Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Deux modèles pour le transport intra-golgien!: vésiculaire ou maturation des citernes
Lorsque les molécules transportées le long de la voie de biosynthèse-sécrétion atteignent la face cis d’un empilement golgien, elles progressent à travers l’empilement pour atteindre la face trans. Cependant, le chemin suivi par ces molécules fait l’objet d’une controverse!: il existe deux modèles du transport intra-golgien (Figure 2).
Le premier modèle, dit vésiculaire, suppose que l’empilement de citernes est une structure stable (probablement maintenue par une matrice sous-jacente). Les cargos seraient empaquetés dans des vésicules qui progressent depuis le RE jusqu’à la citerne cis la plus proximale, avec laquelle elles fusionnent et dans lesquelles elles libèrent leur cargo. Le cargo est ensuite empaqueté dans des vésicules qui bourgeonnent depuis cette citerne cis et progressent jusqu’à la prochaine citerne de l’empilement, immédiatement distale, dans laquelle le cargo est relargué. Ainsi le cargo progresse de citerne en citerne dans la direction antérograde au sein de vésicules. Un cargo destiné à progresser dans la direction rétrograde, dans le sens opposé, serait empaqueté dans des vésicules différentes, qui bourgeonnent d’une citerne et fusionne avec la citerne immédiatement proximale. Ce modèle nécessite donc l’existence d’au moins deux sortes de vésicules, contenant exclusivement les cargos antérogrades ou rétrogrades (Orci et al. 1997).
Le second modèle, dit de maturation des citernes, suppose que les citernes de l’appareil de Golgi sont en permanence régénérées depuis le RE et détruites au niveau du TGN, et qu’elles progressent en maturant depuis leur formation à la face cis de l’empilement vers la face trans (Allan et Balch 1999). Dans le cadre de ce modèle, les cargos antérogrades restent au sein des citernes et progressent grâce au processus de maturation des citernes d’une face à l’autre. En revanche, les cargos rétrogrades sont transportés, comme dans le modèle vésiculaire, au sein de vésicules qui progressent de citerne en citerne dans la direction rétrograde. Une conséquence majeure est que les protéines dites résidentes de l’appareil de Golgi, comme les enzymes de glycosylation qui maintiennent leur localisation à l’équilibre au sein de l’appareil de Golgi très souvent sur un sous-compartiment précis, se comportent dans ce modèle comme des cargos rétrogrades, transportées en permanence au sein de vésicules dans le sens rétrograde. A nouveau, deux modes de transport vésiculaire sont nécessaires (comme dans le premier modèle), puisque les cargos rétrogrades doivent progresser au sein de vésicules «!rapides!» qui leur permettent de remonter le flux intrinsèque des citernes qui maturent, tandis que les protéines résidentes doivent emprunter des vésicules plus lentes qui leur permettent de compenser exactement le flux des citernes4. Ainsi, les vésicules qui bourgeonnent du RE seraient des «!précurseurs!» de citernes, qui fusionnent entre eux pour former une nouvelle citerne, et les citernes disparaissent à la face trans, étape finale du processus de maturation, après une phase cruciale de tri des cargos, en se fragmentant en vésicules contenant différents cargos destinés à différents compartiments.
Des études reposant sur des méthodes identiques mais utilisées dans des laboratoires différents ont conclu formellement pour l’une ou l’autre hypothèse. Ces méthodes consistent à immuno-localiser des cargos et des protéines résidentes de l’appareil de Golgi par microscopie électronique dans les citernes et les vésicules qui les bordent. L’argument de base de ces études est que selon le modèle de transport vésiculaire, les cargos (antérogrades par exemple) devraient se trouver essentiellement au sein de vésicules qui bordent les citernes plutôt que dans les citernes, tandis que des protéines résidentes devraient être majoritairement présentes dans les citernes plutôt que dans les vésicules péri-golgiennes (Orci et al. 2000!; Martinez-Menarguez et al. 2001!; Cosson et al. 2002). Dans le cas du modèle de maturation des citernes, le contraire devrait être observé!: les cargos antérogrades devraient être essentiellement présents dans les citernes et les protéines résidentes dans les vésicules. En fait, cet argument n’est pas tout à fait correct, tout dépend de facteurs cinétiques, tels que le «!temps de vie!» des vésicules, probablement lui-même relié au flux membranaire dans les cellules (l’intensité de la sécrétion par exemple, qui dépend énormément du type cellulaire). Par exemple, dans la cadre du transport vésiculaire, si les vésicules qui transportent un cargo antérograde fusionnent très rapidement après leur bourgeonnement, alors le cargo antérograde peut très bien être majoritairement et même quasi-exclusivement distribué dans les citernes. Cette hypothèse de temps de vie très court est très plausible dans le cas de VSV-G (la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire bovine, VSV), cargo antérograde presque systématiquement choisi, une protéine virale qui semble capable d’interagir avec la machinerie de transport (et peut-être de la modifier) de façon très efficace pour être secrétée très rapidement (voir I.A.10.). De même, dans le cadre du modèle de maturation des citernes, si le temps de vie des vésicules contenant les protéines résidentes est très court, ces protéines peuvent très bien être essentiellement distribuées dans les citernes (les études initiales de localisation des enzymes de glyclolysation par microscopie électronique ont d’ailleurs conclu que celles-ci sont essentiellement présentes dans les citernes, et cette localisation permet de définir les sous-compartiments de la voie de biosynthèse-sécrétion). Clairement, une simulation numérique permettrait de mettre en lumière les facteurs cinétiques-clés, et de caractériser quelles distributions à l’équilibre permettent réellement de trancher pour l’un ou l’autre des modèles.
