Soutenance mémoire
Pharmacocinétique des enzymes chez le chien
Pharmacocinétique des enzymes
Cette deuxième partie a pour but de montrer l’intérêt de la détermination des paramètres cinétiques des enzymes hépatiques, en particulier de la clairance plasmatique, lors de l’analyse d’une mesure d’activité enzymatique plasmatique. L’argumentation s’appuie principalement sur les travaux d’Hervé Lefebvre relatifs à la créatine kinase chez la vache [Lefebvre, 1996 ; Lefebvre, 1994].
Déterminants de la concentration plasmatique d’un analyte
Une mesure d’activité enzymatique plasmatique à un instant donné, ou plus généralement la concentration plasmatique d’un analyte, est souvent interprétée comme étant le reflet de la quantité d’analyte libéré par l’organe qui le produit.Cette analyse est approximative car la concentration plasmatique d’un analyte dépend de 3 facteurs, schématisés sur la figure 1 [Lefebvre, 1996] : – son entrée dans le plasma ; – son élimination du plasma, c’est-à-dire sa clairance ; – sa distribution dans l’organisme (quelles proportions de l’enzyme libérée se retrouvent dans le plasma) : son volume de distribution.L’approximation concentration dans le plasma = quantité d’analyte libéré par l’organe peut donc être source d’erreurs si l’augmentation de la concentration de l’analyte est due à un facteur de variation autre que la production de l’analyte : diminution de sa clairance plasmatique, par exemple lors d’insuffisance rénale pour un analyte éliminé par le rein, la lipase pancréatique par exemple [Ettinger, 2005]. Une importante déshydratation peut de la même manière entraîner une élévation de la concentration plasmatique si l’analyte a un volume de distribution élevé (et est donc présent en quantité relativement importante dans le secteur extravasculaire).Il est intéressant de noter que la variation du taux de production d’un analyte peut être le facteur d’erreur quand on évalue indirectement une fonction de clairance à partir d’une concentration plasmatique ponctuelle. Par exemple, la mesure de la créatinine plasmatique peut être élevée sans que la fonction rénale soit affectée en cas de rhabdomyolyse : l’évaluation de la fonction rénale est alors erronée [Kaneko, 1997]. Inversement, une diminution de la production endogène de la créatinine peut masquer une diminution du taux de filtration glomérulaire .
Intérêts de la connaissance de la cinétique des enzymes hépatiques
Intérêts de la connaissance de la clairance pour l’utilisation des marqueurs hépatiques
La connaissance de la clairance plasmatique des enzymes permet de mieux les utiliser comme outils diagnostiques. Par exemple, pour détecter avec une grande sensibilité une lésion hépatique en début d’évolution, il est intéressant de choisir un marqueur à clairance plasmatique faible. En effet, si on choisit un marqueur à clairance élevée, il risque d’avoir déjà été éliminé du plasma et cela peut conduire à des faux-négatifs .Inversement, pour estimer le débit instantané de l’entrée d’un marqueur dans le plasma dans le but de qualifier la progression d’une lésion hépatique aiguë, il peut être intéressant de choisir un marqueur à clairance plasmatique élevée [Toutain, 2000]. La concentration plasmatique du marqueur reflète alors directement la quantité de marqueur entré dans le plasma après libération par le foie, comme c’est le cas pour la myoglobine, rapidement éliminée par le rein, lors d’infarcti expérimentaux du myocarde chez le chien .La clairance plasmatique des enzymes permet également de déterminer les intervalles entre les analyses à prévoir lorsqu’on désire réaliser un suivi pour appréhender la guérison d’une lésion hépatique. Par exemple, le temps de demi-vie sérique de l’ALAT à l’équilibre est estimé à 2,5 jours chez le chien : dans le cas d’une lésion aiguë, on considère qu’une diminution de 50 % de l’activité sérique de l’ALAT en 2 à 3 jours indique une lésion en train de guérir [Ettinger, 2005].
