Nouvelles voies de biosynthèse dépendant des synthases de cyclodipeptides

Définition du cycle 2,5-dicétopipérazine

                Le noyau 2,5-dicétopipérazine est un hétérocycle à six atomes possédant deux fonctions lactames. Il peut également être défini comme un noyau pipérazine possédant deux fonctions cétones, placées en opposition aux positions 2 et 5. La structure générale des 2,5-dicétopipérazines est représentée (Figure 2). Lorsque la formation de ce cycle provient de la condensation de deux acides α-aminés, les 2,5- dicétopipérazines résultantes sont appelées cyclodipeptides ou dipeptides cycliques. La numérotation des atomes du cycle 2,5-dicétopipérazines est indiquée. Dans ce manuscrit, un cyclodipeptide formé à partir d’acides aminés protéinogéniques (de configuration L) est désigné par une nomenclature utilisant le code à trois lettres : cyclo(Xaa-Xaa). La stéréochimie des acides aminés de configuration D sera précisée en les faisant précéder de D et l’α-β-déshydrogénation de la chaîne latérale sera indiqué par ∆. Par ailleurs, les termes dicétopipérazines et 2,5-dicétopipérazines seront employés indifféremment dans la suite du manuscrit.

Conformation du cycle 2,5-dicétopipérazine

                      La conformation adoptée par le cycle dicétopipérazine dépend des forces extérieures s’appliquant sur ce cycle, de la présence de substituants et de la nature de ceux-ci. Le cycle non substitué (cyclo(Gly-Gly)) présente dans la plupart des cas observés (cristallographie aux rayons X36, RMN en solution37,38, analyse vibrationnelle et calcul par DFT39) une conformation plane, alors que des calculs ab initio et des spectres micro-onde suggèrent une conformation bateau préférentielle40. L’écart énergétique calculé entre les deux conformations étant faible (1.3-1.7 kcal/mol), il est probable que les forces s’appliquant sur le cycle, provenant du cristal ou de la solution, puissent imposer une conformation par rapport à l’autre41. Les dicétopipérazines symétriques cis-disubstituées adoptent préférentiellement, selon des expériences de chimie quantique, des conformations bateaux42 qui peuvent être observées aplaties ou twistées voire planes pour le cyclo(Ser-Ser) à l’état solide. Les dicétopipérazines trans-disubstituées présentent des conformations chaises aplaties ou planes43. Les dicétopipérazines tétrasubstituées possèdent généralement une conformation plane43. Dans le cas de substituants particulièrement encombrés stériquement, la conformation est telle qu’elle minimise les interactions stériques. Par ailleurs, la conformation adoptée peut être grandement influencée par la tendance des substituants aromatiques à se superposer au cycle dicétopipérazine37. Enfin, dans les cyclodipeptides contenant une proline, la configuration bateau est stable car le cycle à cinq de la proline est fusionné avec le cycle dicétopipérazine, ce qui impose une configuration rigide44,45.