Une approche alternative a été initiée dans le groupe d’A. Luini qui consiste à étudier le transport de cargos de taille beaucoup plus grande que celle des vésicules qui bordent les citernes. Ces premières expériences (Bonfanti et al. 1998) et les suivantes (Mironov et al. 2001) menées dans ce groupe ont montré que ces cargos géants étaient normalement secrétés et présents dans les citernes uniquement, ce qui plaide en faveur d’un modèle d’appareil de Golgi en maturation. A nouveau le même type d’expérience réalisée par un autre groupe a conclu à l’existence de vésicules géantes capables de prendre en charge ces cargos et donc favorisait le modèle vésiculaire (Volchuk et al. 2000).
Les deux modèles ne sont pas strictement exclusifs en réalité, on peut imaginer que des vésicules circulent dans les deux sens entre des citernes qui progressent, pourvu que ces vésicules contiennent le bon cargo. Par exemple, il est possible que les citernes maturent et progressent dans le sens antérograde, mais que certains cargos antérogrades «!rapides!» tels que VSV-G empruntent une voie vésiculaire plus rapide5, parallèle à celle du flux des citernes (passant de citerne en citerne et y rencontrant les enzymes de modification, VSV-G est en effet glycosylée lors de son transport antérograde). L’existence de processus de sauvetage de cargos après une erreur de tri permet aussi par exemple de justifier la présence de protéines résidentes dans les citernes!: si celles-ci sont accidentellement incorporées dans des vésicules de transport dans une direction donnée, elles se retrouvent dans une citerne trop distale ou proximale, et il doit exister des mécanismes pour transporter ces protéines résidentes dans la direction opposée pour réparer cette erreur de tri, utilisant par exemple des vésicules circulant dans cette direction opposée.
Approches protéomiques de la machinerie du tranport
Le scénario du transport vésiculaire a été considérablement détaillé et approfondi ces dernières années, mais plusieurs points restent obscurs, en particulier les transitions entre les étapes assurées par les acteurs-clés déjà identifiés. Probablement, la connaissance de cette machinerie de transport n’est pas encore exhaustive, et il reste de nombreuses autres molécules à identifier et caractériser, qui joueraient des rôles au niveau de ces étapes déjà connues ou de l’enchaînement entre ces étapes. Avec le développement des bases de données génomiques, les approches de type protéomique ont vu le jour. L’analyse par spectrométrie de masse, par exemple, permet de dresser un panorama de l’ensemble des protéines associées à un organite donné que l’on sait purifier, du moins celles qui sont suffisamment abondantes pour être micro-séquencées et dont la séquence est présente dans les bases de données génomiques. Cette méthode a été appliquée à l’appareil de Golgi purifié à partir de foie ou de glande mammaire de rat (Taylor et al. 2000!; Wu, Taylor et al. 2000!; Wu, Yates et al. 2000!; Bell et al. 2001!; Wu et al. 2003). Ces études ont permis de confirmer l’identité de certaines protéines golgiennes et d’en identifier de nouvelles, mais sont limitées pour plusieurs raisons. L’appareil de Golgi purifié n’est pas pur à 100%, et quelques «!contaminants!» ont été séquencés. Le problème est qu’il n’y a pas de moyen simple de dire si une protéine «!surprenante!» est un contaminant ou un nouveau composant golgien, ce que seule une étude complète de la protéine en question peut trancher. D’autre part, on ne sait purifier efficacement l’appareil de Golgi en grande quantité qu’à partir de foie (ou d’autres tissus destinés à secréter énormément), et souvent les protéines séquencées proviennent d’animaux (constituant une source illimitée de tels tissus frais) dont le génome n’est pas complètement séquencé à l’heure actuelle, ce qui complique l’identification de ces protéines. Enfin et surtout, il est difficile de distinguer a priori les protéines luminales telles les enzymes, les chaperones, des protéines de la machinerie de transport, essentiellement cytosoliques. La liste obtenue ne permet de classer les protéines golgiennes que selon leur taille et les familles déjà définies par des études fonctionnelles antérieures.
Petites GTPases!: définitions et généralités
Il existe deux familles de GTPases, les protéines Arfs (6 membres connus chez les mammifères) et les protéines Rabs (60 membres connus chez les mammifères) (Chavrier et Goud 1999), en plus de la GTPase Sar1, qui contrôlent l’ensemble des voies de transport intracellulaire. Chacune de ces GTPases est associée à un compartiment donné et y régule une voie particulière. L’étude de ces GTPases, la caractérisation de leurs protéines régulatrices (voir ci-dessous), de leurs effecteurs, sont des points centraux de la compréhension globale du trafic membranaire chez les eucaryotes.
Plus généralement, les petites GTPases de la superfamille Ras sont les régulateurs-clés de nombreux processus cellulaires (Valencia et al. 1991!; Dasso 2002; Etienne-Manneville et Hall 2002!; Do Heo et Meyer 2003!). La sous-unité des GTPases hétérotrimériques utilise la même stratégie pour contrôler certaines cascades de signalisation. Ces GTPases oscillent entre deux états, l’un lié au GTP et l’autre au GDP, auxquels correspondent deux conformations moléculaires bien distinctes et deux jeux d’interacteurs bien distincts (Bourne et al. 1990!; Bourne et al. 1991). De plus, dans le cas des GTPases Rabs, Arfs et Sar, un cycle d’association/dissociation aux membranes est couplé au cycle GDP-GTP!: l’hypothèse communément admise est que ces GTPases sont essentiellement cytosoliques sous forme GDP et associées aux membranes sous forme GTP grâce à une modification lipidique (Chavrier et Goud 1999). Les effecteurs, protéines effectrices spécifiques de chaque GTPase, lient les GTPases sous forme GTP. Dans le cas des Rabs, il existe des chaperones (GDP dissociation inhibitor, GDI) spécifiques de l’état GDP. De plus, en particulier dans le cas des Rabs, le passage d’un état à l’autre n’est pas toujours spontané (les cinétiques de passage spontané sont trop lentes) et nécessite une catalyse assurée par des protéines régulatrices, les facteurs d’échange (guanosine exchange factor, GEF, passage GDP-GTP) et les protéines activatrices (GTPase activating proteins, GAP, passage GTP-GDP). Si ce mode de fonctionnement est bien connu depuis quelques années, la coordination entre la fixation des effecteurs est l’action des protéines GAP par exemple, et même la possibilité pour une GTPase de recruter plusieurs effecteurs simultanément, ne sont pas encore comprises.
