Nettoyage des équipements en industries agro-alimentaires

Mécanismes d’adhésion bactérienne à une surface inerte

Le développement d’un encrassement micro ou macroscopique peut être perçu comme une série d’étapes successives. L’étape initiale d’adhésion est considérée comme essentielle (Oliveira, 1997). L’adhésion faisant appel à une notion de proximité, les micro-organismes doivent tout d’abord arriver au voisinage de la surface (quelques dizaines de nanomètres). Fletcher (1996) rappelle qu’au sein d’une population bactérienne en suspension, seule une très faible proportion adhère à un support immergé. Par exemple, pour des essais réalisés au laboratoire dans des conditions statiques, seul un centième des spores de Bacillus cereus en suspension va adhérer aux supports (Faille et al., 1999).
Dans la littérature, certains chercheurs ont tenté de décrire le processus d’adhésion de manière rationnelle en utilisant des principes de la physique et de la chimie. Le processus d’adhésion a été décrit principalement via la théorie des systèmes colloïdaux. Bien que dans certains cas, les bactéries se comportent comme de petites particules, elles demeurent des organismes vivants, dont la forme et les propriétés de surfaces sont a priori complexes. Les vraies particules colloïdales se déplacent grâce à l’application de forces externes. Cela n’est pas nécessairement le cas pour les bactéries, car certaines d’une manière générale, l’énergie de surface est la propriété physico-chimique la plus importante d’une surface solide. Quand une surface est mise en contact direct avec une solution, les molécules et les atomes de cette surface interagissent avec les molécules et les atomes contenus dans la solution et le type des forces, ou d’interactions, dépend de la composition chimique des deux milieux. D’après Asther et al. (1990), l’adhésion des micro-organismes sur des surfaces chimiquement inertes relève de la physico-chimie et peut être prévu par des modèles thermodynamiques.

Les biofilms

Selon Costerton et al. (1987) un biofilm est un consortium fonctionnel de microorganismes attaché à une surface et incorporé dans des substances polymériques extracellulaires (EPS) produites par les microorganismes. La formation du biofilm, comme nous l’avons précédemment évoqué, constitue une étape consécutive à l’adhésion bactérienne.
Depuis l’époque de Louis Pasteur, les microbiologistes ont étudié des cultures pures de micro-organismes, le plus souvent en suspension dans des bouillons nutritifs.
Aujourd’hui tous s’accordent sur le fait que les bactéries se développent de préférence à la surface de supports et principalement au sein de biofilms. L’épaisseur du biofilm peut varier de quelques micromètres à plusieurs millimètres et contenir 90–97 % d’eau. Dans les biofilms d’espèces mixtes, les cellules bactériennes peuvent être accompagnées par des eucaryotes, une variété de polysaccharides extracellulaires (EPS), d’enzymes et autres protéines, de bactériocines et de faibles solutés de masse, ainsi que des acides nucléiques qui peuvent être présents à la suite de la lyse des cellules (Sutherland et al., 2004). Des biofilms d’espèces mixtes peuvent être plus stables que des biofilms mono espèces (Mosteller & Bishop, 1993) et cela peut être important dans des situations telles la surface de végétaux que l’on retrouve dans les produits de quatrième gamme, où de nombreuses espèces sont potentiellement présentes.