Dicétopipérazines interagissant avec des biosenseurs du quorum sensing

            Des dicétopipérazines provenant d’organismes variés ont montré des capacités à interférer avec le quorum sensing. Certaines de ces molécules ont été isolées à partir de bactéries à Gram négatif. En 1999, Holden et al. ont identifié trois dicétopipérazines différentes dans les surnageants de culture de plusieurs bactéries : le cyclo(∆Ala-Val) chez Pseudomonas aeruginosa, Proteus Mirabilis, Citrobacter freundii et Enterobacter agglomerans, le cyclo(Tyr-Pro) chez P. aeruginosa, P. mirabilis et C. freundii, et le cyclo(Phe-Pro) chez Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas alcaligenes. Ces trois dicétopipérazines sont capables d’activer des biosenseurs considérés comme spécifiques des AHL, bien que les concentrations nécessaires soient bien supérieures à celle de l’auto-inducteur naturel. Ces molécules agissent également comme antagoniste de l’auto-inducteur naturel, ce qui suggère qu’il existe une compétition entre les dicétopipérazines testées et l’auto-inducteur pour la liaison au récepteur de type LuxR109. Quatre cyclodipeptides produits par Pseudomonas putida, (le cyclo(Pro-Tyr), le cyclo(Pro-Leu), le cyclo(Phe-Pro), et le cyclo(Val-Leu)) ont été isolés grâce à une purification guidée par l’activation de biosenseurs à AHL. Chacun de ces cyclodipeptides synthétisés chimiquement active au moins un des biosenseurs testés mais pas nécessairement celui qui a permis son identification, laissant supposer que la co-purification d’une AHL pourrait être à l’origine des activations observées lors de la purification110. Une étude réalisée avec 332 bactéries marines à Gram positif a révélé la capacité du cyclo(ProTyr) à inhiber la bioluminescence de Vibrio harveyi111, un pathogène marin intéressant à utiliser comme rapporteur du quorum sensing car ce dernier est particulièrement bien caractérisé et répond à trois typesd’auto-inducteurs (AHL, CAI-1 et AI-2)112. Enfin, un exemple de cyclodipeptide interférant dans le quorum sensing a été recensé. Il s’agit du cyclo(Pro-Val) produit par Haloterrigena hispanica, une archée extrêmement halophile113. Il est à noter que des études remettent en cause le rôle de molécules « signal » du quorum sensing attribué aux dicétopipérazines. Des dicétopipérazines issues de synthèse chimique ne présentent pas les propriétés d’activation du quorum sensing qui avaient pourtant permis de les isoler à partir de surnageant de culture. Comme suggéré par les auteurs eux-mêmes110 et par d’autres114, il semblerait que l’utilisation de méthodes séparatives non suffisamment résolutives pourraient mener à la collecte de fractions dans lesquelles une dicétopipérazine en quantité majoritaire et une AHL en quantité minoritaire seraientprésentes. Etant donné que les AHL sont actives à des concentrations bien inférieures à celles nécessaires pour les dicétopipérazines109, les AHL co-purifiées pourraient être à l’origine de l’activation du système de quorum sensing qui est observée dans ces cas110,114. Par ailleurs, Campbell et al. ont synthétisé et testé vis-à-vis de plusieurs biosenseurs de quorum sensing une bibliothèque de dicétopipérazines de type cyclo(Pro-Xaa), Xaa étant un acide aminé protéinogénique ou non-naturel115. Contrairement aux résultats obtenus lors des études précédentes, aucun des cyclodipeptides contenant des acides aminés naturels n’a pu activer ou inhiber les rapporteurs du quorum sensing utilisés. Seuls deux cyclodipeptides non naturels (cyclo(Pro-L-4- Cl-Phe) et cyclo(Pro-L-4-I-Phe)) auxquels s’ajoutent six dicétopipérazines non naturelles d’une étude ultérieure116, se sont révélés capables de moduler la réponse des biosenseurs. D’après les auteurs, ces résultats contradictoires pourraient être liés à l’utilisation, dans ce travail, d’organismes rapporteurs du quorum sensing qui ne surexpriment par les récepteurs de type LuxR, contrairement aux autres études115. Les concentrations élevées nécessaires à l’apparition d’interférences avec le quorum sensing, le questionnement sur la signification physiologique de celles-ci, l’absence de découverte de système utilisant uniquement les dicétopipérazines comme auto-inducteurs ont contribué à freiner les recherches dans ce domaine117,118. Néanmoins, d’autres études soulignent le rôle des dicétopipérazines comme molécules de communication aux implications physiologiques variées – avec ou non une interférence identifiée dans le mécanisme de quorum sensing – , comme l’illustrent les exemples décrits ci-après.

Les peptides non ribosomaux peuvent être modifiés au cours ou après leur synthèse

               En plus des domaines déjà décrits, d’autres domaines peuvent être présents dans les modules afin de réaliser des modifications sur la chaîne polypeptidique pendant sa synthèse. Ainsi les chaînes latérales des cystéines, des sérines et des thréonines peuvent subir des hétérocyclisations réalisées par des domaines Cy (450 acides aminés) qui remplacent le domaine C classique en assurant également la formation de la liaison peptidique290,291. Pour transformer des thiazolines ou oxazolines en thiazoles ou oxazoles, la présence d’un domaine d’oxydation appelé Ox est nécessaire292–294. Les atomes d’azote du squelette peptidique peuvent subir des méthylations. Cette modification, fréquemment retrouvée chez les peptides d’origine fongique295, est introduite par undomaine de N-méthylation (N-Mt) de 420 acides aminés et nécessite la S-adénosylméthionine (SAM) comme cofacteur296–299. Des C-méthylations sont également possibles et sont assurées par des domaines C-Mt290. En plus du contrôle stéréochimique assuré par le domaine A, certaines NRPS sont capables de contrôler la stéréochimie des acides aminés incorporés par le biais de domaines d’épimérisation (E) (450 acides aminés) qui réalisent en réalité une racémisation de l’acide aminé300. Le domaine C suivant a alors la charge de sélectionner uniquement l’énantiomère/diastéréoisomère D du mélange L/D produit301. On recense également la présence de domaines permettant la formation de liaison avec des acides gras302,303 ou de domaines réductase (R) qui transforment l’acide carboxylique terminal en aldéhyde ou alcool304. Enfin, des enzymes hybrides NRPS-PKS permettent d’introduire des unités acétates ou propionates dans des structures peptidiques305–307 (bléomycine A2308) ou des unités d’acides aminés dans des polycétides (épothilone309). Des modifications peuvent avoir lieu une fois que le peptide formé est libéré par la NRPS. Ces modifications sont catalysées par des enzymes appelées « tailoring enzymes » qui peuvent être des glycosyl transférases, des halogénases ou des hydroxylases. Les gènes codant ces enzymes et les NRPS sont souvent associés au niveau génomique et forment des clusters de gènes de biosynthèse310. Des exemples de ce type de modifications vont être donnés dans la partie suivante qui illustre la biosynthèse de dicétopipérazines.