Des mutants ponctuels de la GTPase Ras, bloqués dans un état conformationnel de type GDP ou GTP, ont été caractérisés. Des mutations similaires des petites GTPases génèrent très souvent des protéines bloquées dans un état GDP ou GTP. L’utilisation de ces mutants a été systématiquement utilisée en tant que dominants négatifs et positifs pour étudier la fonction de ces GTPases, déterminer la structure moléculaire des deux conformations, ou bien pour identifier des partenaires spécifiques de chacun des deux états (double-hybride, GST-pull down).
GTPases du transport
Les familles Sar et Arf ont une fonction de régulation des étapes de tri des cargos et de bourgeonnement des vésicules (Chavrier et Goud 1999). Elles ont pour effecteur les manteaux vésiculaires (respectivement COPII et COPI), qui interagissent avec les cargos (et donc participent directement au tri) et déforment les membranes (produisent des vésicules à partir de liposomes in vitro). Les GTPases de la famille Arf, en particulier Arf1, possèdent de nombreux effecteurs supplémentaires, comme par exemple des enzymes de modification des lipides (dont l’action module l’élasticité de courbure des membranes et la capacité à bourgeonner, en plus de permettre le recrutement de certains facteurs se liant aux lipides modifiés).
La famille des GTPases Rab est de loin la plus large, et ces différentes GTPases semblent réguler le transport à de nombreuses étapes, du bourgeonnement à la fusion (Zerial et McBride 2001). Elles possèdent des effecteurs de nature très diverses!: des enzymes de modification des lipides, des moteurs moléculaires, des facteurs d’arrimage, des SNAREs (et NSF) …
L’état nucléotidique de ces GTPases lors des différentes phases du transport est en fait mal connu, l’hypothèse de base de bijection entre la fraction cysotolique et la forme GDP d’une part et la fraction membranaire et la forme GTP d’autre part n’a pas été testée du moins systématiquement. Par exemple, Rab5 semble pouvoir exister en grande proportion dans l’état GDP associé aux membranes (Stahl et al. 1994). La fréquence du cycle nucléotidique et celle du cycle d’association/dissociation membranaire n’ont pas été non plus systématiquement caractérisées.
SNAREs
La famille des SNAREs, conservée dans tous les organismes eucaryotes, est constituée de protéines transmembranaires associées aux membranes d’un compartiment accepteur donné ou des vésicules qui sont destinées à fusionner avec un compartiment donné. Nous avons vu que leur rôle dans le transport a été identifié grâce au système in vitro de transport intra-Golgi. Leur rôle a aussi été mis en évidence dans l’étude de la sécrétion de neurotransmetteurs (Schiavo et al. 1992), des études génétiques chez D. melanogaster (Schulze et al. 1995), et leur conservation chez les eucaryotes a été révélée par la découverte d’homologues chez S. cerevisiae (Bennett et Scheller 1993). Elles sont classées en tSNAREs (target SNAREs, présentes sur le compartiment-cible) et vSNAREs (vesicle SNAREs, présentes sur les vésicules). Lorsque ces protéines sont présentées sur des liposomes artificiels in vitro, seules certaines combinaisons de quatre SNAREs (trois tSNAREs et une vSNAREs) sont capables de former un complexe en trans11 très stable (grâce à leur motif SNARE en hélice) qui rapproche les membranes, et peut-être catalyse la fusion des membranes ainsi rapprochées12 (McNew et al. 2000). Comme je l’ai précisé dans le paragraphe sur la machinerie du transport golgien, la sensibilité du transport intra-Golgi in vitro au NEM a conduit à la découverte de l’ATPase NSF (Block et al. 1988!; Malhotra et al. 1988!; Beckers et al. 1989), puis à celles des SNAREs (Wiedman et al. 1989!; Clary et al. 1990!; Söllner et al. 1993). La fonction générale de NSF (nous verrons plus loin que d’autres fonctions dans la dynamique membranaire sont proposées) serait de catalyser le désappariement des SNAREs juste après l’événement de fusion13, afin de recycler les SNAREs en vue de leur prochain appariement. NSF serait sous sa forme liée à l’ATP pour interagir avec les SNAREs (par l’intermédiaire de cofacteurs, les SNAPs), et l’hydrolyse de l’ATP serait couplée au désappariement des SNAREs. Les SNAREs (en conjonction avec NSF et les SNAPs) constituent la machinerie déterminant la spécificité de la fusion membranaire, à une étape très proche de ou correspondant à l’événement de fusion lui-même (McNew et al. 2000).