Résistance des bactéries du biofilm aux composés antimicrobiens

Il est bien établi que les biofilms bactériens présentent une résistance accrue aux traitements antimicrobiens par rapport aux cellules individuelles cultivées en suspension (Petrocci, 1983 ; Mustapha & Liewen, 1989 ; Frank & Koffi, 1990 ; Krysinski et al., 1992). Cette résistance des bactéries au sein du biofilm a été largement observée et est attribuée à des propriétés variées du biofilm lui-même: réduction de la diffusion, réduction du taux de croissance en raison des changements physiologiques et la production d’enzymes dégradant les substances antimicrobiennes. En outre, il est difficile d’établir lequel de ces mécanismes a causé cette résistance ou plutôt la combinaison des mécanismes engendrant la résistance des populations. La résistance antimicrobienne exposée par le biofilm est liée à leur structure en trois dimensions et cette résistance est perdue dès que cette structure est interrompue (Hoyle et al., 1992). Par conséquent, la production de quantités excessives de substances polymériques par les bactéries pendant la formation du biofilm et la croissance peut protéger les cellules en profondeur c’est-a-dire les cellules en contact avec le support. Lorsque des substances antimicrobiennes sont mis en contact avec ce biofilm, leurs effets sont estompées parce qu’elles diffusent par les EPS (Farber et al., 1990 ; Hoyle et al., 1990 ; Stewart, 1996).
Dans certaines des études, il a été démontré que les désinfectants tels que l’acide peracétique, le chlorure mercurique et le formaldéhyde n’ont aucun effet sur les biofilms situés sur des surfaces ouvertes et en particulier des revêtements de sol (Carpentier & Cerf, 1993). Il a été également signalé que Listeria monocytogenes adhérée à une surface alimentaire montrait une résistance accrue à des désinfectants classiques comme l’acide anionique et des composés d’ammonium quaternaire (Petrocci, 1983 ; Mustapha & Liewen, 1989 ; Frank & Koffi, 1990). L’explication raisonnable de l’efficacité réduite de ces agents contre les biofilms est la pénétration incomplète dans le biofilm par ces biocides (Huang et al., 1995) et la grande variation des conditions environnementales existant sur les surfaces de contact alimentaire. La présence de particules abiotiques, de kaolin et de carbonate de calcium dans les biofilms de Pseudomonas aeruginosa et de Klebsiella pneumoniae est également impliquée dans la réduction de l’efficacité des biocides (Srinivasan et al., 1995).
En outre, les agents antimicrobiens sont beaucoup plus efficaces contre les cellules lors de leur croissance active c’est-à-dire que le meilleur désinfectant pour les cellules planctoniques n’est pas nécessairement ceux appropriés pour les cellules de biofilm (Holah et al., 1990). Les cellules dans la couche profonde du biofilm reçoivent moins d’oxygène et de nutriments que celle à la surface du biofilm (Brown et al., 1988). On parle de cellule dormantes ou simplement à croissance très faible dont l’état physiologique modifié entraîne une augmentation de résistance aux agents antimicrobiens (Gilbert et al., 1990 ; Evans et al., 1991 ; McFeters et al., 1995). Dans les biofilms mixtes, une concurrence de nutriments entraîne une carence en éléments nutritifs, qui a également un rôle majeur dans la résistance des biofilms aux agents de traitement antimicrobien (Berg et al., 1982 ; Jones, 1989).
Certaines études sur des bactéries issues d’aliments contaminés ont montré que la résistance contre les désinfectants est plus sévère dans les biofilms anciens (plus de 24 h) que dans les jeunes biofilms (Anwar et al., 1990 ; Frank & Koffi, 1990 ; Lee & Frank, 1991 ; Wirtanen & Mattila-Sandholm, 1992).
Plusieurs auteurs ont démontré l’augmentation de la résistance des biofilms bactériens aux antibiotiques (Nickélifère et al., 1985 ; Widmer et al., 1990 ; Anwar et al., 1992). Le mécanisme possible proposé pour cette résistance aux substances antimicrobiennes par les bactéries est la production d’enzymes dégradant ces substances c’est-à-dire les -lactamases. Ces enzymes dégradent et inactivent les antibiotiques qui pénètrent par le biais de l’enveloppe de la cellule à leurs sites cibles. Au sein de biofilms, beaucoup d’enzymes hydrolytiques similaires ont été retrouvées et sont suspectées de participer à la protection des bactéries du biofilm. En outre, la résistance du biofilms peut également être due de façon plus triviale aux bactéries elles-mêmes.

