Soutenance mémoire
Perturbation des paramètres sanguins
Propriétés du RHDV Le virus a été purifié et caractérisé à partir de foies de lapins morts de la VHD.
Morphologie
L’observation en microscopie électronique révèle que les virions sont approximativement sphériques, de petite taille (32-35 nm de diamètre), dépourvus d’enveloppe et de symétrie icosaédrique (voir illustration 1). Plus précisément, la capside est un icosaèdre formé de 180 molécules de la protéine structurale majeure organisées en 90 dimères (Fauquet et al, 2005). La surface des virions purifiés montre des dépressions en forme de calice régulièrement arrangées (Ohlinger et al, 1990), (Parra and Prieto, 1990), on en retrouve 32 sur les axes 3 et 5 (Fauquet et al, 2005). Sur un échantillon, la majorité des particules mesure 32-35 nm de diamètre, on peut voir un noyau dense de 23-25 nm de diamètre à partir duquel radient 10 projections périphériques courtes régulièrement distribuées. Des particules lisses (s-RHDV, pour smooth) sont également reconnaissables (en particulier lors de formes subaiguës ou chroniques de VHD). Elles correspondent à des formes virales dégradées qui ont perdu leurs portions externes ; elles sont plus petites et de forme hexagonale (Lavazza and Capucci, 2004).
b. Organisation génomique
Les virions de RHDV isolés de foies de lapins contaminés puis purifiés contiennent 2 types d’ARN : un de 7,5 kb correspondant à l’ARN génomique et un de 2,2 kb correspondant
100 nm à l’ARN subgénomique, présent en majorité (Ohlinger et al, 1990), (Meyers et al, 1991), (Meyers et al, 1991b), (Clarke and Lambden, 1997)
La totalité du génome d’une souche allemande a été séquencée (Meyers et al, 1991b) et comparée à plusieurs autres souches provenant de différents pays et ayant atteint des lapins sauvages ou domestiques. Il apparaît que l’ensemble des souches présente un haut degré de conservation, les séquences nucléotidiques sont homologues à 96%, ce qui correspond à 98% d’identité au niveau de la séquence en acides aminés. Il n’a pas été identifié de régions hypervariables, que ce soit dans les protéines structurales ou non structurales (Rasschaert et al, 1995)
L’ARN génomique est composé de 7437 nucléotides et contient 2 ORF, ce qui le distingue, ainsi que l’EBHSV, des autres calicivirus, qui en contiennent 3. En effet, l’ORF codant pour les protéines non structurales est fusionnée à celle de la capside créant ainsi une séquence codante pour une polyprotéine géante qui occupe 94% du génome viral. L’ORF 1 s’étend du nucléotide 10 au 7044 et code pour une polyprotéine de 2344 acides aminés (257 kDa). L’ORF 2 débute au nucléotide 7025, elle chevauche l’extrémité 3’ de l’ORF 1 sur 17 nucléotides et code pour une protéine de 117 acides aminés (12kDa) (Meyers et al, 1991b), (Clarke and Lambden, 1997).
L’ARN subgénomique code pour la majorité des protéines de capside. Son extrémité 5’ correspond à la position 5296 de la séquence génomique ; à l’exception de 2 différences, les 16 premiers nucléotides sont identiques. La séquence nucléotidique de l’extrémité 3’ est quant à elle identique à celle de l’ARN génomique (Meyers et al, 1991).
Les 2 ARN sont de polarité positive, polyadénylés en 3’ et liés de manière covalente à une petite protéine : la VPg (10-15 kDa). En ce qui concerne l’ARN génomique, cette interaction a lieu avant le 179ème nucléotide (Meyers et al, 1991). Ils contiennent tous deux des séquences répétitives à l’extrémité 5’ qui auraient un rôle dans l’encapsidation, la réplication ou la transcription.
