Nanostructuration de surface pour l’imagerie à résonance de plasmons de surface de haute résolution

Techniques d’analyse et de quantification de la réponse cellulaire en surface

En pharmacologie et en biologie, l’étude de cellules vivantes dans leur contexte physiologique est importante pour faciliter la recherche de nouvelles drogues et l’analyse des interactions entre les cellules et les stimuli extérieurs [Bousse, 1996; Taylor et al., 2001]. Au cours des dernières années, les systèmes de biodétection utilisant des structures biologiques comme moyen de détection se sont révélés être une méthode efficace pour analyser de manière non invasive l’activité des cellules [Chabot et al., 2009; Fang, 2011; Pancrazio et al., 1999]. Ces systèmes permettent de transformer l’information biologique (adhésion cellulaire, migration cellulaire, etc.) en un signal quantifiable (électrique, optique, etc.). Par exemple, les cellules possèdent de nombreux récepteurs dans leur membrane extracellulaire avec lesquels elles peuvent interagir avec le milieu extérieur afin de réguler leur métabolisme. La plus grande catégorie est les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) qui vont détecter les molécules externes et activer des processus internes en conséquence. Le suivi de la signalisation des RCPG dans les biocapteurs à base de cellules vivantes montre un potentiel énorme dans la découverte de médicaments [Fang et al., 2008; Scott et Peters, 2010]. D’autres applications sont notamment le suivi de l’intégrité d’une monocouche cellulaire [Benson et al., 2013; Cuerrier et al., 2008], les changements de morphologie par la présence de toxines [Chabot et al., 2009; Maltais et al., 2012] et l’adhésion cellulesubstrat [Berginski et al., 2011; Chien et al., 2011; Kim et al., 2011; Peterson et al., 2018; Shroff et al., 2008; Son, Seo, et al., 2017].
Deux grandes catégories de systèmes de biodétection existent, les outils nécessitant le marquage des structures ou des molécules étudiées et ceux qui n’en requièrent pas. Parmi les systèmes optiques, c’estàdire exploitant l’interaction entre la lumière et la matière, la technique avec marquage la plus courante est la spectroscopie ou l’imagerie de fluorescence. La fluorescence survient lorsqu’une molécule absorbe un photon puis émet immédiatement un photon d’énergie moindre. Elle est généralement décrite par un diagramme de Jablonski [Lakowicz, 2006]. Cette technique est couramment utilisée, car les marqueurs fluorescents (ou fluorophores) sont très spécifiques, relativement simples à utiliser et permettent l’acquisition en temps réel d’images de haute résolution. Plusieurs techniques d’imagerie de «superrésolution» permettent de dépasser les limites optiques et atteindre une résolution de l’ordre de quelques dizaines à centaines de nanomètres seulement [Cox, 2015; Hell et al., 2015; Huang et al., 2009; Sahl et al., 2017; Toomre et Bewersdorf, 2010]. Cependant, l’exploitation de la fluorescence peut causer une modification du milieu biologique d’analyse par le marquage avec les molécules fluorescentes, ce qui risque d’altérer le comportement des structures étudiées. De plus, les fluorophores subissent le phénomène de photoblanchiment (extinction du fluorophore au bout d’un certain nombre de cycles de fluorescence) ce qui est un facteur limitant de toutes ces techniques.

Imagerie SPR

La résonance de plasmons de surface peut être observée en imagerie en ajoutant à un système SPR conventionnel un capteur 2D (caméra) comme détecteur. L’imagerie SPR, initialement explorée par [Rothenhäusler et Knoll, 1988; Yeatman et Ash, 1987], permet de générer des images où chaque valeur de pixel peut être liée à une valeur dindice de réfraction du diélectrique à proximité de la surface de la couche de métal. La majorité des systèmes d’imagerie SPR utilisent un prisme d’indice de réfraction élevé pour coupler la lumière incidente avec les plasmons de surface. Cependant, plusieurs aberrations sont générées par l’utilisation d’un prisme [Laplatine, 2015]. Certains systèmes avancés utilisent plutôt un objectif de microscope à grande ouverture numérique qui offre un agrandissement plus élevé qu’un prisme et permet ainsi d’observer des structures aux dimensions inférieures au micromètre [Huang et al., 2007].
La présence de l’objectif de microscope permet en plus de s’affranchir des aberrations générées par le prisme.

