SAN-OM-29
Optimisation des revêtements bioactifs pour la formation d’une couche endothéliale
Pré-ensemencement des prothèses synthétiques pour améliorer leur performance clinique:
Vara et al. ont fait le point sur l’endothélialisation des implants synthétiques et des diverses stratégies de fabrication des implants biologiques (Vara et al., 2005). L’ensemencement endothélial de la surface interne des prothèses synthétiques semble être une approche prometteuse, puisque l’endothélium fournit une structure intégrale au vaisseau sanguin par la formation d’une barrière thromborésistante et activement anti-thrombotique entre la circulation sanguine et les parois artérielles (Vara et al., 2005). Deux stratégies sont utilisées pour l’ensemencement des CEs :
Ensemencement en une étape (Single-stage seeding):
Les cellules sont extraites et alignées directement sur les greffes. Cette technique peut être effectuée au cours d’une opération chirurgicale. L’application de single-stage donne des résultats intéressants en expérimentation animale, mais des résultats mitigés chez l’humain par manque d’endothélialisation (Alobaid et al., 2005).
Ensemencement en deux étapes (Two- stage seeding):
Les cellules extraites du patient sont mises en culture pour une période de 2 à 4 semaines. Un grand nombre de cellules serait ensemencé, mais le problème avec cette technique d’ensemencement est la dureté de culture nécessaire pour la production des quantités des cellules suffisantes ce qui rend cette méthode non convenable en application clinique en cas d’urgence. En 2009, Deutsch et al. ont rapporté une étude montrant que des prothèses de 7 et 6 mm enduites de colle de fibrine et endothélialisées avec des CEs autologues présentent une perméabilité de respectivement 71 et 55 % à 10 ans (Deutsch et al., 2009). Ces prothèses à 3 et 7 ans présentaient une perméabilité de 85 et 74 %, alors que les mêmes non endothélialisés présentaient une perméabilité de seulement 55 et 0 % (Deutsch et al., 1999). Il a également été démontré que les cellules progénitrices endothéliales (EPCs) ont le potentiel de former une couche d’endothélium (Shirota et al., 2003) (Kaushal et al., 2001). Le gros avantage des EPCs par rapport aux CE étant la facilité de prélèvement (ponction veineuse à la place d’une procédure chirurgicale) (Ward, Stewart et Kutryk, 2007).
Processus de coagulation et fibrinolyse:
La coagulation est une cascade d’activation enzymatique qui mène à la formation d’un caillot sanguin. Le mécanisme de coagulation passe par deux voies: voie intrinsèque et voie extrinsèque, qui sont résumées à la Figure 1.3.
Le mécanisme de coagulation se base sur trois étapes (Tortora, 1988) : – Première étape : la formation d’un activateur de la prothrombine par les voies intrinsèque et extrinsèque.
– Deuxième étape : la conversion de la prothrombine (une protéine plasmatique formée par le foie) en thrombine (une enzyme) par l’activateur de la prothrombine.
– Troisième étape : la conversion du fibrinogène (une autre protéine plasmatique formée par le foie) en fibrine insoluble par la thrombine. La fibrine forme les filaments du caillot.
La formation de l’activateur de la prothrombine est déclenchée par l’interaction des mécanismes extrinsèque et intrinsèque de la coagulation.
Le mécanisme extrinsèque de la coagulation s’effectue rapidement, en quelques secondes, dans le cas d’un traumatisme. On l’appelle ainsi parce que la formation de l’activateur de la prothrombine est déclenchée par des substances libérées par les vaisseaux sanguins lésés ou les tissus environnants, à l’extérieur du sang (Tortora, 1988).
Le mécanisme intrinsèque de la coagulation est plus complexe, et il s’effectue plus lentement, habituellement en quelques minutes. Il s’appelle ainsi parce que la formation de l’activateur de la prothrombine est déclenchée par une substance présente à l’intérieur du sang. Le mécanisme intrinsèque est déclenché lorsque le sang entre en contact avec les fibres du collagène sous-jacentes des vaisseaux sanguins lésés.
