Paramètres d’évaluation du dédoublement cinétique enzymatique

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Généralités sur les enzyme s :

Les enzymes sont des édifices macromoléculaires denature protéique qui jouent le rôle de catalyseurs avec une efficacité et une spécificité fonctionnelle, elles sont utilisées souvent pour obtenir des molécules chirales à haute pureté optique.
En 1893, Wilhelm Ostwald montra que les enzymes sont des catalyseurs et en 1894 Emil Fisher posa l’acte fondateur de la notion de stéréospécificité dans le phénomène de catalyse enzymatique sous l’image d’une clé qui ouvre une serrure et une seule.
Les mécanismes moléculaires de la catalyse enzymatique ne posent pas de problèmes différents de ceux de la réactivité chimique. Soitla réaction élémentaire catalysée E+S ES EP E+P
Où E est l’enzyme, S est le substrat et P le produit.
Les biocatalyseurs sont capables d’accélérer la vitesse de la réaction jusqu’à cent milliards (1011) de fois la vitesse de la réaction spontanée en diminuant l’énergie d’activation 14. Ainsi elles offrent une façon propre et écologique d’exécuter des processus chimiques en conditions douces et avec un haut degré de sélectivité.

Généralités sur le dédoublement cinétique enzymatique :

Les composés optiquement purs peuvent être obtenuspar synthèse asymétrique ou par dédoublement de mé1anges racémiques. Les deux méthodes ont ceci en commun qu’elles font souvent appel à une substance naturelle chirale laq uelle constitue la source primaire d’activité optique. Malgré les progrès incessants de la synthèse asymétrique, le dédoublement des mé1anges racémiques reste un procédé très utile dupoint de vue industriel21 car les mélanges racémiques sont prédominants lors des diverses synthèses organiques.

Synthèse énantiosélective des alcools chirauxpar les hydrolases :

Les alcools secondaires chiraux ont un intérêt chimique majeur, quand ils sont disponibles sous la forme optiquement pure, pour la synthèse de composés biologiquement actifs24. Les alcools primaires présentent généralement desélectivités moins importantes ; ceci est probablement dû à l’éloignement de la fonction hydroxyle du centre asymétrique. Les alcools tertiaires sont encore plus difficiles à dédoubler selon les données de la littérature.
De nombreux travaux25 ont été effectués sur la résolution des alcools condairesse chiraux avec les hydrolases par transestérification et hydrolyse enzymatiques énantiosélectives. Ces réactions sont les plus utilisées car elles sont très efficaces et applicables à un grand nombre de substrats.

Facteurs influant sur une réaction de dédoublement cinétique par hydrolyse enzymatique :

De nombreux facteurs peuvent influer sur la réactivité et la sélectivité dans la réaction d’hydrolyse enzymatique notamment, le solvant, la structure du substrat, la nature de l’enzyme ainsi que le pH et la température.

Influence du solvant :

Le solvant joue un rôle important dans les résolutions cinétiques enzymatiques et des modifications importantes de l’activité d’une enzym peuvent être observées selon la nature du solvant utilisé. Plusieurs travaux ont démontré l’utilité de choisir des solvants qui contiennent un minimum d’eau pour que l’enzyme fonctionne dans les milieux organiques.31
Dans le cas des réactions d’hydrolyse enzymatique, le solvant principal est constitué par la solution tampon qui est le milieu aqueux alors que le liquide organique ajouté est considéré comme un co-solvant afin d’augmenter la solubilité du substrat organique dans le milieu réactionnel.
Dans l’exemple suivant qui décrit la réaction de ’hydrolyse de l’ester anti-3-acetoxy-2-iodo-3-phenylpropanoate, les résultats montrent des différentes sélectivités selon le solvant organique utilisé . L’addition du toluène et de l’acétonitrile, à la solution tampon, s’est avérée bénéfique en termes de taux de conversion etd’énantiosélectivité. En présence de l’hexane, utilisé comme co-solvant, seule la réactivité est améliorée.

Influence de la température et du pH :

L’activité des enzymes est fortement affectée par esl changements de pH et de température. Chaque enzyme qui fonctionne le mieux à un certain pH et à une température déterminée voit son activité diminuée à des valeursqui s’écartent de ces points. Ceci est dû à l’importance de la structure tertiaire de l’enzyme en raison des interactions ioniques et des liaisons hydrogène qui déterminent la forme du siteactif.
Les enzymes fonctionnent donc le mieux à une température optimale. Elles sont dénaturées et leur site actif perd sa forme et cess de fonctionner à températures trop élevées bien que les lipases immobilisées soient plus robustes et supportent des températures qui s’approchent de 80°C (la CAL-B en fournit l’exemple d’une lipase qui peut être immobilisée sur résine acrylique).
Comme avec la température, les enzymes ont un pH optimal. Si le pH varie beaucoup, la nature chimique des acides aminés peut changer. Il peut en résulter un changement dans les liens de la structure tertiaire qui peut se décomposer. Le site actif sera perturbé et l’enzyme sera dénaturée également.