Intérêts de la connaissance du volume de distribution
Connaître le volume de distribution d’un analyte permet de savoir si sa concentration plasmatique est affectée en cas de déshydratation : un analyte ayant un faible volume de distribution diffuse de manière limitée dans l’espace extracellulaire, et sa concentration plasmatique est donc peu modifiée lors de déshydratation.
Intérêts de la connaissance de la biodisponibilité
La connaissance de la biodisponibilité des enzymes hépatiques permet de savoir quelle proportion d’enzymes atteint le secteur vasculaire après sa libération suite à une cytolyse hépatique.
Évaluation de la quantité d’enzymes libérées par l’organe
La connaissance de la clairance et de la biodisponibilité des enzymes permet de connaître la quantité d’enzymes effectivement libérées dans le plasma par l’organe source à partir de mesures d’activités enzymatiques au cours du temps. C’est le principe utilisé par Lefebvre, Ferré, Chanoit et Barros dans leurs études de la CK musculaire respectivement chez la vache, chez le mouton et chez le chien et de la glutathion-S-transférase chez le mouton [Lefebvre, 1996 ; Ferré, 2001 ; Chanoit, 2001 ; Barros, 1996].
Évaluation de la masse lésionnelle à partir du profil plasmatique enzymatique
Le principe est exactement le même que pour l’évaluation d’une lésion musculaire par des mesures d’activités plasmatiques de CK [Lefebvre, 1996 ; Lefebvre, 1994 ; Ferré, 2001 ; Chanoit, 2001] : si on connaît la clairance et la concentration du foie en enzymes hépatiques, l’intensité de la lésion peut être évaluée à partir de l’aire sous la courbe d’activité enzymatique en fonction du temps par la une relation présentée dans la troisième partie, en présumant que la biodisponibilité des enzymes hépatiques est de 100 %. Chez le mouton, il est possible d’évaluer de manière fiable la quantité de muscle détruit après une lésion iatrogène en appliquant cette relation avec la créatine kinase .Cette application, bien que peu utilisable et d’intérêt limité en clinique, est surtout réservée aux études pharmacologiques lors des tests précédant la mise sur le marché d’un médicament suspect de toxicité hépatique, ou pour comparer plusieurs formulations.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Transaminases (ALAT et ASAT) |
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Table des matières
TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS
INTRODUCTION
PREMIÈRE PARTIE : Synthèse Bibliographique
I. Choix des enzymes étudiées et données disponibles
1. Présentation des enzymes étudiées
i. Transaminases (ALAT et ASAT)
ii. Lactate déshydrogénase (LDH)
iii. Glutamate déshydrogénase (GLDH)
2. Métabolisme des enzymes étudiées
i. Synthèse
ii. Élimination – Trajet avant de rejoindre le secteur vasculaire – Perte d’activité catalytique – Élimination
3. Fonctions des enzymes étudiées
i. Transaminases (ALAT et ASAT)
ii. Lactate déshydrogénase (LDH)
iii. Glutamate déshydrogénase (GLDH)
4. Distributions tissulaires
i. ALAT et GLDH : deux enzymes spécifiques du foie
ii. ASAT et LDH : des enzymes plus ubiquitaires – ASAT – LDH
5. Répartitions cellulaires dans le foie
6. Activités sériques et plasmatiques usuelles et facteurs de variation
i. Activités sériques et plasmatiques usuelles
ii. Influence de l’âge
iii. Influence du sexe
iv. Existence de rythmes circadiens chez l’homme
7. Utilité en biochimie clinique
i. Principe de l’utilisation des enzymes en biochimie clinique : test de l’intégrité cellulaire
ii. ALAT et GLDH : marqueurs de cytolyse hépatique
iii. ASAT iv. LDH
II. Pharmacocinétique des enzymes
1. Déterminants de la concentration plasmatique d’un analyte
2. Intérêts de la connaissance de la cinétique des enzymes hépatiques
i. Intérêts de la connaissance de la clairance pour l’utilisation des marqueurs hépatiques
