMLV
IV.2.2.1. Régulation par le système nerveux sympathique
IV.2.2.2. Régulation par le système parasympathique
IV.3. Dysfonctionnement endothélial
IV.3.1. Définition
IV.3.2. Causes
IV.3.3. Conséquences
Chapitre 2 : Physiopathologie de l’hypertension arterielle
I. Définition
II. Hémodynamie de la pression artérielle
III. Variétés et Causes
III.1. Variétés
III.2. Causes de l’hypertension artérielle
III.2.1. Hypertension artérielle essentielle
III.2.2. Hypertension artérielle secondaire
III.2.2.1. Rénale
III.2.2.2. Endocrine
III.2.2.3. Mécanique
III.2.2.4. Autres causes
IV. Facteurs favorisants
Chapitre 3 : Rappels bibliographiques sur terminalia avicennioides
I. Taxonomie de Terminalia avicennioides
II. Origine et répartition géographique
III. Description
IV. Usages
V. Propriétés chimiques
VI. Propriétés pharmacologiques
VII. Données toxicologiques
Deuxième partie: Travail expérimental
Chapitre 1 : Méthodologie générale
I. Objectif et cadre de d’étude
I.1. Situation géographique
I.2. Le personnel du laboratoire
II. Matériels
II.1. Le matériel de laboratoire
II.1.1. Petit matériel
II.1.2. Appareils du laboratoire
II.1.3. Solutions, solvants et réactifs utilisés
II.2. Les animaux
II.3. Le matériel végétal
III. Méthodes
III.1. Préparation de l’extrait brut d’écorces de Terminalia avicennioides
III.2.Préparation de la solution physiologique de Krebs
III.2.1. Préparation de la solution mère de Krebs
III.2.2. Préparation de la solution fille de Krebs
III.3. Mise en route du système à organes isolés
III.4. Préparation des vaisseaux
III.5. Outils pharmacologiques utilisés
III.6. Tests de réactivité vasculaire
III.6.1.Test de sensibilisation
III.6.2.Test fonctionnel
III.7. Caractérisation des effets vasoactifs de TAE
III.7.1. Préparation de la gamme de concentration de TAE
III.7.2. Recherche de propriétés vasoactives de TAE
III.7.3. Recherche des mécanismes impliqués dans les effets vasoactifs de TAE 79
III.8. Analyses statistiques
Chapitre 2 : Résultats
I. Rôle de l’endothélium dans les effets vasculaires
II. Incubation avec des inhibiteurs des facteurs endotheliaux vasorelaxants
III. Rôle de la prostacycline dans les effets vasorelaxants de TAE.
IV. Rôle des EDHF dans les effets vasorelaxant de TAE
V. Implication de la voie des PI3-kinase/ AKT dans les effets vasculaires de TAE.
VI. Rôle du stress oxydatif dans les effets vasculaires de TAE
VII. Implication de la voie Src-kinase dans les effets vasculaires de TAE
Chapitre 3: Discussion
Conclusion
Références bibliographiques
Webographie
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