Une fonction de la matrice golgienne dans le transport golgien
Le rôle des protéines de la matrice golgienne dans l’établissement et le maintien de la structure de l’appareil de Golgi reste à démontrer. Des expériences de RNAi (R N A interference) ont montré que la déplétion de certaines d’entre elles induit une fragmentation de l’empilement golgien en structures dispersées dans le cytoplasme et affecte le transport golgien (Short et al. 2001!; Diao et al. 2003). Une étude récente a été effectuée à l’aide d’une lignée de cellules CHO présentant un défaut thermo-sensible de structure golgienne accompagné d’un blocage de la sécrétion (Vasile et al. 2003). Ce phénotype thermo-sensible semble être dû à une perturbation de l’expression de GM130. En fait GM130 est indétectable dans ces cellules à toute température tandis que le défaut de structure et fonction de l’appareil de Golgi survient à 39,5°C et pas à 34°C. Le phénotype est réverté par expression de GM130 exogène, ce qui confirme son rôle dans la structure et la fonction de l’appareil de Golgi à 39,5°C bien qu’à 34°C ce rôle soit dispensable. Le phénotype est aussi réverté par surexpresssion de NSF (le niveau endogène de NSF est normal dans ces cellules). Cette interaction génétique de GM130 et de la machinerie NFS/SNAREs assurant la spécificité de fusion doit maintenant être comprise en termes d’interactions moléculaires, mais ce résultat rappelle les mécanismes moléculaires de réassemblage de l’appareil de Golgi en fin de mitose proposés par le groupe de G. Warren (voir I.B.2.e.). Mais ces effets de la déplétion de protéines de la matrice sur la morphologie de l’appareil de Golgi ne sont pas spécifiques à ces protéines, des phénotypes comparables sont observés lors de la déplétion de Rabs par exemple (comme Rab2, F. Barr, communication personnelle).
Le rôle de ces protéines dans le transport golgien, en particulier dans la voie RE-Golgi, a été mis en évidence par des inhibitions observées à des stades successifs du transport de VSV-G à l’aide d’anticorps dirigés contre des protéines de la matrice (p115, GM130, Giantine) et des peptides inhibant leurs interactions mutuelles, dans un système semi-in vitro et in vivo. Ces travaux suggèrent que ces trois protéines interviennent donc dans des étapes successives de ce transport (Alvarez et al. 1999!; Seemann, Jokitalo et Warren 2000!; Alvarez et al. 2001). Ces trois protéines interagissent au moins deux à deux (p115-GM130, p115-Giantine), et d’après G. Warren forment même ensemble un complexe de facteurs d’arrimage (Lesa et al. 2000). Comme nous le verrons, c’est en étudiant la modulation du trafic intervenant en mitose (et les phosphorylations mitotiques de ces protéines affectant leurs interactions) que leur rôle dans l’arrimage des membranes golgiennes (avant leur amarrage assuré par les SNARES) a été démontré de la manière la plus convaincante (voir I.B.2.).
Un schéma général du mécanisme utilisé par les protéines de la matrice golgienne pour réguler le transport a été récemment proposé par F. Barr. Il était déjà connu que p115 interagit avec Rab1 dans son état lié au GTP, indiquant que p115 est un effecteur de la GTPase Rab1 qui régule le transport entre les sites de sortie du RE et l’appareil de Golgi21 (Allan et al. 2000). Certaines golgines, de fonction dans le transport pour leur part inconnue, porteraient dans leur domaine assurant leur association aux membranes de l’appareil de Golgi une séquence consensus d’interaction avec Rab6 nommé GRIP (Barr 1999!; Kjer-Nielsen et al. 1999; Munro et Nichols 1999!). Deux autres protéines de la matrice golgienne, telles GM130 et Golgine 45, sont cytosoliques et possèdent des récepteurs sur les membranes golgiennes, GRASP65 et GRASP55, deux protéines qui sont myristoylées afin d’interagir avec les membranes et qui sont aussi considérées comme faisant partie de la matrice golgienne. Les groupes de W. Balch et F. Barr ont montré que ces complexes golgine-GRASP se comportent aussi comme des effecteurs des GTPases régulatrices du transport Rab1 et Rab222 (Moyer et al. 2001!; Short et al. 2001). Très récemment, la protéine Golgine 84, de structure très similaire à celle de la Giantine (court segment transmembranaire C-terminal et masse cytosolique essentiellement de type hélice enroulée), et tout comme elle redistribuée dans le RE par la BFA, a aussi été caractérisée en tant qu’effecteur de Rab1 (Diao et al. 2003!; Satoh et al. 2003). La connexion entre la matrice golgienne et la famille des Rabs confirment l’idée d’une fonction de ces protéines de matrice dans le transport, en tant que facteurs d’arrimage.
Différentes voies de transport entre le RE, l’appareil de Golgi, et la membrane plasmique
Comme je l’ai précisé au début de cette partie Introduction, l’appareil de Golgi est au carrefour de très nombreuses voies de transport intracellulaire. Je vais ici résumer les mécanismes moléculaires et la caractérisation de certaines de ces voies, qui ont comme point de départ ou d’arrivée l’appareil de Golgi, et que j’ai étudié au cours de ma thèse!: la voie de biosynthèse-sécrétion (RE-Golgi-membrane plasmique), dite antérograde, la voie rétrograde correspondante (membrane plasmique-Golgi-RE), ainsi que le recyclage endosomal qui semble connecté à la fonction du TGN.
biosynthèse-sécrétion!: deuxième étape, le compartiment intermédiaire
L’étape suivante de la voie de biosynthèse-sécrétion voit les structures bourgeonnées à partir des sites de sortie du RE perdre leur manteau COPII et de manière concomitante être recouvertes du manteau COPI, effecteur de la GTPase Arf1, elle-même recrutée sur les membranes et activée à cette étape (Figure 5). La coordination entre ces deux systèmes GTPase/COP est mal comprise. Seules certaines protéines de la famille des p24 semblent posséder la capacité de lier directement COPI et COPII (Dominguez et al. 1998). La GTPase Rab1 intervient elle aussi à cette étape, elle se lie aux membranes COPII-positives sous forme active avec ses protéines effectrices qui sont les facteurs d’arrimage p115 et GM130, et un complexe SNARE qui permettra la fusion de ces vésicules avec le cis-Golgi (Allan et al. 2000).
