Soutenance mémoire
EPIDEMIOLOGIE DU PALUDISME
La transmission palustre est active dans les six régions de l’OMS définies à travers le monde. Environ, 3,2 milliards de personnes sont susceptibles d’être infectées par le parasite et selon les dernières estimations de l’OMS, 198 millions de cas cliniques ont été enregistrés en 2013 avec 584 000 décès. On constate une diminution de 47% de la mortalité au niveau mondial par rapport à 2000 et de 54% dans la Région africaine de l’OMS pendant la même période. En Afrique, La majorité des décès survient chez des enfants, chez qui le taux de mortalité a diminué de 58% par rapport à 2000 (3), (figure 1). Au Sénégal, la mise en place du Programme Nationale de Lutte contre le Paludisme (PNLP) en 1995 a permis une meilleure définition des politiques et stratégies de lutte contre la maladie ainsi qu’une coordination des activités sur l’étendue du territoire. Ces stratégies reposent sur la lutte anti-vectorielle avec l’utilisation des insecticides à travers la pulvérisations intra-domiciliaires mais aussi sur l’utilisation des moustiquaires imprégnées, la chimio-prophylaxie et sur l’utilisation de tests de diagnostic rapide depuis 2008 (8). La combinaison de toutes ces méthodes de lutte est à l’origine d’une baisse significative des taux de morbidité et de mortalité entre 2006 et fin 2009, passant de 33,57% à 3,1% pour la morbidité proportionnelle et de 18,17% à 4,4% pour la mortalité proportionnelle. Néanmoins, la maladie reste encore un problème de santé dans le pays. D’autant plus que la mortalité est passée de 5% en 2010 à 7% en 2013 (9). Cette maladie est devenue endémique avec un pic de transmission pendant l’hivernage. En moyenne, elle serait responsable d’environ 35% des motifs de consultation (8). Le niveau de transmission augmente en passant du Nord au Sud du pays. La transmission est hypo ou méso-endémique au Nord et au Centre, elle est hyper ou holoendémique au Sud du pays ; où 30 à 35% de l’ensemble de la pathologie fébrile est due au paludisme. Ce taux peut passer de 80% en saison des pluies, à 10% en saison sèche. Au Nord et au Centre du pays, la maladie revêt un caractère instable. On y observe des épisodes épidémiques au cours des années de forte pluviométrie (10). Sur l’étendue du pays, P. falciparum représente près de 90% des espèces plasmodiales selon le PNLP (8).
Cycle de développement du Plasmodium
Les Plasmodium pouvant infecter l’homme ont le même cycle en terme de stades. Cependant, certaines caractéristiques du cycle biologique sont différentes selon les espèces. Le cycle biologique du parasite est composé de deux phases :
– Une phase asexuée ou schizogonie ayant lieu chez l’homme.
– Une phase sexuée ou sporogonie qui se déroule chez le moustique ;
Cycle asexué chez l’homme Il se déroule en deux étapes : on a une phase tissulaire ou exo-érythrocytaire et une phase sanguine intra-érythrocytaire.
La phase tissulaire ou cycle exo-érythrocytaire : Au cours d’un repas sanguin les anophèles femelles infestés inoculent à l’homme des sporozoïtes dans un capillaire sanguin (14). Ces formes parasitaires restent environ une demi-heure dans la peau, la lymphe et le sang avant de gagner le foie. Au cours de leur migration vers le foie, beaucoup par eux sont détruits par les macrophages. Dans les hépatocytes, les sporozoïtes se multiplient et évoluent en schizontes pré-érythrocytaires ou « corps bleus » (formes multinucléées) pendant 1 à 2 semaines. Arrivés à maturité, ces schizontes éclatent et libèrent dans le sang des milliers de mérozoïtes qui amorceront la phase érythrocytaire (Figure 2). Cette schizogonie hépatique est unique dans le cycle car les hépatocytes ne peuvent être infectés que par des sporozoïtes (15, 16). L’invasion des hépatocytes se fait soit à travers la membrane plasmique, soit par la formation d’une vacuole essentielle à sa différenciation. Au cours de la phase hépatique, certains parasites restent quiescents dans les hépatocytes, sans se transformer en corps bleu donnant ainsi naissance à des hypnozoïtes responsables des accès de reviviscence tardifs des infections à P. vivax et P. ovale (15, 17). Le P. falciparum et le P. malariae ne possèdent pas de formes de persistance hépatique (hypnozoïtes). La phase de multiplication hépatique est asymptomatique et dure 8 à 15 jours selon les espèces (18).