Présence de biofilms bactériens en environnement agroalimentaire et conséquences

Il est bien établi à ce jour que de nombreux microorganismes pathogènes forment des biofilms à la fois sur les aliments et sur les surfaces potentiellement en contact avec les denrées alimentaires lorsque les conditions environnementales sont favorables. Depuis les travaux de Duguid et al. (1966) sur Salmonella, de nombreuses études ont décrit la capacité des pathogènes d’origine alimentaire à s’attacher aux aliments et aux surfaces alimentaires. Nous pouvons citer les travaux sur listeria monocytogenes (Frank & Koffi, 1990 ; Herald & Zoottola, 1988b ; Mafu et al., 1990), Yersinia enterocolitica (Herald & Zoottola, 1988a), Campylobacter jejuni (Kuusela et al., 1989) et Escherichia coli O157: H7 (Dewanti & Wong, 1995). L’adhésion des microorganismes pathogènes aux surfaces alimentaires et leur développement sous forme de biofilms ou au sein de biofilms multi-espèces comme c’est généralement le cas peut entrainer des risques importants pour la santé des consommateurs comme l’ont montré les problèmes récents liés à la présence par exemple d’E. coli O157:H7 sur des produits carnés (Douro et al., 2011) ou E.coli entéro-hémorragique (ehec) sur produits végétaux (note de l’anses en juin 2011). Des études réalisées sur la composition microbienne des biofilms qui se forment à la surface des équipements de traitement de diverses industries ont été décrites dans plusieurs travaux (Bagge-Ravn et al., 2003 ; Gunduz & Tuncel, 2006 ; Guobjornsdottir et al., 2005 ; Sharma & Anand 2002). Ces enquêtes ont mis en évidence la présence de ces biofilms « pathogènes » aussi bien au sein de machines qu’aux surfaces des ateliers de transformation. Dans les industries laitières Kirtley & McGuire. (1989) précisent que les risques sanitaires sont dues à la présence de biofilms sur les surfaces, la colonisation microbienne des réservoirs de stockage de lait, l’encrassement des surfaces d’échange de chaleur et la présence de formes sporulées sur les matériaux d’emballage et de conditionnement. Les spores de B. cereus par exemple, présentes dans le lait cru avant traitement peuvent rester sur certaines parties des équipements, dans des zones d’échange de chaleur en raison de leur thermo-résistance ce qui favorise leur germination et leur développement sous forme de biofilms et ainsi contaminer le produit fini (Te Giffel et al., 1997).
Une étude réalisée par Eneroth et al. (1998) montre la contamination des emballages de lait pasteurisé par des bactéries Gram (-) psychrotrophe, cette contamination a été associée à l’eau de rinçage. Cela suggère que ces bactéries ont formé des biofilms dans le système de distribution des eaux de rinçage. Une autre étude réalisée par Langeveld et al. (1995) dans une installation pilote au laboratoire à montré une augmentation de la concentration bactérienne d’un facteur de 106 . Ainsi dans leur expérience ils ont chauffé du lait dans un échangeur tubulaire en acier inoxydable et montré le lien direct entre la densité de bactéries sur les parois des tubes et la concentration de contaminants dans le lait après chauffage. Langeveld et al. (1995) et Murphy et al. (1999), suggèrent que la présence et l’augmentation de la contamination bactérienne du lait est la conséquence d’une contamination préalable des équipements utilisés pour la transformation du lait. Les travaux récents de Scott et al. (2007) situent l’origine de la contamination du lait en poudre par des bactéries sporulées au niveau des échangeurs de préchauffage du lait et de l’évaporateur. Les
spores étaient détectées entre 9 et 18h après le début de la production. Une des conséquences était la présence de 106 ufc.ml-1 dans le produit fini après 18h.