Le contraste dans une image SPR correspond aux variations de réflectance collectée par la caméra qui sont liées aux conditions de couplage entre la lumière et les PSP.
À l’angle d’incidence θ, la lumière incidente est couplée efficacement avec le mode guidé au niveau du milieu 1 (kinc,x = β1), et résulte en une faible intensité lumineuse réfléchie. Celleci est due à l’interférence destructive entre la lumière réfléchie par la couche métallique et la lumière réémise par le mode guidé. Cette interférence n’est pas présente avec le mode guidé par le milieu 2, car les conditions de couplage à l’angle θ ne sont pas respectées. Ainsi, la majorité de la lumière est réfléchie et collectée par le détecteur. Cette différence d’intensité lumineuse entre les deux milieux correspond au contraste observé dans les images acquises.

Amélioration de la résolution en SPRI

Plusieurs groupes de recherche travaillent à développer des systèmes dimagerie SPR ou des techniques dacquisition permettant daméliorer la résolution spatiale en SPRI. Une première approche exploite la nature cohérente des plasmons de surface [Somekh et al., 2000a, 2000b]. Ce type de système excite les PSP sous plusieurs orientations et les fait interférer entre eux. Par exemple, un microscope à balayage spatial (plan de léchantillon) a été développé par le groupe de Kano et offre des images dont la résolution est de l’ordre de la limite de diffraction (~ 170 nm) [Kano et Knoll, 2000; Watanabe et al., 2007, 2010]. Ce système génère des plasmons localisés grâce à l’interférence destructive des plasmons de surface. Une image de haute résolution est alors générée en balayant léchantillon à l’aide d’un support à échantillon sur plaque piézoélectrique. Par ailleurs, le système développé par [Berguiga et al., 2007] exploitant également linterférométrie offre des résolutions spatiales inférieures au micromètre.
Ce système se base sur le retard de phase engendré par la propagation des plasmons excités. En injectant de la lumière à plusieurs angles dincidence et directions de propagation, seulement certains faisceaux (angles où il y a résonance plasmonique) auront une phase retardée, lorsque réfléchis.La lumière réfléchie est comparée à un faisceau de référence par interférométrie hétérodyne, et les images sont générées en balayant l’échantillon et en appliquant une défocalisation au faisceau d’excitation. Ce système a été appliqué à l’imagerie à longue durée de cellules vivantes et offre des résolutions de l’ordre de la limite de diffraction [Berguiga et al., 2016]. Il a également été appliqué à l’imagerie d’objets diélectriques 3D pour la reconstruction tomographique de haute résolution [Berguiga et al., 2017]. Le balayage spatial de l’échantillon limite toutefois le temps d’acquisition.

Surfaces métalliques nanostructurées

Détection par puces nanostructurées

Au cours des récentes années, les surfaces nanostructurées ont montré un potentiel intéressant pour la biodétection avec ou sans marquage [Kabashin et al., 2009]. Cet intérêt est principalement dû au fort confinement du champ au niveau des nanostructures qui peut être optimisé en modifiant par exemple les dimensions, les matériaux et les formes des structures.
Les puces nanostructurées utilisées pour la détection avec marquage sont en majeure partie employées pour exciter des fluorophores sélectivement. Cela permet d’avoir des images de haute résolution avec un faible bruit volumique, tout en augmentant la sensibilité [Kim, Oh, et al., 2010]. Par exemple, des nanopiliers marqués par des anticorps ont permis de se lier à des protéines dans des cellules vivantes et de simultanément les illuminer par fluorescence [Xie et al., 2011].
Le signal obtenu par épifluorescence en (b) est très saturé, tandis que celui en (c) est très sélectif dans son excitation où seulement les nanopiliers excitent les fluorophores.

Adhésion des cellules sur surfaces structurées

L’adhésion des cellules entre elles ou avec leur substrat environnant se fait par le biais de complexes protéiques, en particulier les adhésions focales (FA). Cellesci s’assurent de réguler le cytosquelette et la signalisation biochimique et mécanique et d’ancrer les cellules.
Récemment, plusieurs techniques ont été proposées pour étudier les FA afin de mieux comprendre ces mécanismes, notamment en imagerie de superrésolution [Kanchanawong et al., 2010]. Par exemple, l’étude de la morphologie des adhésions focales a permis prédire la vitesse de migration de cellules à partir de leurs dimensions (longueur, périmètre, aire, etc.) [Kim et Wirtz, 2013]. L’imagerie de superrésolution a également été appliquée à l’étude de la biologie des adhésions cellulaires.
La grosseur des FA adhérées sur une surface vont varier selon leur maturité de quelques centaines de nanomètres à plusieurs micromètres.