La biosynthèse de l’ergopeptine résulte de l’action conjointe de deux NRPS

              Les ergopeptines sont des alcaloïdes, isolés de Claviceps purpurea, qui présentent une structure tripeptidique reliée par une liaison amide au carbonyle de l’acide D-lysergique. (Figure 33). Certaines ergopeptines comme l’ergotamine et la dihydroergotamine sont utilisées comme traitement de la migraine aiguë et de l’algie vasculaire de la face. Leur synthèse nécessite l’utilisation de deux NRPS situées sur le même cluster : LPS1 et LPS2. La LPS2 serait responsable de l’activation de l’acide D-lysergique et de sa présentation par l’intermédiaire de son domaine T, afin qu’il puisse être pris en charge par la LPS1. La LPS1, ayant activé chacun des trois acides aminés nécessaires (Ala, Phe et Pro) grâce à ses trois modules, synthétise le tripeptide relié à l’acide D-lysergique314,339–341. Le composé contenant le cycle dicétopipérazine est libéré sous forme de lactame puis une hétérocyclisation, vraisemblablement catalysée par un P450, est alors nécessaire pour obtenir l’ergopeptine finale342,343.

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Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Les 2,5-dicétopipérazines
1. Définition et propriétés du cycle 2,5-dicétopipérazine
1.1 Définition du cycle 2,5-dicétopipérazine
1.2 Conformation du cycle 2,5-dicétopipérazine
1.3 Propriétés chimiques des 2,5-dicétopipérazines
2. Diversité des sources naturelles productrices de 2,5-dicétopipérazines
3. Diversité structurale des 2,5-dicétopipérazines d’origine biologique
4. L’identification des 2,5-dicétopipérazines
II. Les dicétopipérazines, rôles physiologiques et activités biologiques
1. Des rôles physiologiques peu connus
1.1 Dicétopipérazines, des molécules de communication
1.1.1 Dicétopipérazines interagissant avec des biosenseurs du quorum sensing
1.1.2 Dicétopipérazines et communication inter-espèce et inter-règne
1.1.3 Le cyclo(Phe-Pro), une molécule qui interfère avec la pathogénicité des Vibrio
1.1.4 Dicétopipérazines induisant la production de substances antimicrobiennes
1.1.5 Dicétopipérazines exacerbant l’altération des denrées alimentaires
1.2 D’autres rôles décrits pour les dicétopipérazines
1.2.1 Virulence de micro-organismes pathogènes
1.2.2 Molécules liant le fer
2. Des activités biologiques variées
2.1 Activités antibactériennes
2.2 Activités antitumorales/anticancéreuses
2.3 Activité neuroprotectrice
III. Synthèse chimique des dicétopipérazines
1. Formation du cycle dicétopipérazine
1.1 Via la formation de liaison amide
1.1.1 Cyclisation d’ester dipeptidique
1.1.2 Réaction de Ugi
1.1.3 Autres voies utilisant la formation de liaison amide
1.2 Via N-alkylation
1.3 Autres voies de synthèse
2. Fonctionnalisation du cycle dicétopipérazine
2.1 Fonctionnalisation sur les carbones
2.2 Fonctionnalisation sur les azotes
2.3 Réaction sur les carbones des carbonyles (C-2) (C-5)
IV. Les voies de biosynthèse de dicétopipérazines utilisant les synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS)
1. Les synthétases de peptides non ribosomiques, des méga-complexes enzymatiques organisés en modules
1.1 Le domaine d’adénylation reconnaît le substrat et catalyse son activation
1.2 Le domaine de thiolation permet le transfert des substrats activés d’un centre catalytique à l’autre
1.3 Le domaine de condensation catalyse la formation de la liaison peptidique
1.4 Le domaine de terminaison catalyse la libération du peptide
1.5 Les peptides non ribosomaux peuvent être modifiés au cours ou après leur synthèse
2. Voies de biosynthèse de dicétopipérazines dépendant des NRPS
2.1 Voies de biosynthèse de la gliotoxine et des épidithiodioxopipérazines : les gènes de la NRPS et des enzymes de modifications sont regroupées en un même cluster