Protéines
Grâce à des anticorps spécifiques, deux protéines structurales ont été identifiées : une protéine de capside majeure d’un poids moléculaire de 60 kDa, la VP60 ainsi qu’une de taille inférieure à 10 kDa qui correspond à un composant mineur des virions (Ohlinger et al, 1990), (Parra and Prieto, 1990), (Wirblich et al, 1996). Cette petite protéine, nommée VP10 est codée par l’ORF2 de l’ARN subgénomique (Clarke and Lambden, 1997).
L’ORF 1 du RHDV code pour une polyprotéine au sein de laquelle ont été identifiées 7 protéines non structurales ainsi que la protéine de capside. L’ordre des gènes de l’ORF1 est le suivant (voir figure 2) : NH2-p16-p23-hélicase-p30-VPg-protéase-polymérase-capsideCOOH (Wirblich et al, 1996), (Clarke and Lambden, 1997). La maturation de cette polyprotéine se déroule selon une cascade enzymatique autocatalytique impliquant la protéase 3C-like. Il s’agit d’une protéase trypsine-like à cystéine dont la triade catalytique est définie par l’His-1135, Asp-1152 et la Cys-1212 qui représente le site nucléophile (Boniotti et al, 1994), (Martin Alonso et al, 1996), (Joubert et al, 2000).
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Généralités sur les Caliciviridae |
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE DE LA VHD
I. Généralités sur la VHD
1. Historique et répartition géographique
2. Synonymie
II. Virologie
1. Généralités sur les Caliciviridae
2. Propriétés du virus
a. Morphologie
b. Organisation génomique
c. Protéines
d. Propriétés physico-chimiques
e. Propriétés hémagglutinantes
3. Caractères culturaux
4. Pouvoir antigénique et immunogène
5. Comparaison avec l’EBHSV
III. Tableau clinique
1. Symptômes
2. Perturbation des paramètres sanguins
a. Modifications biochimiques
b. Modifications hématologiques
3. Lésions
a. Macroscopiques
b. Microscopiques
IV. Pathogénie
1. Voie d’entrée et dissémination du virus
2. Cellules cibles
3. Pathogénie de la nécrose hépatique et la CIVD
4. Survenue de la mort
V. Epidémiologie
1. Population atteinte
a. Espèce cible
b. Réceptivité – sensibilité
2. Répartition et évolution dans le temps et dans l’espace
3. Sources virales
4. Transmission
VI. Diagnostic
1. Diagnostic de terrain
2. Diagnostic de laboratoire
a. Mise en évidence de l’agent
b. Analyses sérologiques
VI. Lutte contre la maladie
1. Prophylaxie sanitaire
a. Prophylaxie sanitaire défensive
b. Prophylaxie sanitaire offensive
2. Prophylaxie médicale
a. Nature et obtention du vaccin
b. Utilisation du vaccin
DEUXIEME PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE DES CALICIVIRUS APPARENTES AU RHDV
I. Preuves de l’existence de tels virus
II. Caractéristiques des calicivirus apparentés au RHDV
1. Pouvoir pathogène
2. Propriétés antigéniques
3. Propriétés immunogènes
4. Séquences nucléotidiques et protidiques
5. Organisation génomique
III. Epidémiologie des calicivirus apparentés aux RHDV
IV. Origine probable du RHDV
TROISIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. Matériels et méthodes
1. Réalisation des prélèvements qui seront analysés en laboratoire
a. Réalisation des prélèvements sanguins
b. Réalisation des prélèvements d’organes
2. Etudes sérologiques par ELISA
a. Principe de l’ELISA
b. Réalisation pratique
3. Recherche du virus par RT-PCR
a. Extraction d’ARN
b. Réalisation de la RT
c. Réalisation des PCR nichées et semi-nichées
4. Séquençage du gène de la VP60
a. Obtention des amplicons
b. Séquençage des amplicons
c. Analyse des séquences
II. Résultats
1. Résultats sérologiques
2. Résultat de la recherche de virus
a. Résultats de la recherche de virus sur les organes
b. Résultats de la recherche de virus dans le sérum
3. Résultats de séquençage des amplicons
a. Séquences
b. Analyse des séquences
III. Discussion
CONCLUSION
TABLE DES ILLUSTRATIONS
TABLE DES ABREVIATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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