Transport rétrograde Golgi-RE
Des signaux de rétention des protéines au RE ont été identifiés par analyse de séquence de protéines résidentes du RE, comme le signal C-terminal dylisine KKXX (Jackson et al. 1990!; Jackson et al. 1993) ou la séquence KDEL (Munro et Pelham 1987). Nous avons vu que ce signal KKXX interagit avec COPI, or la localisation de COPI est en aval du RE le long de la voie de biosynthèse-sécrétion. Par conséquent, ces cargos maintenus dans le RE doivent au moins par accident échapper au RE et y être efficacement transportés en retour. En plus de l’effet de la drogue BFA, d’autres données en faveur de l’existence d’un tel transport rétrograde Golgi-RE constitutif. Elles sont issues d’études du trafic RE-Golgi lors de la dépolymérisation des microtubules et l’effet de mutants dominants négatifs de Sar1.
Lorsqu’on dépolymérise les microtubules de cellules animales, les enzymes de l’appareil de Golgi sont relocalisées au voisinage des sites de sortie du RE sur des mini-empilements golgiens fonctionnels pour le transport, même en l’absence de néo-synthèse protéique (bloquée par la cycloheximide). Ceci suggère que ces membranes golgiennes (les enzymes sont transmembranaires) ont été transportées de façon rétrograde et indépendante des microtubules vers le RE, ont ré-émergé aux sites de sortie du RE, se sont arrangées en empilements localement mais n’ont pas pu migrer vers le centrosome en l’absence de microtubules (ce phénomène a été observé par microscopie de fluorescence in vivo) (Cole et al. 1996!; Storrie et al. 1998).
De même, le blocage de la sortie du RE par un mutant dominant négatif de Sar1 bloqué sous sa forme GDP entraîne la redistribution complète des composants golgiens dans le RE (cette fois-ci même l’accumulation aux sites de sortie du RE est bloquée) (Miles et al. 2001!; Ward et al. 2001). En plus de Arf1, une autre GTPase a été proposée en tant que régulateur de ce transport rétrograde. La GTPase Rab6 est présente sur l’appareil de Golgi, plutôt sur sa face trans (Martinez et al. 1994). Elle régule le transport golgien, la surexpression de Rab6 bloqué sous sa conformation GTP entraîne la relocalisation des enzymes résidentes golgiennes dans le RE (Martinez et al. 1997). Cette GTPase régule donc le transport dit rétrograde, de l’appareil de Golgi vers le RE, comme celui illustré par la BFA (sans pour autant qu’un rôle de Rab6 dans l’effet BFA ait été démontré).
L’observation de Rab6 couplé à la GFP dans des cellules animales par microscopie de fluorescence in vivo révèle d’ailleurs que GFP-Rab6 est non seulement localisée à l’appareil de Golgi mais aussi présente sur des tubes parfois très longs qui émanent de l’appareil de Golgi, se déplacent le long des microtubules et semblent fusionner avec le RE en périphérie (White et al. 1999). La protéine Rabkinésine6 (Echard et al. 1998), apparentée à la super-famille des kinésines, moteurs se déplaçant sur les microtubules vers leur extrémité «!plus!» et donc vers la périphérie, est localisée à l’appareil de Golgi (quoique cette localisation soit désormais débattue (Hill et al. 2000)) et interagit avec Rab6 (par double-hybride), ce qui renforce cette hypothèse. En fait, Rab6 existe sous deux isoformes ubiquitaires A et A’35, issues de l’épissage alternatif d’un même gène et qui ne diffère que par trois acides aminés et donc partagent l’essentiel de leurs partenaires, mais seulement Rab6A interagit avec Rabkinésine6 (Echard et al. 2000). Un argument supplémentaire pour soutenir le modèle ci-dessus est que Rab6A est plus efficace que Rab6A’ pour induire la relocalisation des enzymes résidentes de l’appareil de Golgi dans le RE (voir aussi la partie Résultats), ce qui s’expliquerait par l’interaction différentielle de la kinésine avec les deux isoformes. La micro-injection de l’anticorps EAGE dirigé contreCOP (protéine du manteau COPI), ou la surexpression d’un mutant de Arf1 bloqué dans sa conformation GTP, figent le manteau COPI sur les membranes et bloquent le transport dépendant de COPI Golgi-RE de la lectine du compartiment intermédiaire ERGIC53 (qui contient un signal KKXX) et du récepteur du 35 et une troisième spécifique des neurones Rab6B signal KDEL (KDELr) (Girod et al. 1999). Cette expérience de micro-injection n’inhibe pourtant pas le transport rétrograde constitutif des enzymes golgiennes vers le RE36. En revanche le transport des enzymes est bloqué par la surexpression d’un mutant dominant négatif de Rab6 (bloqué sous sa forme GDP), celles-ci sont séquestrées dans l’appareil de Golgi tandis que ERGIC53 et KDELr sont transportés normalement de l’appareil de Golgi au RE.
