Soutenance mémoire
Oleuropein modulates the autophagic flux
La microautophagie
Durant ce mécanisme, les lysosomes engloutissent directement le cytoplasme contournant la nécessité de la formation des autophagosomes et des autophagolysosomes. En effet, ce processus implique directement la pinocytose de petites quantités du cytosol par les lysosomes. La micro autophagie est active dans l’état de repos, et est responsable du renouvellement continu des constituants intracellulaires.
L’autophagie médiée par les chaperons (CMA)
La CMA est responsable de la dégradation sélective de 30 % des protéines cytosoliques solubles ayant un pentapeptide unique (KFERQ). Cette séquence d’acides aminés est spécifiquement reconnue par une chaperone cytosolique, heat shock et ses co-chaperones qui vont diriger les protéines à dégrader dans les compartiments lysosomaux. Sur la paroi du lysosome, le complexe protéine-chaperone se lie à une protéine membranaire (LAMP2A), où la protéine à dégrader est dépliée et transloquée à travers la membrane lysosomale afin d’être dégradée. Ce processus est actif sous des conditions basales, mais un stress ainsi qu’une période prolongée de privation de nutriments peuvent aussi l’ activer.
Le rôle de l’autophagie dans la MP
La première évidence qui supporte le rôle significatif de l’ autophagie dans la MP vient du fait que l’alpha-synucléine qui est un constituant majeur des corps de Lewy est dégradé par macroautophagie et CMA (Webb 2003, Vogiatzi 2008). Il a été révélé que dans les neurones sains, la clairance de l’alpha-synucléine par la CMA est cruciale pour limiter l’ oligomérisation de l’alpha-synucléine. Cependant, les mutants A53T A30P de l’alpha-synucléine, qui causent la forme familiale de la MP, ont été trouvés à inhiber la CMA en présentant une affinité plus élevée pour LAMP2A (Cuervo 2004). Donc, les formes mutantes de l’alpha-synucléine sont mal intériorisées dans les lysosomes, et sont dégradées par macro autophagie au lieu de la CMA.
En plus de la dégradation de l’alpha-synucléine, la VOle de l’autophagie est également impliquée dans le renouvellement des mitochondries. Le dysfonctionnement mitochondrial présente l’un des mécanismes pathologiques cruciaux dans la MP (Levy 2009). Cette idée a été plus élaborée dans la sous-sous-section 1.1.4.2 de ce mémoire.
L’ oleuropéine
Introduction
Des études épidémiologiques ont démontré que l’incidence des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives était moindre dans les pays de la région méditerranéenne, c’est ce qui a alimenté une multitude de recherches sur le régime alimentaire de cette région. L’olive provenant de la plante Olea europaea est native de la région méditerranéenne, l’huile ainsi que le fruit sont des composants importants de la diète de cette région. Leurs propriétés pharmacologiques ont été reconnues comme composants importants en médecine et diète santé à cause de leurs composants phénoliques, dont l’ Oe.
L’De fait partie de la famille des sécoiridoides (Figure 1.11), c’est le composant phénolique le plus important dans les cultivars d’olive et atteint des concentrations de plus de 140 mg/g sur base de matière sèche dans l’olive jeune, et 60 à 90 mg/g dans les feuilles (Syed Haris 2010).
Biodisponibilité
L’Oe est très abondante dans la phase de croissance du fruit. Dans les jeunes fruits, elle peut atteindre 14 % de poids sec. Son niveau reste très important à la récolte de cultivars verts. Cependant, dans les cultivars noirs, son niveau diminue très rapidement durant la maturation, dans quelques variétés, cela peut atteindre 0 quand le fruit est complètement noir.
Les composants phénoliques de l’huile d’olive vierge sont très bio-disponibles.
En effet, des études ont démontré que l’absorption de l’ Oe était de 55 à 60 % chez des sujets humains (Vissers 2002). Deux autres études ont démontré que l’Oe est rapidement absorbé après une administration orale avec une concentration plasmatique maximale survenant 2 heures après l’ administration (Del Boccio 2003, Tan 2003).
Enfm, d’autres des recherches ont aussi démontré que l’Oe pouvait traverser la barrière hémato encéphalique (Serra 2012).
Effets pharmacologiques
L’ Oe possède de nombreux effets pharmacologiques bénéfiques sur la santé tels qu’antioxydant et anti-inflammatoire comme l’ont démontré des études qui ont été réalisées sur des modèles in vitro et in vivo. De plus, plusieurs études épidémiologiques ont démontré que l’incidence de certains types de cancer dans le bassin méditerranéen est plus faible par rapport à d’autres régions (Barbaro 2014, Bulotta 2014).
