Morphologie et cycle biologique de pneumocystis

MORPHOLOGIE ET CYCLE BIOLOGIQUE DE PNEUMOCYSTIS

Des aspects fondamentaux de la biologie des Pneumocystis sp. restent à élucider et aucunµ système de culture continue n’existe à ce jour.

Morphologie

De nombreuses études ultrastructurales ont été menées sur des poumons humains (Barton et Campbell, 1967 ; Hasleton et al., 1981) ou d’animaux (Yoshida, 1989 ; Palluault et al., 1991 ; Palluault et al., 1991a) infectés par Pneumocystis sp. Les données obtenues en microscopie électronique à transmission, par des techniques de cytochimie ultrastructurale ou par des méthodes de reconstruction tri dimensionnelle (Palluault et al., 1991 ; Palluault et al., 1991a ; Palluault et al., 1992 ; Palluault et al., 1992a) ont permis de caractériser trois stades parasitaires : les formes trophiques, les sporocytes et les kystes matures (Figure 1). La forme trophique (dénommée auparavant “trophozoïte”), uninucléée, est la plus abondante puisqu’elle représente 90 à 95% des formes parasitaires présentes dans les poumons des hôtes infectés. Cette forme végétative, qui mesure 2 à 8 µm de diamètre, présente un aspect irrégulier, améboïde. Elle possède une paroi cellulaire fine, avec une couche dense aux électrons, et a la particularité de présenter à sa surface de nombreuses extensions cytoplasmiques appelées filopodia ou filopodes. Ces prolongements tubulaires auraient pour rôle de : (i) faciliter l’attachement spécifique aux pneumocytes de type I (DeiCas et al., 1991), (ii) augmenter la surface de contact du parasite avec l’épithélium respiratoire et ainsi accroître les échanges nutritifs et gazeux avec les cellules hôtes (Itatani et Marshall, 1988 ; Nielsen et Settnes, 1991), (iii) agir comme récepteurs chimio-sensitifs (Itatani et Marshall, 1988) (Figure 2).

Le sporocyte mesure 3 à 5 µm de diamètre. De forme ovoïde, il se caractérise par une diminution du nombre de filopodes. Selon l’évolution de ce stade, on distingue :
♦ le sporocyte précoce, uninucléé, qui possède une paroi cellulaire semblable à celle de la forme trophique. Des complexes synaptonémaux y ont été observés (Matsumoto et Yoshida 1984, Peters, 2001) : ils correspondent à l’appariement des chromosomes homologues en prophase I de méiose.
♦ le sporocyte intermédiaire qui comporte 2 à 8 noyaux. Une couche intermédiaire peu dense aux électrons vient s’intercaler entre la membrane plasmique et la couche externe dense aux électrons.
♦ le sporocyte tardif qui présente une paroi cellulaire encore plus épaisse. Huit spores uninucléées vont progressivement s’y individualiser, par invagination de la membrane plasmique.

Le kyste mature mesure 4 à 7 µm. De forme arrondie, il possède une paroi cellulaire semblable à celle des sporocytes intermédiaires et tardifs et contient les huit spores bien individualisées. Une deuxième membrane à double feuillet lipidique a été décrite dans la paroi de ces spores (Vavra et Kucera, 1970): similaire à la membrane plasmique, elle couvre la face externe de la paroi cellulaire des spores. Cette membrane externe (ou « outermembrane ») est également retrouvée dans l’épaisseur de la couche externe dense aux électrons de la paroi kystique, affleurant la couche intermédiaire peu dense (DeStefano et al., 1990). Cette membrane externe pourrait jouer un rôle dans les mécanismes d’osmorégulation et dans l’incorporation d’éléments nutritifs. Elle pourrait également participer aux interactions cellule hôte/parasite et être une cible pour des agents antimicrobiens (DeStefano et al., 1990) (Tableau 1).

Méthodes d’observation des stades parasitaires de Pneumocystis 

Les différents stades parasitaires de Pneumocystis peuvent être identifiés après coloration panoptique au méthanol-Giemsa (Bommer, 1966). Cette coloration, couramment employée en recherche et pour le diagnostic de la pneumocystose, permet d’identifier les différents stades parasitaires de Pneumocystis et de les différencier d’autres microorganismes ou de débris cellulaires. Les noyaux des formes parasitaires sont colorés en pourpre et les cytoplasmes sont bleutés. La paroi des formes kystiques n’est en revanche pas colorée, elle apparaît comme un halo clair et réfringent. Les réactifs RAL-555 (Réactifs RAL) et Diff Quick (Andwin Scientific) commercialisés en kits permettent de réaliser rapidement (moins de 2 minutes) le même type de coloration panoptique, avec une qualité proche de celle du Giemsa (Soulez et al., 1988 ; Soulez et al., 1991 ; Tollerud et al., 1989 ; Dei-Cas et al., 2004).