Il existerait donc deux voies rétrogrades Golgi-RE, une contrôlée par Arf1/COPI qui transporte certains cargos comme ERGIC53 et KDELr (et qui serait inhibée par l’association irréversible de Arf1/COPI aux membranes), une seconde contrôlée par Rab6 qui transporte les enzymes golgiennes, ainsi que la sous-unité B de la toxine de Shiga dans les cellules HeLa (qui serait inhibée cette fois par le déplacement de Rab6 des membranes)37 (Storrie et al. 2000). La différence entre les mécanismes d’inhibition des voies Arf1 et Rab6 provient peut-être d’une différence fondamentale du mode de fonctionnement de ces deux types de GTPases, à moins que la directionnalité de ces deux voies soit encore mal comprise. Notons aussi que dans le système de tranport in vitro (Happe et Weidman 1998), la déplétion de Arf1/COPI n’inhibe pas le transport intra-Golgi. De plus, des allèles thermo-sensibles de COPI n’inhibent pas le transport de certains cargos chez S. cerevisiae depuis le RE vers des compartiments post-golgiens (le milieu extracellulaire, la vacuole) (Gaynor et Emr 1997). Ceci signifie qu’il existe une voie de transport COPI-indépendante, ou bien que le système est capable de se ré-adapater au moins en partie en réponse au blocage par déplétion (in vitro) ou l’association irréversible aux membranes (in vivo) de COPI.
Transport rétrograde endosomes précoces-TGN
Comme nous l’avons vu en introduction, certaines protéines progressent selon une voie de transport rétrograde le long de la voie de voie de biosynthèse-sécrétion. Cette voie permet par exemple à TGN38 et certaines toxines de progresser entre la membrane plasmique et le TGN sans passer par les endosomes tardifs (Mallard et al. 1998!; Nichols et al. 2001). En réalité, Rab6 semble contrôler le transport rétrograde de cargos comme la sous-unité B toxine de Shiga depuis les endosomes précoces jusqu’à l’appareil de Golgi puis au RE (Mallard et al. 2002). En effet, des anticorps anti-Rab6 ou le mutant de Rab6A’ bloqué dans l’état GDP inhibent le transport de ce cargo dans des cellules pré-perméabilisées depuis les endosomes précoces (définis ici par un bloc à 19,5°C) jusqu’au TGN (défini par la présence de sulfotransférase). L’expression d’un mutant de Rab6A’ bloqué sous sa forme GDP a un effet similaire cette fois dans des cellules intactes. Nous verrons dans la partie Résultats que ce mutant de Rab6A’ déplace très efficacement les deux isoformes de Rab6 des membranes (Nizak et al. 2003).
Les isoformes de Rab6 A et A’ sont localisés par immunofluorescence uniquement sur l’appareil de Golgi et de petites structures (1-2 µm) dispersées dans le cytoplasme (les anticorps anti-Rab6 connus ne distinguent pas les deux isoformes). GFP-Rab6 (A ou A’) surexprimé est détecté sur l’appareil de Golgi, des tubules membranaires émanant de l’appareil de Golgi qui se déplacent le long des microtubules vers la périphérie et parfois vers l’appareil de Golgi, et si la surexpression est assez forte GFP-Rab6 est localisé au RE (White et al. 1999). Rab6A et A’ surexprimés simultanément (en fusion avec des protéines fluorescentes différentes) colocalisent parfaitement sur l’appareil de Golgi et ces tubules38. Donc Rab6 serait présent sur le compartiment accepteur de l’étape endosomes-Golgi et le compartiment donneur de l’étape Golgi-RE, éventuellement sur les intermédiaires de transport et le compartiment accepteur de cette voie Golgi-RE quand il est surexprimé, mais jamais sur les endosomes.
Les effecteurs connus de Rab6 sont soit des moteurs/protéines associées aux moteurs se déplaçant sur les microtubules, soit des facteurs d’arrimage. Parmi les protéines impliquées dans un mouvement basé sur les microtubules, Rabkinésine6 interagit avec Rab6A uniquement (Echard et al. 1998!; Echard et al. 2000), et a une fonction probablement essentiellement mitotique (Hill et al. 2000; Fontijn et al. 2001!), BicaudalD1 et 2 et p150glued régulent la fonction de moteurs dynéine et kinésine dans le mouvement des membranes golgiennes en interphase (Matanis et al. 2002; Short et al. 2002!). Les rôles de Bicaudal (Hoogenraad et al. 2001) et surtout du complexe dynactine (King et Schroer 2000) contenant p150glued dans la processivité du moteur de bout moins de type dynéine sont bien connus. Des données récentes suggèrent que p150glued est capable de lier non-simultanément une dynéine et une kinésine présentes sur la même membrane et ainsi réguler le mouvement des membranes aussi bien vers le bout plus que vers le bout moins des microtubules (Roghi et Allan 1999!.
Deacon et al. 2003). Ceci pourrait expliquer les mouvement bidirectionnels des tubes GFP-Rab6-positifs39 (White et al. 1999!; Matanis et al. 2002).
Des études effectuées chez S. cerevisiae ont montré que des facteurs d’arrimage effecteurs de l’homologue de Rab6, YPT6, forment le complexe GARP/VFT (VPS51/52/53/54). Ce complexe interagit avec la SNARE du TGN Tlg1p (par l’intermédiaire de VPS51) et YPT6 contrôle ainsi le transport endosomes-TGN40 (Siniossoglou et Pelham 2001!; Siniossoglou et Pelham 2002). Il est possible que YPT6 régule le transport rétrograde Golgi-RE, et que les fonctions de YPT6 et Rab6 dans le transport intracellulaire soient très similaires (Luo et Gallwitz 2003). Il existe des homologues des composants du complexe VFT et de la SNARE Tlg1p chez les mammifères, et des données préliminaires indiquent que l’interaction entre ce complexe et Rab6 sont bel et bien conservée (Données non-publiées obtenues au laboratoire).