Principe de déracémisation :

Le dédoublement cinétique enzymatique du mélange acémiquer d’une molécule chirale donne lieu à deux produits selon les vitess es des deux énantiomères. L’un sous forme de produit obtenu et l’autre sous forme du substrat résiduel, et par conséquence le rendement théorique de chaque énantiomère ne peut jamais dépasser la limite de 50% de conversion38.
Pour pallier à cet inconvénient, qui réside dans laperte de la moitié du produit de départ notamment dans le cas où seul un énantiomère est souhaité, la déracémisation présente la solution idoine. Elle permet d’aboutir exclusivement à un énantiomère avec une excellente pureté optique et un rendement chimique théorique ed 100%.
La déracémisation repose sur le changement de la stéréochimie de l’énantiomère qui réagit le plus lentement afin d’accroître la quantité de celui qui réagit le plus rapidement dans la réaction de transesetérification et l’inverse dansla réaction d’hydrolyse (schéma-13-).

Processus de stéréoinversion :

Cette procédure de stéréoinversion in« situ » connaît actuellement un grand essor, notamment pour ses applications concernant les alcools secondaires d’intérêt potentiel et même les amines chirales.
Lors d’une déracémisation par stéréoinversion, l’un des deux énantiomères du mélange racémique préserve sa configuration absoluetout au long du processus, alors que son antipode optique l’inverse, à travers une réaction chimique et sans racémisation, pour donner un seul produit possédant une même stéréochimie avec un rendement chimique théorique qui équivaut à 100% (schéma-24-).
Cette approche s’effectue selon deux étapes successives, un dédoublement cinétique biocatalysé suivi d’une réaction chimique, qui assure la stéréoinversion «in situ » de l’un des deux énantiomères . L’équipe de Danda a décrit la première approche de stéréoinversion chimique, appliquée au dérivé ester racémique d’unprécurseur de pyréthrinoide.
Le protocole suivi a mis en jeu la combinaison d’une hydrolyse enzymatique de l’acétate racémique avec une transformation chimique, procédant par inversion de configuration. Le mélange de l’ester résiduel et del’alcool formé est traité avec le chlorure de mésyle pour engendrer le groupement partant mésylate sur la structure de l’alcool formé. L’addition ultérieure d’une base forte conduit à l’ inversion de configuration de l’intermédiaire activé (R) avec une hydrolyse simultanée de l’ester de configuration (S). Il en découle l’alcool de configuration (S) avec un rendement chimique de 82% et un excés énantiomérique ee = 90% (schéma-25).

L’énantiocomplémentarité des réactions d’hydrolyse et de transestérification :

Dans certains cas, les deux énantiomères d’une molécule racémique peuvent être obtenus avec d’excellentes puretés optiques et de bons rendements chimiques. Ceci est réalisé en mettant à profit l’énantiocomplémentarité des deux réactions, à savoir, la transéstérification et l’hydrolyse enzymatiques lorsqu’un seul énantiomère réagit au cours des deux réactions.
A cet égard, nous citons l’exemple rapporté par l’équipe de Faber concernant le sulkatol, qui est une phéromone d’insecte. Les deux énantiomères de l’alcool sont obtenus avec des excès énantiomériques ee>98% et de bons rendement chimiques en exploitant l’énantiocomplémentarité des deux réactions : l’acylation et l’hydrolyse suivies par la stéréoinversion chimique selon le protocole de Mitsunobu (schéma-30-).

Etude de l’influence de la quantité d’enzyme utilisée sur la sélectivité de l’hydrolyse enzymatique :

A ce stade de notre étude de l’hydrolyse enzymatique des acétates1a-6a, nous avons tenté d’examiner l’influence, sur notre système réactionnel, de la diminution de la quantité d’enzyme mise en jeu à partir de la valeur initiale ment décrite de 150 mg deCAL-B pour une milli mole de substrat. Le but étant de parvenir à des quantités minimales effectivement réactives et surtout énantiosélectives, et ceci ense référant aux travaux antérieures sur la réaction d’acylation enzymatique sur ces mêmes substrats.

Combinaison du protocole de Mitsunobu avec la réaction d’hydrolyse enzymatique :

Les données de la littérature montrent que l’association de la réaction de Mitsunobu avec celle du dédoublement cinétique par hydrolyseenzymatique a suscité un grand intérêt de la part des chimistes organiciens dans le but d’obtenir des acétates de configuration (S) optiquement purs et avec de bons rendements chimiques.