Fabrication des puces SPR

Tous les échantillons ont été fabriqués en salles blanches (classe 100, ISO 5) afin de minimiser les contaminations avec la poussière. Cela est particulièrement important lorsque les dimensions des structures à fabriquer sont plus petites que les poussières en suspension dans l’air. Plusieurs types d’échantillons ont été fabriqués au courant de la thèse afin de comparer les performances de puces SPR avec et sans nanostructuration.
Les substrats de verre (BK7) ont tout d’abord été nettoyés afin d’éliminer les impuretés provenant de la fabrication. Les étapes de nettoyage sont effectuées en simultanées sur une dizaine de lamelles en immersion dans des contenants en pyrex
.
Les lamelles nettoyées ont ensuite été envoyées pour dépôt de métaux par évaporation à l’aide d’un évaporateur Intlvac. Deux couches de métaux ont été déposées, c’estàdire une couche de chrome (3 nm) afin de promouvoir l’adhésion de l’or sur le verre et une couche d’or (25 nm ou 50 nm). Les taux de dépôt sont respectivement de 0.5 Å/s, 2 Å/s (25 nm Au) et 5 Å/s
(50 nm Au). Ces deux évaporations sont effectuées successivement sans briser le vide dans la chambre afin de ne pas ajouter d’impuretés dans le processus.
À partir de ces lamelles de verre métallisées (BK7/Cr/Au), des structures ont ensuite été fabriquées à l’aide des techniques de fabrication présentées cidessus. La KMPR (résine similaire à la SU8) a été utilisée comme résine pour la fabrication de structures macrométriques pour la caractérisation de la résolution spatiale et du contraste en SPRI. La KMPR est stable, biocompatible et plus résistante aux fissures que la SU8 [Convert et al., 2012]. L’utilisation de la lithographie électronique pour la fabrication de nanostructures a permis de varier facilement les dimensions de réseaux afin de caractériser leurs performances en SPRI. Le softUVNIL a été utilisé pour fabriquer des réseaux de grande surface (1 cm2) aux dimensions optimisées, pour des expériences cellulaires. 

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Table des matières

CHAPITRE 1 INTRODUCTION
1.1 Mise en contexte et problématique
1.2 Question de recherche et objectifs du projet
1.3 Plan du document et contributions originales
CHAPITRE 2 ÉTAT DE L’ART ET CADRE DE RÉFÉRENCE
2.1 Techniques d’analyse et de quantification de la réponse cellulaire en surface
2.2 Résonance de plasmons de surface
2.2.1 Notions d’optiques et modes guidés
2.2.2 Théorie et couplage SPR
2.2.3 Imagerie SPR
2.2.4 Amélioration de la résolution en SPRI
2.3 Surfaces métalliques nanostructurées
2.3.1 Détection par puces nanostructurées
2.3.2 Adhésion des cellules sur surfaces structurées
2.4 Résumé
CHAPITRE 3 MÉTHODOLOGIE
3.1 Modélisation numérique de réseaux métalliques
3.2 Fabrication des échantillons
3.2.1 Techniques de lithographie
3.2.2 Fabrication des puces SPR
3.3 Résumé
CHAPITRE 4 NANOSTRUCTURATION DE SURFACE EN IMAGERIE SPR
4.1 Avant-propos
4.2 Article
4.2.1 Introduction
4.2.2 Numerical analysis
4.2.3 Experimental results and parameter estimation
4.2.4 Conclusion
4.2.5 Funding
4.2.6 Acknowledgments
CHAPITRE 5 SUIVI DE L’ACTIVITÉ CELLULAIRE EN SPRI
5.1 Avant-propos
5.2 Article
5.2.1 Introduction
5.2.2 Material and methods
5.2.2.1 Sensor chip design
5.2.2.2 Cell culture and reagents
5.2.2.3 Threshold estimation for intercellular gap detection
5.2.3 Results and discussion
5.2.3.1 Monitoring of cell response in confluent endothelial cell monolayers
5.2.3.2 Quantification of intercellular gap morphology dynamics in endothelial cell monolayers
5.2.4 Conclusion
5.2.5 Acknowledgements
5.2.6 Appendix A
CHAPITRE 6 RÉSULTATS PRÉLIMINAIRES COMPLÉMENTAIRES 
6.1 Étude préliminaire du cytosquelette de cellules vivantes
6.2 Modélisation de réseaux métalliques périodiques 2D
6.3 Résumé
CHAPITRE 7 CONCLUSION
7.1 Résumé du contexte
7.2 Sommaire des travaux et atteinte des objectifs
7.3 Contributions originales des travaux
7.4 Perspectives de recherche
ANNEXE A PROTOCOLES DE FABRICATION 
LISTE DES RÉFÉRENCES

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