Implication des plaquettes dans l’agrégation et la coagulation:
Les plaquettes sont les plus petites cellules sanguines dont la principale caractéristique est leur absence de noyau. Lorsqu’elles sont dans un état quiescent, les plaquettes sont discoïdes avec une membrane lisse. L’adhésion plaquettaire se fait par des agonistes plaquettaires qui se collent au sous-endothélium grâce au facteur Willebrand, au collagène, et à la thrombine (Martin, 2006). Les plaquettes adhérées s’activent et deviennent plus sphériques; elles redistribuent à partir de leurs granules intracellulaires des substances vasoactives comme l’adénosine diphosphate (ADP) et le Thromboxane A2 (TXA2) vers leur surface, qui leur permettent d’adhérer et de s’étaler; elles se fixent à d’autres plaquettes circulantes en développant des extensions membranaires, notamment la formation de filopodes et de lamellipodes, ce qui favorise la formation d’agrégat plaquettaire. Des molécules d’adhésion comme les sélectines permettront aux plaquettes d’interagir avec d’autres types cellulaires dont les globules blancs ou leucocytes. Des interactions adhésives entre les plaquettes et les leucocytes jouent un rôle de premier plan dans l’inflammation, la coagulation, l’agrégation et la thrombose (Rinder et al., 1991). L’agrégation plaquettaire se fait ainsi grâce au fibrinogène qui établit des ponts entre les plaquettes, créant un thrombus. Elles s’agrègent au niveau des surfaces vasculaires blessées ou thrombogènes et mènent à la formation du thrombus.
Les plaquettes interviennent dans la coagulation : lorsque la plaquette est activée, les phospholipides membranaires se transforment en prostaglandines puis en TXA2 qui est un activateur plaquettaire (FitzGerald, 1991). Suite à l’activation plaquettaire, la libération des molécules servira de support à la coagulation, comme le calcium et le facteur tissulaire (TF), qui favorisent les voies intrinsèques et extrinsèques et participent à la transformation de la prothrombine en thrombine. Celle-ci, comme nous l’avons vu, transforme alors le fibrinogène en fibrine (Blockmans, Deckmyn et Vermylen, 1995).
Pré-ensemencement des prothèses synthétiques pour améliorer leur performance clinique:
Vara et al. ont fait le point sur l’endothélialisation des implants synthétiques et des diverses stratégies de fabrication des implants biologiques (Vara et al., 2005). L’ensemencement endothélial de la surface interne des prothèses synthétiques semble être une approche prometteuse, puisque l’endothélium fournit une structure intégrale au vaisseau sanguin par la formation d’une barrière thromborésistante et activement anti-thrombotique entre la circulation sanguine et les parois artérielles (Vara et al., 2005). Deux stratégies sont utilisées pour l’ensemencement des CEs :
Ensemencement en une étape (Single-stage seeding):
Les cellules sont extraites et alignées directement sur les greffes. Cette technique peut être effectuée au cours d’une opération chirurgicale. L’application de single-stage donne des résultats intéressants en expérimentation animale, mais des résultats mitigés chez l’humain par manque d’endothélialisation (Alobaid et al., 2005).
Ensemencement en deux étapes (Two- stage seeding):
Les cellules extraites du patient sont mises en culture pour une période de 2 à 4 semaines. Un grand nombre de cellules serait ensemencé, mais le problème avec cette technique d’ensemencement est la dureté de culture nécessaire pour la production des quantités des cellules suffisantes ce qui rend cette méthode non convenable en application clinique en cas d’urgence. En 2009, Deutsch et al. ont rapporté une étude montrant que des prothèses de 7 et 6 mm enduites de colle de fibrine et endothélialisées avec des CEs autologues présentent une perméabilité de respectivement 71 et 55 % à 10 ans (Deutsch et al., 2009). Ces prothèses à 3 et 7 ans présentaient une perméabilité de 85 et 74 %, alors que les mêmes non endothélialisés présentaient une perméabilité de seulement 55 et 0 % (Deutsch et al., 1999). Il a également été démontré que les cellules progénitrices endothéliales (EPCs) ont le potentiel de former une couche d’endothélium (Shirota et al., 2003) (Kaushal et al., 2001). Le gros avantage des EPCs par rapport aux CE étant la facilité de prélèvement (ponction veineuse à la place d’une procédure chirurgicale) (Ward, Stewart et Kutryk, 2007).
Difficultés rencontrées et limites du projet:
Ce projet de maitrise s’est heurté à plusieurs défis techniques. Un des défis a été d’optimiser une méthode de marquage spécifique des plaquettes car la surface LP présente de l’autofluorescence à différentes longueurs d’onde en microscopie confocale. De plus, l’optimisation d’une méthode (simple et peu coûteuse) pour double marquage des cellules et plaquettes en perfusion a été un défi dans ce projet à cause de l’interférence de couleur entre les deux marquages. Ensuite, l’obtention d’une couche de CEs confluente à 100% sur le LP a été difficile à obtenir.