Les acétates 1a-4a constituent nos modèles dans cette étude de déracémisation par stéréoinversion. Ce choix est dû au fait qu’ils ontpu être obtenus avec de bonnes sélectivités (E>1000) en présence de quantités minimales et efficaces ed CAL-B. Ils présentent tous des énantiosélectivités maximum à une conversionC égale ou voisine à 50%, ce qui donne lieu aux conditions idéales pour appliquer une stéréoinversion consécutive à la réaction d’hydrolyse enzymatique.

Déracémisation par résolution-inversion appliquée aux substrats

Le dédoublement cinétique par hydrolyse enzymatiqu est réalisé dans un premier temps, en présence de la lipase de CAL-B. les deux énantiomères sont obtenus, l’un sous forme d’acétates résiduel S() et l’autre sous forme d’alcool produit ( R).

Le protocole opératoire suivi précédemment est maintenu ici. La quantité de lipase utilisée est celle permettant le déroulement efficace de la réaction d’hydrolyse enzymatique. Il est très important de vérifier le taux de conversio lors de cette hydrolyse enzymatique. Sa valeur doit être le plus proche possible de 50%. Acette conversion, les valeurs de sélectivité sont excellentes (E>1000) et les deux énantiomères sont optiquement purs.

Théoriquement au cours de cette étape, la moitié ed la quantité du substrat se transforme en alcool produit et l’autre moitié reste sous forme d’acétate initial avec un rendement maximum de 50% pour chaque énantiomère.

Deuxième étape: Inversion de configuration des alcools produits selon le protocole de Mitsunobu. Le mélange constitué de l’acétate résiduelS )( et de l’énantiomère sous forme d’alcool produit (R) est dissous dans l’éther diéthylique après élimination de la lipase par filtration. Ensuite, ce mélange est soumis à l’action des réactifs de Mitsunobu où l’alcool produit de configuration (R) subit une acylation « in situ ».

L’estérification de l’énantiomère produit, à savoirl’alcool ( R), se fait par inversion de sa configuration absolue, passant de la configuration (R) initiale à la configuration ( S), identique à celle de l’énantiomère résiduel qui estl’acétate (S).

A la fin de cette réaction, un seul énantiomère estobtenu sous forme d’acétate (S). Les produits secondaires, générés au cours de la réaction de Mitsunobu, sont éliminés par chromatographie sur colonne de gel de silice. Le schéma suivant résume ces étapes.

Conclusion générale

Les résultats de notre étude nous ont permis de constater que la réaction de dédoublement cinétique par hydrolyse enzymatique possède une grande efficacité afin d’obtenir des molécules énantiomériquement pures ou enrichies, aynt un intérêt majeur dans divers domaines (industries pharmaceutiques, cosmétiques et agroalimentaires). Les hydrolases et notamment les lipases constituent la classe d’enzymes la plus indiquée pour atteindre cet objectif ; elles ont souvent une préférence stéréospécifique pour un seul énantiomère d’un substrat chiral.
Nous avons mené notre étude sur des acétates correspondant aux alcools secondaires benzyliques chiraux, à savoir, les arylalkylcarbino ls dont l’intérêt pharmacologique et l’implication en chimie fine sont reconnus.
Dans un premier lieu, nous avons examiné l’influence de la quantité de la lipase de Candida antarctica B (CAL-B), sur le système réactionnel, pour aboutir à une réactivité et énantiosélectivité optimales lors de la réaction dudédoublement cinétique par hydrolyse enzymatique. Des résultats intéressants sont obtenus. Bien que la quantité de 150 mg (675U) de CAL-B, mise en jeu pour le dédoublement d’une millimole d’acétate, soit efficace pour obtenir de bonnes sélectivités pour la plupart dessubstrats étudiés (E> 200), la diminution de cette quantité a été favorable à d’excellentes sélectivités.
Nous avons noté une nette amélioration de l’énantioseélectivité de laCAL-B vis-à-vis des substrats étudiés à l’exception de l’acétate5a. Dans le cas du 2,3-dihydro-1H-inden-1-yl acétate 1a, une quantité 12 fois plus inférieure de la lipase onduitc efficacement à un facteur de sélectivité E > 1000 pour un taux de conversionde 50%. De même, les deux énantiomères du 1,2,3,4 tetrahydronaphthalen-1-yl acétate 2a sont obtenus optiquement purs (avec c=50% et E>1000) en utilisant ne quantité trois fois pluspetite.
Dans un second volet de notre travail, nous avons mis en jeu un processus de déracémisation par stéréoinversion des substrats1a-4a, visant une valorisation quantitative de ces acétates obtenus optiquement purs par hydrolyse enzymatique. A cet effet, la réaction de dédoublement cinétique par hydrolyse enzymatique, menée jusqu’à une conversion d’environ 50% avec des facteurs de sélectivités E>1000, a étécombinée à une réaction d’inversion de configuration chimique de l’énantiomère produit obtenu sous forme d’alcool de configuration (R). C’est le protocole de Mitsunobu qui a été mis enjeu pour réaliser cette transformation en acétate de configuration (S), ce qui explique l’augmentation du rendement chimique au-delà de 50%.
Des résultats très significatifs sont obtenus. Ainsi, les acétates (S) des substrats 1a, 2a et 4a sont obtenus avec d’excellentes puretés optiques 92%≤ee≤99% après la déracémisation. Les rendements chimiques sont également très satisfaisants 76%≤rdt≤89%. Seul l’acétate (S) du substrat 3a, est obtenu avec une baisse de la pureté optique ee = 71% après la réaction consécutive de Mitsunobu.
Une comparaison de cette étude de déracémisation par hydrolyse enzymatique suivie de la réaction chimique de stéréo inversion a été réalisée avec celle effectuée précédemment par acylation enzymatique suivie du même protocole de Mitsunobu. Elle a mis en évidence une énantiocomplémentarité qui a permis d’obtenir les euxd énantiomères du substrat 2a optiquement purs (ee>99%) et avec de bons rendements chimiques. Le substrat 1a illustre également cette énantiocomplémentarité des deux réactions biocatalysées.