Les formes parasitaires à paroi épaisse (sporocytes intermédiaires, tardifs et kystes) peuvent être mises en évidence par le Bleu de Toluidine Ortho (BTO) (Chalvardjian et Grawe, 1963). Ce colorant réagit avec les sucres complexes de la paroi cellulaire par métachromatie induite. Les parasites prennent alors une couleur bleue violacée et on peut observer une structure en forme de ‘virgule’ ou de ‘parenthèse’, indicatrice d’un épaississement localisé de la paroi kystique (Yoshikawa et al., 1987). Il existe également des techniques d’imprégnation argentique comme le Gomori-Grocott qui donne une couleur brune aux parasites, grâce à l’affinité du nitrate d’argent pour la couche intermédiaire de la paroi cellulaire, peu dense aux électrons (Grocott, 1955). On trouve également des anticorps monoclonaux qui, couplés à des fluorochromes ou à la peroxydase, permettent de détecter soit tous les stades parasitaires (Santa Cruz Biotechnology, Abcam), soit uniquement les formes kystiques (MONOFLUO KIT P. jirovecii (P. carinii), BioRad) (Figure 3).

Cycle biologique

Plusieurs hypothèses quant au cycle biologique de Pneumocystis ont été posées à partir d’observations en microscopie électronique, de reconstitutions 3D et plus récemment de données moléculaires. Différents auteurs ont proposés des cycles similaires, avec à la fois une phase de multiplication sexuée et une phase de multiplication asexuée (Yoshida, 1989 ; Cushion, 2004 ; Dei-Cas, 2004 ; De Souza et Benchimol, 2005, Thomas et Limper, 2007 ; Aliouat-Denis, 2008 ; Aliouat-Denis, 2009 ; Cushion et Stringer, 2010 ; Martinez et al., 2011). Du fait de l’absence de culture continue, la transition dynamique entre ces stades parasitaires n’a cependant jamais été suivie, empêchant de tester clairement ces hypothèses (Figure 4). Les études ultrastructurales menées sur des parasites d’hôtes d’espèces différentes ont permis de proposer plusieurs cycles biologiques (Campbell, 1972 ; Vossen et al., 1978 ; Yoshida, 1989). A partir de ses observations chez le rat et des données antérieures d’autres auteurs, Yoshida proposa en 1989 un cycle biologique combinant : (i) une phase asexuée au cours de laquelle les formes trophiques, haploïdes ou diploïdes, se multiplieraient par fission binaire et/ou endodiogénie ; (ii) une phase sexuée durant laquelle les spores haploïdes seraient formées et évolueraient après exkystement en formes trophiques. Quelques auteurs (Yamada et al., 1986 ; Stringer et Cushion, 1998 ; Wyder et al., 1998, Martinez et al., 2011) se sont intéressés à déterminer la ploidïe de Pneumocystis et sont parvenus à la conclusion que l’haploïdie était majoritaire en particulier chez les formes trophiques. Le passage par un stade diploïde existe cependant comme l’attestent les images ultrastructurales d’un complexe synaptonémal au stade sporocyte précoce (Matsumoto et Yoshida, 1984) et les analyses caryotypiques par électrophorèse en champ pulsé à 2 dimensions suggèrent également cette diploïdie (Cornillot et al., 2002). L’hypothèse, partagée par une majorité de scientifiques, serait donc qu’une méiose, suivie d’une mitose supplémentaire, aurait lieu chez les formes kystiques et que la fusion (ou mating) de deux formes trophiques serait un préalable à la reconstitution de la diploïdie (Cushion, 2004, Martinez et al., 2011). D’ailleurs, l’existence d’une conjugaison entre formes trophiques avait déjà été suggérée sur la base d’images ultrastructurales (Itatani, 1996). La formation des 8 spores haploïdes se ferait par invagination de la membrane plasmique prékystique autour de chacun des 8 noyaux. Leur mécanisme de libération n’est pas encore résolu. La paroi cellulaire kystique pourrait être fragilisée par l’augmentation du volume des spores. Après rupture de cette paroi, les spores seraient expulsées soit passivement (Vavra et