2.2 La voie de biosynthèse des dicétopipérazines de type fumitremorgine utilise une enzyme de modification « extérieure » au cluster de la NRPS
2.3 La voie de biosynthèse de la thaxtomine : la NRPS prend en charge un acide aminé modifié au préalable
2.4 La biosynthèse de l’érythrocheline : l’acide aminé utilisé est synthétisé par un autre cluster distant du cluster contenant la NRPS
2.5 La biosynthèse de l’ergopeptine résulte de l’action conjointe de deux NRPS
2.6 La biosynthèse de dicétopipérazines comme produits secondaires
V. Les voies de synthèse de dicétopipérazines dépendant des synthases de cyclodipeptides ou CDPS
1. Les synthases de cyclodipeptides : mise en évidence et caractérisation biochimique et structurale
1.1 Les CDPS, une nouvelle famille d’enzymes qui synthétisent principalement des cyclodipeptides hydrophobes
1.2 Les CDPS utilisent les aminoacyl-ARNt comme substrats
1.3 Les CDPS possèdent une structure réminiscente des aminoacyl-ARNt synthétases
1.4 Les CDPS utilisent un mécanisme catalytique de type ping-pong
1.5 Les bases moléculaires de l’interaction entre les CDPS et leurs substrats
2. Voies de biosynthèse de dicétopipérazines dépendant des CDPS
2.1 Voies de biosynthèse de l’albonoursine
2.2 Voies de biosynthèse de l’acide pulcherriminique
2.3 Voie de biosynthèse de la mycocyclosine
I. Analyse bio-informatique
1. Identification des CDPS potentielles
2. Calcul d’arbres phylogénétiques
2.1 Arbre de mai 2013
2.2 Arbre de septembre 2014
3. Outils pour l’analyse des séquences des CDPS
3.1 Prédiction avec HHPRED
3.2 Diagramme topologique
3.3 Logos de séquences
4. Analyse des environnements génomiques des CDPS
II. Matériel commercial et techniques classiques de biologie moléculaire
1. Techniques classiques de biologie moléculaire
2. Souches bactériennes utilisées
2.1 Souches pour la biologie moléculaire
2.2 Souches pour l’expression protéique
3. Plasmides commerciaux
4. Milieux de culture
III. Préparation des vecteurs pIJ194 et pIJ196
1. Préparation du pIJ194
1.1 Suppression du site XbaI
1.2 Ajout des sites SpeI et XbaI en préparant une cassette par PCR SOEing
1.3 Ajout d’une étiquette 6-Histidine
2. Préparation du vecteur pIJ196
IV. Obtention des gènes de CDPS et d’enzymes de modification
1. Amplification d’ADN génomique
2. Gènes de synthèse
V. Culture pour l’expression des CDPS et des enzymes de modification
1. Culture en erlenmeyer
2. Culture en plaque 24 puits
VI. Identification des dicétopipérazines
1. Standards chimiques
2. Analyses des surnageants de culture par LC-MS/MS
3. Purification de cyclodipeptides
3.1 A partir de surnageant de culture
3.2 A partir de milieu réactionnel
4. Analyse en composition d’acides aminés
5. Analyse par spectrométrie de masse haute résolution (HRMS)
6. Analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN)
VII. Analyse protéique des culots bactériens
1. Culots issus de la culture en erlenmeyer
2. Culots issus de la culture en plaque 24 puits
3. Analyse par SDS-PAGE
VIII.Purification des protéines (réalisée au sein de l’équipe par Emmanuel Favry et Jérôme Seguin)
1. Purification des CDPS (réalisée par Emmanuel Favry et Jérôme Seguin)
2. Purification des dioxygénases dépendant du Fe(II) et du 2-oxoglutarate (réalisée par Emmanuel Favry)
IX. Test d’activités in vitro
1. CDPS
1.1 Test avec lysat soluble
1.2 Test couplé avec ARNt et aaRS purifiés
2. Dioxygénases dépendant du Fe(II) et du 2-oxoglutarate
CHAPITRE I: MÉTHODE DE CARACTÉRISATION MOYEN-DÉBIT DES ACTIVITÉS DES ENZYMES DES VOIES DEPENDANT DES CDPS 
I. Mise au point du système de clonage 
1. Choix et mise en place du système de clonage
1.1 Système à deux vecteurs
1.2 Système permettant de rassembler plusieurs enzymes dans un vecteur
2. Optimisation du vecteur d’expression pour les CDPS