Nettoyage des souillures dans les industries agroalimentaires

Le nettoyage doit permettre d’éliminer toute souillure présente sur les surfaces des équipements. Les industriels ont pour obligation le maintien permanent de la qualité hygiénique de leurs équipements. Cette obligation peut revêtir 3 aspects : obligation commerciale, obligation morale et obligation légale. Le degré de propreté d’une installation industrielle sera défini à l’aide des termes suivants :
propreté physique : signifie qu’aucun résidu ne doit être physiquement détectable ;
propreté chimique : correspond à l’élimination de toute trace de résidu chimique ;
propreté bactériologique : induit la disparition complète des microorganismes et macromolécules adhérées aux surfaces.
La propreté des surfaces est assurée par l’application de forces d’arrachement supérieures aux forces d’adhésion des souillures. L’utilisation de détergents et de chaleur permettent la diminution des forces de cohésion souillures-supports et rendent plus aisé l’arrachement des souillures quant elles sont soumises à un cisaillement généré par l’écoulement du fluide dans les équipements fermés.
Le Nettoyage En Place est une technique largement répandue en agro-industrie pour le nettoyage des systèmes fermés composés de réseaux de connections tubulaires reliant différents équipements et cuves par circulation d’eau, de détergents et/ou de désinfectants (Bénézech & Lalande, 1999).
La visualisation de l’arrachement lors du nettoyage des dépôts de lait, de lactosérum et de concentré de protéine (Grasshoff, 1989 ; Bird & Bartlett, 1995 ; Christian, 2004) ont illustré la nature non uniforme de la suppression de ces dépôts. Le processus d’élimination à été décrit comme comprenant les mécanismes suivants :
Le gonflement – la solution alcaline entre en contact avec le dépôt et cause le gonflement liée principalement à l’hydratation du dépôt associé à une dénaturation de la fraction protéique par les ions hydroxyles (OH-).
L’érosion – suppression uniforme des dépôts par les forces cisaillement après diffusion progressive du détergent dans la souillure.
La désintégration – le dépôt est soit éliminé par paquets plus ou moins importants soit on parle de dissolution dans la solution détergente.
La désincrustation – Il reste en surface des éléments des souillures initiales protégés qui vont subir l’action du détergent plus que de l’action mécanique. Le choix du détergent se révèle ici très important pour éviter des temps de nettoyage trop longs. Ce phénomène a été montré pour les biofilms bactériens (Lequette et al., 2010).