En ce qui concerne les limites du travail, le caractère laminaire et uniforme du flux sanguin sur les surfaces exposées dans les chambres de perfusion n’a pas été vérifié. On n’a cependant utilisé que les zones centrales des surfaces afin de limiter l’effet possible d’hétérogénéité ou de turbulence dans la zone d’entrée. Aussi, le test de perfusion était limité à un seul temps de perfusion, qui était court (15 minutes) et une seule force de cisaillement. Finalement, le nombre des échantillons testés pour la représentativité des résultats statistiques a été limité (n entre 5 et 12). Ceci dû d’une part à la disponibilité du sang, la longueur des expériences et d’autre part à la disponibilité pour faire le dépôt par plasma de notre revêtement LP sur le PET. Un autre facteur est le problème de fuites cellulaires durant les tests d’adhésion et croissance cellulaire et les fuites sanguines durant la perfusion, ce qui nous a obligés à éliminer certaines expériences de nos analyses.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 REVUE DE LITTÉRATURE
1.1 Le système vasculaire : composantes, propriétés et pathologies
1.1.1 Le milieu sanguin
1.1.2 Paroi artérielle normale
1.2 Cellules endothéliales
1.2.1 Endothélium vasculaire
1.2.2 Les cellules endothéliales et leurs rôles
1.2.3 Processus de coagulation et fibrinolyse
1.2.4 Implication des plaquettes dans l’agrégation et la coagulation
1.2.5 Influence de CEs sur l’hémostase
1.2.6 L’athérosclérose
1.3 Substituts vasculaires
1.3.1 Les substituts vasculaires autologues
1.3.2 Les substituts vasculaires d’origine synthétique (prothèses vasculaires synthétiques)
1.3.3 Limite des prothèses vasculaires synthétiques
1.4 Pré-encemensement des prothèses synthétiques pour améliorer leur performance clinique
1.5 Modification de surface pour le pré-ensemencement par CEs
1.5.1 Modifications physico-chimiques
1.5.2 Modifications par biofonctionalisation
1.6 Impact du cisaillement sur les CEs
1.7 Travaux antérieurs du laboratoire pour un revêtement bioactif
1.8 Conclusions de la revue de littérature et objectifs
CHAPITRE 2 MATÉRIELS ET MÉTHODES
2.1 Préparation des surfaces
2.1.1 Revêtement polymérisé par plasma (LP)
2.1.2 Surfaces contrôle
2.1.3 Adsorption de la Fibronectine
2.1.4 Greffage de la CS et de l’EGF
2.2 Adhésion et croissance des HUVECs sur les surfaces bioactives
2.2.1 Culture cellulaire des HUVECs
2.2.2 Adhésion cellulaire
2.2.3 Croissance cellulaire
2.3 Étude de la thrombogenicité des surfaces
2.3.1 Système de perfusion
2.3.2 Calcul du taux de cisaillement (S.R. pour « Shear rate » en anglais)
2.3.3 Prélèvement sanguin
2.3.4 Isolation des plaquettes
2.3.5 Mesure de l’adhésion plaquettaire par marquage des plaquettes à l’indium111
2.3.6 Coloration plaquettaire à la Rhodamine
2.3.6.1 Coloration du sang complet
2.3.6.2 Coloration des plaquettes isolées
2.3.7 Évaluation de l’adhésion plaquettaire
2.3.7.1 Comptage des plaquettes en fluorescence
2.3.7.2 Étude de l’activation plaquettaire par microscopie électronique à balayage
2.4 Stabilité des HUVECs sous cisaillement et leur propriété non-thrombogénique sur les différentes surfaces
2.4.1 Coloration des HUVECs au Cellvue Maroon
2.4.2 Coloration des plaquettes avec anti-CD61/FITC
2.4.3 Test de thrombogenicité sous force de cisaillement en présence des HUVECs
2.5 Analyse statistique
CHAPITRE 3 RÉSULTATS
3.1 Optimisation des revêtements bioactifs pour la formation d’une couche endothéliale
3.1.1 Adhésion et croissance des HUVECs en présence et en absence de fibronectine
3.1.2 Étude du maintien des HUVECs sous condition de flux en présence et en absence de FN. 3.1.3 Étude de l’effet de la Chondroitine sulfate sur l’adhésion et la croissance des HUVECs.
3.2 Étude de la thrombogénicité des surfaces par perfusion
3.3 Effet sur le maintien des HUVECs durant la perfusion et de la thrombogenicité de surfaces après ensemencement cellulaire.
CHAPITRE 4 DISCUSSION ET PERSPECTIVE
4.1 Synthèse des principaux résultats
4.2 Difficultés rencontrées et limites du projet
4.3 Perspectives
CONCLUSION
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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