Phase sanguine ou intra érythrocytaire : Elle est initiée par l’invasion des hématies saines par les mérozoïtes provenant de la rupture des schizontes hépatiques. L’invasion des hématies se fait par un processus parasitaire actif (Figure 2). Au sein de la vacuole parasitophore, le parasite se différencie en trophozoïte jeune, puis en trophozoïte âgé, stade à partir duquel commence une intense phase réplicative de l’ADN. Il donne alors naissance au schizonte érythrocytaire, qui après segmentation montre une forme caractéristique de rosace, pouvant libérer des mérozoïtes qui rapidement réinfectent de nouvelles hématies saines (19, 20). Chaque cycle schizogonique (ou endo érythrocytaire) dure 48 heures (fièvre tierce) pour P. falciparum, P. vivax et P. ovale ou 72 heures (fièvre quarte) pour P. malariae. Seule cette phase sanguine est responsable des manifestations cliniques observées au cours du paludisme. Après plusieurs schizogonies, un petit pourcentage de mérozoïtes ne se multiplient pas après invasion des érythrocytes, mais plutôt, se différencient dans les hématies parasitées en formes sexuées (gamétocytes). Ces gamétocytes (mâles et femelles) ne peuvent poursuivre leur développement que s’ils sont ingérés au cours d’un repas sanguin par un anophèle femelle (15, 20).
L’anémie palustre sévère (SMA)
Elle a été fréquemment décrite chez les enfants (Figure 6) et les femmes enceintes (41). Sa pathogénie est multifactorielle et implique: l’augmentation de la destruction des érythrocytes (infectés et non infectés), l’érythropoïèse supprimée, et la dysérythropoïèse (42, 43). Le rôle des différents médiateurs produits par les monocytes/macrophages dans la pathogenèse de SMA a été récemment revu (43). Parmi ceux-ci, le TNF-α et l’oxyde nitrique qui sont associés à la suppression de l’érythropoïèse dans la moelle osseuse (39).
La réponse cellulaire
Pour les lymphocytes T CD4, on a plusieurs sous populations les Th1 qui vont produire des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IFN-γ et l’IL-2 favorisant l’induction de réponses des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques ou CTL qui vont inhiber le développement des parasites au stade hépatique (82, 83). Ces CTL jouent un rôle important dans la protection au cours du stade pré-érythrocytaire grâce au développement et le maintien de la réponse des cellules mémoires T CD8+. C’est ce qui fait que de nombreuses stratégies vaccinales sont basées sur ces lymphocytes TCD8 (84). Il a été démontré que les hépatocytes infectés et exprimant le CMH-I sont détruits par les CTL (85). De plus l’IFN-γ sécrété soit par ces lymphocytes TCD8+ ou soit par les lymphocytes TCD4+ de type Th1 inhiberait le développement de parasites intra-hépatiques et induirait la production de NO par les hépatocytes infectés (86). Dans le modèle du paludisme murin, ces lymphocytes T CD8+ seraient impliqués dans la pathogenèse des formes cérébrales (87). Tandis que les lymphocytes Th2 vont produire des cytokines anti-inflammatoires comme IL-4 et IL-13 ou encore IL-7, IL-15 et favoriser ainsi l’activation des lymphocytes B.