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Table des matières

Introduction générale
Chapitre I : Généralité sur le dédoublement cinétique enzymatique
I-1 Introduction
I-2 Généralités sur les enzymes
I-2-1 Structure des enzymes
I-2-2 Classification des enzymes
I-2-3 Utilisation des hydrolases en synthèse organique
I-3 Généralités sur le dédoublement cinétique enzymatique
I-3-1 Principe du le dédoublement cinétique enzymatique
I-3-2 Mécanise réactionnel
I-3-3 Paramètres d’évaluation du dédoublement cinétique enzymatique
I-3-4 Variation des excès énantiomériques en fonction de la conversion
Facteur de sélectivité faible
Facteur de sélectivité élevé
I-4 Synthèse énantioséléctive des alcools secondaires avec les hydrolases
I-4-1Transesetérification enzymatique
I-4-2 Hydrolyse enzymatique
I-5 Facteurs influant sur une réaction de dédoublement cinétique par hydrolyse enzymatique
I-5-1 Influence du solvant
I-5-2 Influence du substrat
I-5-3 Influence de la nature d’enzyme
I-5-5 Influence la température et du PH
I-6 Conclusion
Chapitre II : Généralité sur les méthodes de déracémisation
II-1 Introduction
II-2 Principe de déracémisation
II-3 Stratégies de déracémisation
Racémisation catalysée par une base
Racémisation par une séquence d’oxydoréduction
Racémisation catalysée par les enzymes
II-3-1-Méthode dédoublements cinétiques répétés
II-3-2 Dédoublements cinétiques dynamiques
II-3-3 Déracémisation par oxydoréduction cyclique
II-3-4 Processus de stéréoinversion
II-3-4-1 La réaction de Mitsunobu
II-3-4-2 Application de la réaction de Mitsunobu en synthèse organique
II-5 Conclusion
Chapitre III : Synthèse énantiosélective des alcools chiraux
III-1 Introduction
III-2 Etude bibliographique de l’hydrolyse enzymatique de ces modèles
III-3 Synthèse des acétates racémiques 1a-6a
III-4 Dédoublement cinétique enzymatique des acétates racémique 1a-6a par hydrolyse enzymatique en présence de 150 mg de CAL-B ..
III-5 Etude l’influence de la quantité d’enzyme utilisée sur la sélectivité de l’hydrolyse enzymatique
III-5-1- Cas du 2,3-dihydro-1H-inden-1-yl acétate (1a) et du 1,2,3,4 tetrahydro naphthalen-1-yl acétate (2a)
III-5-2- Cas du 1-(6methoxynaphthalen-2-yl) éthyle acétate (3a) et du 1- (naphthalen-2-yl) éthyle acétate (4a)
III-5-3- Cas du du1,2-dihydroacénaphthylen-1-yl acétate (5a) et du 1- (naphthalen-1-yl) éthyle acétate 6(a)
III-6 Combinaison du protocole de Mitsunobu avec la réaction d’hydrolyse enzymatique
III-7 Déracémisation par résolution-inversion appliquée aux substrats 1a-4a
III-8 Etude comparative entre la déracémisation par acylation et par hydrolyse combinées à la réaction de Mitsunobu
III-9 Conclusion
Conclusion générale