2.1 Le clonage de gènes de CDPS dans pQE60 induit une toxicité chez E. coli
2.2 L’introduction du gène lacI dans le plasmide pQE60 permet un clonage stable
3. Choix de l’origine des gènes
II. Mise au point du test d’activité in vivo en moyen débit 
1. Choix des souches d’E. coli pour l’expression des CDPS et des enzymes de modification
2. Expression avec un milieu auto-induit
2.1 Pourquoi un milieu auto-induit ?
2.2 Choix de la température de culture
2.3 Milieu auto-induit et M15-pREP4 : un écueil à éviter
3. Protocole de culture en plaque 24 puits
III. Introduction d’un nouveau mode de séparation chromatographique 
1. Analyse réalisée en routine au laboratoire
2. La colonne dC18 n’est pas adaptée à l’analyse des cyclodipeptides polaires ou de petite taille
3. La colonne Hypercarb permet d’analyser une nouvelle gamme de cyclodipeptides
IV. Discussion, conclusion et perspectives 
CHAPITRE II : MISE EN ÉVIDENCE ET CARACTERISATION DE NOUVELLES ACTIVITÉS CDPS 
I. Identification par bio-informatique de 80 CDPS potentielles et sélection de 49 CDPS à tester 
1. Identification des CDPS potentielles par PSI-BLAST
2. Correction des séquences obtenues et création d’un arbre phylogénétique
3. Sélection des CDPS à étudier
II. 41 nouvelles CDPS sur 49 sont actives : redéfinition des caractéristiques générales de ces enzymes 
1. 41 des 49 CDPS sélectionnées actives in vivo
2. Caractéristiques générales des CDPS actives
3. Signature fonctionnelle
III. Des sous-familles de CDPS aux résidus catalytiques différents 
1. Définition des sous-familles
2. Caractéristiques fonctionnelle et structurale des sous-familles
IV. Une plus grande diversité de cyclodipeptides 
1. Méthode pour l’identification des cyclodipeptides
2. Activités de synthèse de cyclodipeptides des CDPS
3. Diversité de cyclodipeptides apportée par les 41 nouvelles CDPS
V. Vers la prédiction de la spécificité des CDPS 
1. Prédiction des résidus constituant les poches de liaison des substrats chez les CDPS
2. Les CDPS de même activité montrent des séquences consensus pour les résidus constituant les poches P1 et P2 148
3. Validation expérimentale du modèle prédictif
VI. Vers une caractérisation biochimique plus approfondie des CDPS : l’étude in vitro des CDPS nouvellement identifiées 
1. Sélection et purification de 16 CDPS
2. Analyse in vitro des activités des CDPS
2.1 Mise au point du test avec un lysat soluble de E. coli.
2.2 Résultats des tests in vitro des activités
VII. Discussion, conclusion et perspectives 
CHAPITRE III: MISE EN ÉVIDENCE DE NOUVELLES ACTIVITÉS DE MODIFICATION DANS LES VOIES DEPENDANT DES CDPS 
I. Environnement génomique des CDPS : diversité et sélection d’enzymes de modification à étudier 
1. Analyse des environnements génomiques des CDPS
2. Sélection des voies de biosynthèse à étudier
II. Mise en évidence d’activités de modification 
1. Enzymes de modification sélectionnées et modifications potentielles opérées
1.1 Déshydrogénase/réductase à chaîne moyenne
1.2 Aldéhyde déshydrogénases
1.3 Dioxygénases dépendant du Fe(II) et du 2-oxogulatarate
1.4 Monooxygénase à flavine
1.5 Méthyltransférase
2. Identification de nouvelles activités de modification
3. Le cas de la méthyltransférase R
III. Enzymes de modification du cyclo(Ala-Glu) : activité in vitro et caractérisation structurale des produits 
1. Reproduction in vitro de l’activité enzymatique d’une OG
1.1 Purification de l’enzyme K
1.2 Caractérisation de l’activité in vitro
1.2.1 Produits obtenus in vitro
1.2.2 Etude cinétique préliminaire
1.2.3 Dépendance aux cofacteurs
2. Elucidation structurales des dérivés du cyclo(Ala-Glu)
2.1 Données HRMS
2.2 Analyses RMN
IV. Discussion, conclusion et perspectives 
CONCLUSION GÉNÉRALE
ANNEXES

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