Les rôles des deux isoformes de Rab6 dans les cellules de mammifères est difficile à comprendre. La quasi-identité des séquences protéiques de Rab6A et A’ implique qu’ils partagent pratiquement tous leurs partenaires, et possèdent en partie des fonctions similaires. Il existe cependant des partenaires spécifiques de chacune de ces deux isoformes (Rabkinésine6 qui n’interagit qu’avec Rab6A, et probablement d’autres!: voir la partie Résultats), et ceci suffirait à leur conférer deux fonctions bien distinctes. Rab6A serait par exemple spécifiquement impliqué dans le contrôle mitotique. La description récente des effets de mutants de l’homologue de Rab6 chez le parasite T. gondii suggère la conservation de la fonction de transport rétrograde vers le trans-Golgi, et aussi une fonction dans l’accomplissement de la mitose et la cytocinèse (Stedman et al. 2003).
La sous-unité B de la toxine de Shiga suit donc depuis la surface des cellules une voie de transport rétrograde contrôlée par Rab6 qui lui permet d’atteindre l’appareil de Golgi puis le RE. Sa localisation dans des domaines lipidiques particuliers (insolubles dans certains détergents non-ioniques comme le Triton X100) lui permettrait d’échapper à la voie de dégradation classique et de parvenir à l’appareil de Golgi depuis les endosomes précoces, même si le lien entre l’association de son récepteur Gb3 aux domaines lipidiques «!micro-domaines lipidiques!» et le rôle de Rab6 n’a pas été élucidé (Falguieres et al. 2001).
Par microscopie optique, éventuellement in vivo
L’observation de marqueurs de l’appareil de Golgi par microscopie optique montre que les membranes golgiennes sont fragmentées à partir de la prophase et fortement dispersées dans le cytoplasme en métaphase, et cette localisation diffuse devient souvent indistinguable de marqueurs cytosoliques ou d’autres organites comme le RE (Zaal et al. 1999). En fait, pour certains marqueurs, on observe en métaphase des structures clairement distinctes d’un marquage diffus de type RE, parfois alignées sur les microtubules du fuseau mitotique (Shima et al. 1997!; Shima et al. 1998!; Jokitalo et al. 2001), et dont le nombre varie grandement en fonction de la lignée cellulaire. Une différence essentielle entre la localisation des marqueurs du RE et celle des marqueurs de l’appareil de Golgi est qu’en métaphase, les marqueurs du RE sont localisés uniformément à travers le cytoplasme mais sont exclus de la région du fuseau mitotique, tandis que les marqueurs golgiens sont répartis uniformément y compris dans cette région et uniquement exclus du volume occupé par les chromosomes. Donc une partie au moins de ces marqueurs golgiens, en particulier des enzymes et des protéines de matrice transmembranaires (et donc une partie des membranes golgiennes) ne sont pas redistribués dans le RE.
Par microscopie de fluorescence de cellules vivantes, différentes constructions basées sur des enzymes golgiennes (leur segment transmembranaire, nécessaire et suffisant pour assurer la localisation correcte à l’équilibre) en fusion avec la GFP ont été exprimées dans des cellules animales et observées au cours de la mitose. Les deux situations extrêmes ont été caractérisées. Un marqueur golgien est présent sur des structures que l’on peut suivre tout au long de la mitose, et qui s’associent aux bras du fuseau mitotique lors de leur équipartition entre les cellules-filles (Shima et al. 1998). En revanche, un autre marqueur (exprimé dans un autre type cellulaire) est clairement re-distribué dans le RE en métaphase (Zaal et al. 1999), puisque son coefficient de diffusion apparent mesuré par des expériences de photoblanchiment diffère de celui d’un analogue fluorescent de lipide golgien!: ces deux coefficients de diffusion devraient coïncider si les deux marqueurs fluorescents étaient présents sur de vésicules de petite taille, ce serait celui de la marche aléatoire des vésicules dans le cytoplasme (Figure 9). Mais il est probable que la surexpression du marqueur et surtout des problèmes de repliement correct soient en partie responsables de l’accumulation de ce marqueur dans le RE (Jokitalo et al. 2001). De plus la méthode désormais classique de mesure des coefficients de diffusion des protéines dans les membranes d’organites de grande taille pose problème!: elle repose sur l’hypothèse de diffusion brownienne sur un espace bidimensionnel, alors qu’en réalité on observe la marche aléatoire biaisée de molécules (il existe des domaines dans les membranes qui les piègent ou les repoussent) sur une surface de dimension fractale inconnue projetée sur un plan d’observation. Il n’existe à ma connaissance aucune preuve (ou même une tentative de démonstration) que ces diffusions sont browniennes, et donc la signification réelle de ces coefficients de diffusion est très discutable42.