HYPOTHESE ET STRATEGIE DE L’ETUDE
Le paradoxe du paludisme est qu’il reste un fléau sanitaire planétaire alors qu’il est l’une des pathologies infectieuses les plus simples à la fois à prévenir, à diagnostiquer et à traiter en phase non compliquée bien qu’il n’existe pas encore de vaccin. Malgré un arsenal thérapeutique efficace, il est difficile de réduire en dessous de 15 à 20% la létalité moyenne des accès graves et leur prise en charge reste encore difficile en milieu hospitalier. Ces accès sévères particulièrement le neuropaludisme résulteraient d’une cascade complexe d’événements incluant probablement un défaut quantitatif et/ou qualitatif des réponses en Ac protecteurs surtout dirigées contre les stades sanguins du parasite mais aussi une exagération de la réponse immunitaire notamment les effets immunopathologiques. En effet, dans le cas du paludisme cérébral l’hypothèse de la séquestration des formes parasitaires matures a été largement développée antérieurement et les effets immuno-pathologiques en résultant seraient entre autres l’inflammation, l’hypoxie cérébrale qui conduisent au coma. Dans des études expérimentales basées sur le modèle P berghei l’implication de la galectine 3 comme marqueur inflammatoire et des cytokines telles que le TNF-α, l’IL-1, l’IL-6 et l’IL-10 a été explorée (123). Ces substances seraient libérées par les cellules immunocompétentes comme les monocytes macrophages, les polynucléaires neutrophiles et les cellules NK. Ces données à l’image de nos travaux antérieurs relatifs à la procalcitonine (124) ayant permis de rechercher des biomarqueurs, nous avons proposé dans le cadre d’une approche analytique du paludisme hospitalier de comparer les taux et les profils évolutifs des cytokines impliquées dans la réaction inflammatoire (pro ou anti inflammatoires) ainsi que ceux de la galectine-3 qui serait impliquée dans la pathogénie du paludisme cérébral chez l’homme. Une des questions de base est : «dans le cadre du paludisme hospitalier confirmé est ce que la sévérité ou même la létalité peut être rapprochée à une hyper ou hypo production des cytokines testées ou de la galectine-3 au niveau sérique ? » Cette analyse est basée sur l’hypothèse que le recrutement de malades hospitalisés, malgré son hétérogénéité individuelle, est bien cadré et que tous les individus ont les mêmes chances de se rétablir du fait d’un suivi médico-clinique dans un service de réanimation de haute qualité. Une issue fatale peut-être considérée comme liée au malade et donc à son état immuno-parasitologique à l’entrée car tout a été mis en œuvre pour permettre un rétablissement du patient.
Addition du substrat (TMB)
Après incubation, effectuer trois séries de lavage ;
Reconstituer la solution streptavodine-HRP qui est diluée à 1/400 avec la solution d’essai et mettre 100l de cette solution préparée dans tous les puits et les recouvrir avec un couvre plaque et incuber à la température ambiante pendant 1heure sur un agitateur rotateur réglé à 200tr/min ;
Faire une série de trois lavages ensuite, distribuer 100l de solution de substrat TMB dans chaque puits, incuber pendant 10 minutes à la température ambiante en évitant tout exposition directe à une source de lumière ;
Arrêter la réaction en ajoutant 50ul de solution d’acide phosphorique 1M (figure 9).
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Table des matières
INTRODUCTION
1 ere partie: REVUE DE LA LITTERATURE
I. DEFINITION ET HISTORIQUE DU PALUDISME
I.1. Définition
I.2. Historique
II. EPIDEMIOLOGIE DU PALUDISME
III. BIOLOGIE DU PARASITE
III.1. Agent pathogène
III.2. Le vecteur
III.3. Cycle de développement du Plasmodium
III.3.1. Cycle asexué chez l’homme
III.3.2. Cycle sexué chez le moustique
IV. PATHOLOGIE DE L’INFECTION PALUSTRE
IV.1. L’accès palustre simple
IV.2. Les formes palustres graves
IV.2.1. Définition et critères de gravité
IV.2.2. Hypothèses physiopathologiques des formes palustres graves
IV.2.3. Les différentes formes cliniques du paludisme grave
V. IMMUNITE ANTI PALUSTRE
V.1. Notion de prémunition
V.2. La réponse immunitaire innée anti palustre
V.2.1. Réponse cellulaire
V.2.2. Réponse cytokinique
V.3. Immunité adaptative
V.3.1. La réponse cellulaire
V.3.2 La réponse humorale
VI. DEFINITION ET CARACTERISTIQUES GENERALES DE LA GALECTINE-3
VI.1. Définition et structure des galectines
VI.2. Effets biologiques de la galectines-3 (Gal-3)
VII. HYPOTHESE ET STRATEGIE DE L’ETUDE
2 eme partie: TRAVEAUX PERSONNELS
I. CADRE D’ETUDE
II. MATERIEL, CONSOMMABLES ET REACTIFS
II.1. Matériel et consommables de laboratoire
II.2. Réactifs
II.3. Population d’étude
III. METHODES
III.1. Technique d’ELISA pour le dosage de la galectine-3
III.1.1. Principe
III.1.2. Mode opératoire
III.2. Technique luminex pour le dosage des cytokines
III.3. Analyses statistiques
IV. RESULTATS
IV.1. Caractéristiques de la population d’étude
IV.1.1. Données générales de la population d’étude
IV.1.2. Caractéristiques hémato-parasitologiques
IV.2 .Variations des taux de cytokines et de la galectine-3
IV.2.1. Profil des taux de cytokines étudiées
IV.2.2. Evolution des taux sériques de galectine-3
IV.2.3. Interrelations entre les taux de cytokines et de galectine-3
IV.3. Variations des taux de cytokines et galectine-3 suivant les données hématoparasitaires
V. DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES
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