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Table des matières

INTRODUCTION
Chapitre I : Adhésion bactérienne, formation de biofilm dans les environnements agro-alimentaires et résistance au nettoyage
Résumé
I.1. Introduction
I.2. Mécanismes d’adhésion bactérienne à une surface inerte
I.3. Les biofilms
I.3.1. Formation de biofilm
I.3.1. Variables influençant le développement du biofilm
I.3.2. Substances polymériques extracellulaire (EPS)
I.3.3. Rôle des EPS dans la consolidation du biofilms bactérien
I.3.4. Communication intercellulaire
I.3.5. Résistance des bactéries du biofilm aux composés antimicrobiens
CHAPITRE II : Nettoyage des équipements en industries agro-alimentaires
Résumé
II.1. Introduction
II.2. Présence de biofilms bactériens en environnement agroalimentaire et conséquences
II.3. Méthodes d’analyses des biofilms 
II.4. Nettoyage des souillures dans les industries agroalimentaires 
II.5. Paramètres influençant l’efficacité du Nettoyage En Place
II.5.1. Les conditions opératoires du NEP
II.5.2. Rôles du détergent
II.5.3. La température de circulation du fluide détergent
II.5.4. Le temps de circulation du fluide détergent
II.5.5. L’action mécanique
II.6. Cinétiques de décrochement de bactéries
CHAPITRE III : Matériaux utilisé en industries agro-alimentaire
Résumé
III.1. Introduction
III.2. Les matériaux en agroalimentaires 
III.2.1. Acier inoxydable
III.2.2. Finitions de l’acier inoxydable
III.3. Propriétés physico-chimiques des matériaux
III.3.1. L’hydrophobicité
III.3.2. Topographie de surface
III.3.3. Propriétés énergétiques de la surface inerte
Chapitre IV : Matériels biologiques et équipements utilisés
IV.1. Souches bactériennes
IV.1.1. Caractéristique des souches étudiées
IV.1.2. Préparation de spores
IV.1.3. Préparation de la suspension de mère
IV.1.4. Milieux nutritifs utilisés
IV.2. Matériels 
IV.2.1. Conduites en acier inoxydable
IV.2.2. Coupons en acier inoxydable
IV.2.3. Vanne bidirectionnelle 2×2 voies
IV.2.4. Le racleur ou piston destiné à récolter les biofilms
IV.2.5. Agitateur thermo-régulé
IV.2.6. La plate-forme expérimentale et le circuit NEP
Chapitre V : Méthode
Résumé
V.1. Cinétique d’élimination des biofilms de Pseudomonas fluorescens
V.1.1. Phase de contamination des équipements
Contamination en condition semi-statique
Formation du biofilm mixte à P. fluorescens et à B. cereus 98/4
V.1.2. Phase de nettoyage/rinçage du biofilm de Pseudomonas fluorescens
Trempage
Nettoyage en conditions statique en présence de soude
Rinçage et nettoyage en conditions dynamiques
En conditions dynamique avec les coupons (0,144 Pa en tubes carrés)
V.2.Cinétique d’élimination des biofilms de Bacillus cereus
V.2.1. Phase de contamination des biofilms à B. cereus
En condition statique
V.2.2. Phase de nettoyage du biofilm de Bacillus cereus
V.3 Etude de réadhésion bactérienne au cours du NEP
V.3.1. Cinétique d’élimination des spores de B. cereus
Phase de contamination des spores de B. cereus
Phase de nettoyage des équipements
V.4. Etude de la redéposition de spores de Bacillus cereus sur un équipement complexe communément utilisé en industrie alimentaire
V.4.1. Phase de contamination des équipements
V.4.2. Phase de nettoyage des équipements
V.5. Détection de la contamination résiduelle
V.5.1. Détection par moulage des tubes
V.5.2. Détection par raclage de la surface interne des tubes
V.5.3. Détection par écouvillonnage
V.5.4. Quantification du pourcentage de spores dans les biofilms
V.6. Analyse d’images
V.6.1. Le MEB (microscopie électronique à balayage)
V.6.2. La microscopie en fluorescence
V.7. Analyse statistique 
V.7.1. Méthodes non paramétriques (le gentil et al. 2009 ; Bénézech et al., 2001)
V.7.2. Méthode paramétrique avec les analyses de variance AVEC SAS
V.7.3. Modélisation des cinétiques
Chapitre VI : Etude des cinétiques d’élimination des biofilms de Pseudomonas fluorescens
Résumé
VI.1. Choix du modèle cinétique
VI.2. Etude cinétique en dynamique
VI.2.1. Taux de réduction décimale de la population initiale
VI.3. Modélisation des cinétiques d’élimination
VI.4. Analyse des paramètres du modèle 
VI.5. Analyse d’image
VI.6. Etude de l’effet chimique
Résumé
VI.7. Etude comparative de différentes conditions de nettoyage
Chapitre VII : Etudes des cinétiques d’élimination des biofilms à Bacillus
Résumé
VII.1. Analyse des biofilms de B cereus biofilms 
VII.2 : Cinétique d’élimination des Biofilms de Bacillus
VII.3 : Détermination de la proportion de spores
VII.4 : Cinétiques d’élimination de la fraction sporulée
VII.5 : Cinétiques d’élimination d’un biofilm mixte B. cereus et P. fluorescens : résultats préliminaires
Chapitre VIII. Récontamination bactérienne des surfaces des lignes de transformation
alimentaire pendant les procédures de Nettoyage En Place
Résumé
VIII.1 Contexte
VIII.2. Etude de la cinétique de détachement des spores de différentes souches de Bacillus
VIII.3. Étude de la réadhésion
VIII.4. Analyse et résultats expérimentaux 
VIII.5. Réadhésion à un équipement complexe : exemple de la vanne bidirectionnelle
VIII.6. Analyse statistique
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

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