|
Table des matières
I. INTRODUCTION
I.A. Transport intracellulaire et appareil de Golgi
I.A.1. La complexité du réseau des voies de transport intracellulaire
I.A.2. Fonctions de l’appareil de Golgi
I.A.3. Structure de l’appareil de Golgi
I.A.4. Deux modèles pour le transport intra-golgien!: vésiculaire ou maturation des citernes
I.A.5. Machinerie du transport golgien
I.A.5.a. Physique des membranes et transport
I.A.5.b. Les différentes familles de protéines de la machinerie du transport
I.A.5.c. Approches protéomiques de la machinerie du tranport
I.A.6. Petites GTPases
I.A.6.a. Petites GTPases!: définitions et généralités
I.A.6.b. GTPases du transport
I.A.7. SNAREs
I.A.8. Facteurs d’arrimage
I.A.9. Périphérie de l’appareil de Golgi!: matrice golgienne, facteurs d’arrimage
I.A.9.a. Matrice structurale
I.A.9.b. Matrice fonctionnelle
I.A.9.c. Golgines
I.A.9.d. GRASPs
I.A.9.e. Une fonction de la matrice golgienne dans le transport golgien
I.A.10. Différentes voies de transport entre le RE, l’appareil de Golgi, et la membrane plasmique
I.A.10.a. biosynthèse-sécrétion!: première étape, export depuis le RE
I.A.10.b. biosynthèse-sécrétion!: deuxième étape, le compartiment intermédiaire
I.A.10.b.i. Le manteau COPI
I.A.10.b.ii. Dynamique de Arf1/COPI observées par microscopie de fluorescence in vivo
I.A.10.b.iii. Bréfeldine A
I.A.10.c. Transport rétrograde Golgi-RE
I.A.10.d. Transport rétrograde endosomes précoces-TGN
I.B. Mitose et appareil de Golgi
I.B.1. Héritage des organites
I.B.2. Trafic et mitose, cas de l’appareil de Golgi
I.B.2.a. Problématique
I.B.2.b. Héritage de l’appareil de Golgi
I.B.2.c. Observations directes microscopiques et biochimiques
I.B.2.c.i. Par microscopie optique, éventuellement in vivo
I.B.2.c.ii. Par microscopie électronique
I.B.2.c.iii. Par des méthodes biochimiques
I.B.2.d. Transport depuis et vers l’appareil de Golgi en mitose
I.B.2.d.i. Rétrograde Golgi-RE forcé en début de mitose
I.B.2.d.ii. Rétrograde Golgi-RE inhibé en début de mitose
I.B.2.d.iii. Antérograde RE-Golgi inhibé en fin de mitose
I.B.2.e. Mécanismes moléculaires!: systèmes in vitro et semi-in vitro
I.B.2.f. Mécanismes de réassemblage
I.B.2.g. Mécanismes de désassemblage
I.B.3. Appareil de Golgi et contrôle mitotique
I.B.4. Trafic et cytocinèse
I.C. Antibody Phage Display
I.C.1. Principe
I.C.2. Cas particulier du Phage Display d’anticorps
I.C.2.a. ScFv ou Fab!?
I.C.2.b. Importance des CDRs
I.C.2.c. Banques
I.C.3. Pratique!: présentation à la surface des phages, sélection, élution
I.C.3.a. Choix d’une protéine de surface du phage filamenteux M13!: pIII, pVI, pVIII, pIX
I.C.3.b. Phage ou phagemide!?
I.C.3.c. Sélection in vitro
I.C.3.c.i. Cycler la sélection!: pour «!dépasser!» le «!bruit de fond!»
I.C.3.d. Identification des clones positifs
I.C.4. Nouveaux anticorps, nouvelles applications
I.C.4.a. Sélection in vitro!: nouveaux anticorps
I.C.4.a.i. Anticorps contre des protéines conservées ou toxiques pour l’animal
I.C.4.a.ii. Anticorps contre des conformations, des complexes, des organites, des cellules, des tissus!: préservation de l’antigène lors de l’immunisation
I.C.4.a.iii. Antibody Phage Display et protéomique «!à haut débit!»
I.C.4.a.iv. Sélection «!alternée!» entre cycles, élution avec compétiteurs
I.C.4.a.v. «!Pathfinder!»!: isolation rapide de phage-anticorps dirigés contre l’environnement local de l’antigène immobilisé
I.C.4.a.vi. Sélection par double-hybride!: anticorps intracellulaires, ou intra-anticorps
I.C.4.b. Anticorps recombinants!: nouvelles applications
I.C.4.b.i. Anticorps versatiles
I.C.4.b.ii. Intra-anticorps
I.C.4.b.iii. Auto-anticorps pour l’immunothérapie
II. RESULTATS
II.A. Rab6A et Rab6A’
II.A.1. Introduction et Résultats
II.A.2. Discussion et Perspectives
II.B. Anticorps recombinants contre des fractions sub-cellulaires
II.B.1. Introduction
II.B.2. Résultats, Discussion et Perspectives
II.B.2.a. Autres organites
II.B.2.b. Matrice golgienne
II.C. Anticorps recombinants conformationnels
II.C.1. Introduction
II.C.2. Résultats, Discussion, Perspectives
II.C.2.a. Détection conformationnelle des GTPases
II.C.2.b. AA2, scFv anti-Rab6•GTP
II.C.2.c. Utilisation de AA2 pour suivre Rab6•GTP in vivo
II.D. Appareil de Golgi et mitose
II.D.1. Introduction
II.D.2. Résultats, Discussion
II.D.2.a. Deux modes d’héritage de l’appareil de Golgi en mitose
II.D.2.b. Trafic golgien et cytocinèse
II.E. Analyse de séquences protéiques à la recherche de motifs d’interaction avec COPII
II.F. Annexes techniques
II.F.1. Observation par microscopie de fluorescence de cellules vivantes
II.F.1.a. Microscopie classique
II.F.1.b. Microscopie confocale
II.F.1.c. Quantification de la dynamique intracellulaire par des méthodes de corrélation
II.F.2. Déplétion de protéines par Interférence ARN dans des cellules de mammifères
III. DISCUSSION
III.A. La Giantine et la définition d’une matrice golgienne
III.B. Intermédiaires de transport sphériques ou tubulaires
III.C. Héritage de l’appareil de Golgi au cours de la mitose
III.C.1. Mécanismes de désassemblage et réassemblage de l’appareil de Golgi!: un biais vers le point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique!?
III.C.2. Polémique sur le mode d’héritage de l’appareil de Golgi
III.C.3. Liens avec d’autres controverses dans le cadre du transport intracellulaire
III.D. Organisation en compartiments!: système statique en équilibre ou système dynamique hors équilibre!?
III.E. Perspectives de la technique d’Antibody Phage Display
IV. ANNEXE
V. BIBLIOGRAPHIE
Télécharger le rapport complet