Une étude in vivo montre que l’administration d’huile avec des concentrations croissantes d’Oe réduit l’ excrétion urinaire de 8-iso-PGF2a, et ceci de manière dosedépendante.
Le 8-iso-PGF2a est un marqueur de la peroxydation des lipides, ce qui est une conséquence du stress oxydatif (Visioli 1998). Une autre étude in vivo indique que l’ajout de l’Oe augmente la capacité des LDL à résister à l’oxydation et en même temps réduit les taux plasmatiques de cholestérol total, libre et estérifié (Coni 2000).
De plus, l’Oe a démontré in vitro (Speroni E 1998) sa capacité à neutraliser les ERO (Visioli 1998) et à augmenter l’activité des molécules anti-oxydantes SOD (Andreadou 2006).
En ce qui concerne l’effet anti-inflammatoire, l’Oe agit en réduisant l’ activité lypoxygenase et la production de leucotriène B4 (De la Puerta 1999). Quant à l’effet anti-cancer, l’Oe a démontré sa capacité à réduire la viabilité des cellules cancéreuses en inhibant leur taux de prolifération et en induisant l’apoptose (Han 2009).
Quant à l’ effet neuroprotecteur, une étude a démontré que l’Oe peut diminuer et même prévenir l’ agrégation du peptide ~-amyloïde, l’un des principaux facteurs responsables de la neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer (Bazoti 2006).
De plus, l’Oe est un inhibiteur de Tau, une protéine associée aux microtubules connue pour fonner des dépôts d’amyloïdes caractéristiques de la maladie d’Alzheimer (Daccache 2011). En concordance avec les résultats qu’on a obtenus sur l’effet de l’Oe sur l’apoptose, Asban-Aliabadi et al. ont démontré que l’Oe exerce des effets antiapoptotiques sur les cellules PC12 exposées à la 6-0HDA (pasban-Aliabadi 2013).
À notre connaissance, aucune étude n’a mis en évidence le rôle de l’Oe sur le mécanisme de l’autophagie. Le sujet de ce mémoire et de l’article est original et est d’actualité.
Modèles expérimentaux
Cellules PC12
Les cellules PC12 proviennent d’un phéochromocytome de la glande surrénale du rat, d’où leur capacité à synthétiser des catécholamines, dont la dopamine. Après avoir été traitées avec un facteur de croissance qui est le Growth Nerve Factor (NGF), ces cellules arrêtent de proliférer et acquirent des propriétés de neurones dopaminergiques (Figure 1.12). Les PC12 traitées avec la neurptoxine 6-0HDA sont utilisées comme modèle cellulaire de la MP. Les PC12 sécrètent exclusivement de la Dopamine lorsque différenciées, expriment le DAT ainsi que les récepteurs pour l’estrogène alpha et bêta, les neurofilaments H-M et L. Donc, les travaux expérimentaux qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisés avec des cellules PC12 différentiées en cellules neuronales.
Hydroxydopamine (6-0HDA)
La 6-0HDA (Figure 1.13) est la première neurotoxine catécholaminergique qui a été découverte et employée pour mimer la MP dans les modèles animaux et cellulaires puisqu’elle induit préférentiellement la mort des neurones dopaminergiques et noradrénergiques (Yelena 1995).
Il a été rapporté que la 6- OHDA est oxydé au niveau extracellulaire, sa toxicité est donc médiée par les produits d’oxydation générés, en particulier le peroxyde d’hydrogène et le p-quinone. Ce stress oxydatif induit un dysfonctionnement mitochondrial. En effet, le H20 2 induit l’oxydation de la peroredoxine 3, la relâche du cytochrome c et par la suite l’activation de la caspase 3. Le quinone peut activer la caspase 3 en passant par les caspases 8 et 12 indépendamment de la mitochondrie. Ce qui conduit à l’apoptose des cellules catécholaminergiques (Figure 1.14) (Hanrott 2006, Saito 2007).
LES PROPRIÉTÉS NEUOPROTECTRICES ET AUTOPHAGIQUES DE L’OLEUROPÉINE SUR DES NEURONES DOP AMINERGIQUES SOUMIS À UN STRESS OXYDATIF
Contribution des auteurs
Astrogliose, et une infiltration lymphocytaire. À la suite d’une activation appropriée, les cellules micro gliales peuvent exercer une activité antimicrobienne, et induire une toxicité cellulaire par la production et la libération des ERO et de l’azote. Bien que peu réactifs, les radicaux libres NO et 0 2- peuvent se combiner pour former des espèces hautement réactives d’azote peroxynitrite (ONOO-) (Figure 1.7). Ces dernières peuvent causer des dommages oxydatifs dans diverses protéines, telles que la tyrosine hydroxylase et l’a-synucléine, et ainsi contribuer à la dégénérescence des neurones dopaminergiques (Hirsch 2009).cytotoxicité ainsi qu’un test de fragmentation de l’ADN. Ces derniers ont démontré que notre molécule naturelle agit autant que neuroprotecteur sur les neurones dopaminergiques en réduisant le taux de mort cellulaire induite par la 6-0HDA.
