Soutenance mémoire
Analyses de la ségrégation d’une population en utilisant les marqueurs moléculaires
Préparation du Gel d’agarose et dépôt des échantillons :
3,6g d’agarose est ajouté à un volume de 300ml du tampon TBE5x gel à 1,2 % (la proportion d’agarose dépend de la taille des molécules d’ADN à séparer). Le mélange est porté à ébullition dans un micro-ondes en surveillant pour éviter les projections et en agitant de temps à autre pour homogénéiser le mélange. Puis refroidi jusqu’à une température de 65°C et versé dans un moule, après solidification du gel, le moule est déposé dans l’appareil remplie de TBE1x. puis le peigne et les joints sont enlevés, le gel est prêt pour le dépôt des échantillons.
Ensuite, les puits sont remplis de solution composée de 3µl d’ADN plus 3µl de bleu d’agarose et 4µl d’eau distillée, en faisant attention de ne pas déchirer le fond du gel avec la pointe de la pipette (le 1erpuits est réservé au marqueur de taille lambda). Le support avec le gel chargé étant placé dans la cuve d’électrophorèse en veillant que les puits soient du côté de la cathode.
Après migration, le gel est immergé pendant 20 min dans du BET puis rincé avec l’eau distillée pendant 10min, les résultats sont visualisés par rayonnement UV.
Technique de la PCR
La PCR (polymérase chaine réaction) est une technique d’amplification d’ADN in vitro. Elle permet d’obtenir un très grand nombre de copie d’une séquence d’ADN choisie par une succession de réaction de réplication d’une matrice double brin d’ADN.
Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes : une dénaturation de l’ADN par chauffage pour séparer les deux brins qui le composent, une hybridation des amorces aux extrémités de la séquence recherche, puis une élongation grâce à une ADNpolymérase. Ce cycle est répété un grand nombre de fois pour obtenir une amplification exceptionnelle de séquence de l’ADN cible.
➢ Les étapes de la technique
Afin de réaliser une PCR il faut commencer tout d’abord de déposer 2µl d’ADN dans une plaque de PCR, puis la préparation d’une solution appelée Master Mix dans un tube de 1,5ml qui contient de l’eau ultra pure, bufferx5 (tampon PCR), dNTP, amorce et taqpolymérase. Après une centrifugation de 10s,8µl de la solution Master mix est ajoutée à l’ADN mise en plaque pour avoir un volume total de 10µl (il faut bien mixer le mélange). Après avoir réglé la machine de PCR sur le système convenable il est temps de mettre la plaque PCR.
Électrophorèse sur gel d’acrylamide
L’électrophorèse nous aide à révéler les bandes d’ADN et de savoir si la PCR a eu lieu ou non. Le gel est composé de poudre d’acrylamide et de bis acrylamide en plus de TEMED et d’APS 20%. ➢ Préparation de gel d’acrylamide 8% et dépôt des échantillons :
Dans une burette de 100ml, un volume de 20ml d’acrylamide 40% est mélangé avec 20ml de TBE 5x et complété avec de l’eau distillée jusqu’à 100ml. Chaque volume de 30ml est mélangé avec 15µl de TEMED et 75µl d’APS 20% afin de polymériser et solidifier le gel.
Avant de commence à déposer, 5µl du bleu d’acrylamide est ajouté au produit amplifié par PCR, puis déposé 7µl dans chaque puits de gel sauf les trois premiers qui sont réservé au marqueur de taille de 100pb et les deux parents Alanda01 AA, Zambaka BB. Ensuite le voltage est réglé sur 260V, pendant 1h30 environ. Après migration, le gel est récupéré et mis en contact avec le BET pour avoir une coloration dans le but de visualiser les bandes d’ADN après exposition aux UV. 6) Test khi deux : Le test du X2 (prononcez khi deux ou khi carré) est un test d’hypothèse qui compare la loi de distribution observée de vos données à une loi attendue.
C’est le calcul de Q = ⅀(??−??)? ??
La statistique Q donne une mesure de l’écart existant entre les effectifs théoriques attendus et ceux observés dans l’échantillon. En effet, plus Q sera grand, plus le désaccord sera important. La coïncidence sera parfaite si Q=0.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie MOT CLé 1 |
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Table des matières
LISTES DE TABLEAUX
LISTES DE FIGURES
LISTES DES ABREVIATIONS
I. Introduction
II. Revue Bibliographique
1) Systématique de l’orge
2) Historique
3) Variétés de l’orge
4) Description générale de l’orge
5) Intérêt économique de l’orge : mondial et national
6) Interaction biotypes des maladies cryptogamiques attaquant l’orge
7) Orge et santé
8) Obtention des haploides doubles et la distorsion génétique
III. Analyses de la ségrégation d’une population en utilisant les marqueurs moléculaires
1) Définition d’un marqueur moléculaire
2) Caractéristique des marqueurs moléculaires
3) Marqueur utilisé pour l’analyse de la ségrégation de l’orge
IV. Matériel et méthodes
1) Matériel végétal : (récolte, lyophilisateur,)
2) Extraction d’ADN à partir des feuilles lyophilisées
3) Test de qualité d’ADN
4) Technique de la PCR
5) Électrophorèse sur gel d’acrylamide
V. Résultats et discussion
1) Test qualité
2) Amplification d’ADN par PCR
CONCLUSION
REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUE
ANNEXES
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