ii. Intérêts de la connaissance du volume de distribution
iii. Intérêts de la connaissance de la biodisponibilité
iv. Évaluation de la quantité d’enzymes libérées par l’organe
v. Évaluation de la masse lésionnelle à partir du profil plasmatique enzymatique
vi. Différence temps de demi-vie / clairance plasmatique
III. Données pharmacocinétiques disponibles sur les enzymes étudiées
1. Temps de demi-vie
2. Distribution extravasculaire de l’ASAT et de la GLDH
3. Courbes de décroissance d’activités enzymatiques après injection intraveineuse d’enzymes
4. Courbes de décroissance d’activités enzymatiques après induction de lésions hépatiques
DEUXIÈME PARTIE : Objectifs de l’étude
TROISIÈME PARTIE : Étude expérimentale
I. Matériel et méthode
1. Animaux
i. Description des animaux
ii. Conditions de vie
iii. État de santé
2. Préparation de la solution enzymatique injectée
i. Origine du foie utilisé
ii. Obtention de la solution
iii. Dosage des activités enzymatiques du surnageant
3. Injection de la solution enzymatique
4. Prélèvements
i. Réalisation des prélèvements
ii. Traitement des échantillons
iii. Mesure des activités enzymatiques des échantillons
iv. Vérification de la stabilité nycthémérale v. Séquence des prélèvements pour la détermination des caractéristiques pharmacocinétiques des enzymes
5. Méthode d’analyse pharmacocinétique
i. Calcul de l’aire sous la courbe
ii. Clairance plasmatique
iii. Temps moyen de résidence
iv. Volume de distribution v. Temps de demi-vie plasmatique
vi. Évaluation de la quantité d’enzymes libérées par le foie
vii. Évaluation de la masse lésionnelle à partir du profil plasmatique enzymatique
6. Méthode d’analyse statistique
II. Résultats
1. Stabilité nycthémérale
i. Activité plasmatique de l’ALAT sur 24 heures
ii. Activité plasmatique de l’ASAT sur 24 heures
iii. Activité plasmatique de la LDH sur 24 heures
iv. Activité plasmatique de la GLDH sur 24 heures
2. Activités enzymatiques dans le foie et le surnageant
i. Activités enzymatiques dans le foie utilisé pour obtenir la solution enzymatique
ii. Activités enzymatiques dans la solution injectée
3. Profil plasmatique de l’ALAT
4. Profil plasmatique de l’ASAT
5. Profil plasmatique de la GLDH
6. Profil plasmatique de la LDH
7. Comparatif
III. Analyse des résultats : calcul des paramètres pharmacocinétiques
1. Stabilité nycthémérale
2. Paramètres pharmacocinétiques de l’ALAT
3. Paramètres pharmacocinétiques de l’ASAT
4. Paramètres pharmacocinétiques de la GLDH
5. Paramètres pharmacocinétiques de la LDH
6. Synthèse
IV. Discussion
1. Stabilité nycthémérale
2. Protocole expérimental
i. Nature de la solution injectée
ii. Nature des échantillons
iii. Critiques du protocole expérimental – Cas de la phosphatase alcaline – Inactivation in vitro – Délai avant congélation – Linéarité de la cinétique plasmatique des enzymes – Répétabilité de la cinétique plasmatique des enzymes
3. Comparaison des résultats avec les études précédemment publiées
i. Activités basales
ii. Temps de demi-vie
iii. Volumes de distribution
iv. Clairance plasmatique
4. Conséquences et applications permises par la connaissance des paramètres pharmacocinétiques
i. Conséquences pour l’interprétation des mesures d’activité plasmatique en hépatologie clinique – Volume de distribution à l’équilibre : effet de la déshydratation – Clairance plasmatique et temps de demi-vie : utilisation des enzymes en pratique quotidienne – Clairance plasmatique : influence du débit cardiaque
ii. Applications destinées à la recherche en hépatologie : calcul de la masse de foie lésé
5. Clairance et mécanismes d’élimination
CONCLUSION
ANNEXES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
TABLE DES ILLUSTRATIONS
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