Dans le but d’évaluer l’effet antioxydant de l’Oe, le test de MitoSox a été utilisé.
Les résultats indiquent que l’Oe protège les cellules PC12 différentiées en neurones dopaminergiques contre l’oxydation induite par le diéthyldithiocarbamate (DDC) qui est considéré comme un pro-oxydant, inhibiteur de la SOD. Enfm, afm de connaitre l’effet de l’Oe sur le processus qui joue un rôle critique dans la pathogénèse de la maladie de Parkinson et qui est l’autophagie, on a mesuré des marqueurs importants de l’autophagie comme LC3 et p62 par immunofluorescence et immunobuvardage de type Western.
En conclusion, l’Oe possède des propriétés neuroprotectrices qui pourraient être reliées à son effet antioxydant ainsi qu’à sa capacité à moduler le mécanisme de l’autophagie.
Abstract
Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder, primarily affecting dopaminergic neurons in the substantia nigra. Currently, there is no cure for PD and present medications are aimed at reducing clinical symptoms. The goal of this study was to investigate whether Oleuropein (Ole), a phenolic compound found in olive leaf, may prote ct neuronal cells against degeneration in a cellular model of PD, neuronal PC12 cells, exposed to the potent neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-0HDA).
Cytotoxicity assays showed that the administration of Ole prior to the oxidative insult prevents cell death induced by 6-0HDA. Furthermore, the results obtained by measuring specifie apoptotic DNA fragmentation, demonstrate that Ole significantly decreases apoptosis. The antioxydative effect of Ole was evaluated by MitoSOX red, and data showed that Ole reduces the production of reactive oxygen species induced by N,N-diethyldithiocarbamate (DDC). A growing body of evidence shows that autophagy plays a key role in the pathogenesis of PD. Indeed, we observed autophagie vacuoles in the cytoplasm of neuronal cells treated with Ole. We identified them by labeling with Cyto-ID and by measuring additional markers of autophagy-related processes such as LC3, HDAC6, LAMP2, mtHSP70, and p-62 expression by immunofluorescence and Western blots. Altogether, the results obtained suggest that Ole exerts neuroprotective properties against 6-0HDA-induced neurotoxicity related to its antioxydative effect and its ability to modulate the mechanism of autophagy.
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Table des matières
REMERCIEMENTS
RESUME
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ABRÉVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1 La maladie de Parkinson
1.1.1 Diagnostic
1.1.2 Prévalence génétique de la MP
1.1.3 Épidémiologie
1.1.4 Pathogenénèse
1.1.5 Neuro-inflarnmation
1.1.6 Traitement
1.2 L’autophagie
1.2.1 La macro autophagie
1.2.2 Les marqueurs d’autophagie utilisés
1.2.3 La micro autophagie
1.2.4 L’ autophagie médiée par les chaperons (CMA)
1.2.5 Le rôle de l’ autophagie dans la MP
1.3 L’oleuropéine
1.3.1 Introduction
1.3.2 Biodisponibilité
1.3.3 Effets pharmacologiques.
1.4 Modèles expérimentaux
1.4.1 Cellules PC12
1.4.2 Hydroxydopamine (6-0HDA)
1.5 Objectifs
CHAPITRE II
LES PROPRIÉTÉS NEUOPROTECTRICES ET AUTOPHAGIQUES DE L, ‘OLEUROPÉINE SUR DES NEURONES DOPA MINERGIQUES SOUMIS A UN STRESS OXYDA TIF
2.1 Contribution des auteurs
2.2 Résumé de l’article
2.3 Article scientifique
Abstract
Introduction
Materials and methods
Drugs and chemicals
Cell culture and treatments
Cytotoxicity Measurements
DNA Fragmentation Analysis
Detection ofMitochondrial·02-
Detection of autophagic vacuoles by Cyto-ID
Fluorescence Microscopy
Electrophoresis and Immunoblot Analysis
Statistical analysis
Results
Oleuropein reduces 6-0HDA induced cellular death and oxidative stress
Oleuropein modulates the autophagic flux
Oleuropein reverts abnormal relocalization of lysosomes and
mitochondria induced by 6-0HDA
Discussion
Acknowledgments
References
Legends to the figures
Figures
CHAPITRE III
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPIDQUES
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