Kucera, 1970 ; Vossen et al., 1978 ; Hasleton et al., 1981) soit activement via un pore (Itatani, 1994). Le processus de fusion entre deux cellules de types sexuels opposés ou mating nécessite la sécrétion mutuelle de phéromones spécifiques. La fixation de ces phéromones sur un récepteur membranaire couplé à une protéine G active une cascade de transduction du signal, impliquant une MAP kinase (« mitogen activated protein kinase »). Cette MAPK active à son tour plusieurs effecteurs cellulaires avec, pour conséquence, un blocage du cycle cellulaire,  l’initiation de la transcription des gènes impliqués dans le mating et, finalement, la fusion des cellules (Li et al., 2007). Récemment, des homologues fongiques de gènes impliqués dans ces phénomènes furent retrouvés dans le génome de Pneumocystis, confortant l’hypothèse de l’existence d’une multiplication sexuée. L’existence d’un cycle de reproduction sexuée a ainsi été renforcée par la découverte et l’expression hétérologue du gène Pcste3 (« Pneumocystis carinii STE3 ») codant pour un récepteur aux phéromones homologues du type ‘a’ (Smulian et al., 2001 ; Vohra et al., 2004). Ce récepteur transmembranaire n’est exprimé que par une sous population de formes trophiques. Il semble absent à la surface des formes kystiques (Vohra et al., 2004). Même si le ligand-phéromone du récepteur codé par Pcste3 ainsi que le couple récepteur-phéromone opposé n’ont pas encore été identifiés, ces résultats laissent supposer qu’une conjugaison a lieu chez Pneumocystis au stade forme trophique. Au niveau chromosomique, le gène Pcste3 se situe au milieu d’autres gènes, comme les homologues de ste11 et ste20, codant pour des protéines impliquées dans la voie de transduction du signal initiée en réponse aux phéromones (Smulian et al., 2001). Pcste20 (« P. carinii STE20 ») est exprimé suite à l’adhésion du parasite au niveau des cellules épithéliales alvéolaires (Kottom et al., 2003). L’expression hétérologue de ce gène chez des mutants de S. cerevisiae Δste20 a permis d’obtenir une croissance du champignon et de montrer son implication dans les voies de signalisation activées après le mating (Kottom et al., 2003). D’autres homologues (cdc31 de S. pombe par exemple) de gènes fongiques impliqués dans la méiose ont également été retrouvés dans une banque d’EST (« Expressed Sequence Tag ») de Pneumocystis (Cushion et al., 2007). Suite à ce mating, une cascade impliquant des MAP kinases est activée. Un gène codant pour une MAPK fut tout d’abord identifié chez P. carinii : cette kinase (PCM = « Pneumocystis cariniii MAP kinase ») est homologue à d’autres MAPK fongiques impliquées dans les phénomènes de prolifération et de différenciation (Thomas et al., 1998). Par la suite,des expériences d’expression hétérologue de PCM ont montré qu’elle pouvait restaurer la voie de signalisation induite par les phéromones chez des doubles mutants de Saccharomyces cerevisiae fus3/kss1 (Vohra et al., 2003). Cette kinase, majoritairement présente chez les formes trophiques, peut phosphoryler l’homologue du gène ste11 de Schizosaccharomyces pombe chez Pneumocystis (Vohra et al., 2003a). ste11 code en fait pour un facteur de transcription nécessaire à l’activation de gènes impliqués dans la conjugaison, suite à la fixation des phéromones. Après le mating des formes trophiques,  Ste11 activerait, indirectement Mei2, protéine qui joue un rôle dans l’induction et la progression de la méiose (Harigaya et al., 2007).

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Table des matières

INTRODUCTION
GENERALITES
1. HISTORIQUE
2. TAXONOMIE
3. MORPHOLOGIE ET CYCLE BIOLOGIQUE DE PNEUMOCYSTIS
3.1. Morphologie
3.1.1. Méthodes d’observation des stades parasitaires de Pneumocystis
3.2. Cycle biologique
3.2.1. Ploïdie
3.3. Interactions hôte/parasite
3.3.1. Adhésion de Pneumocystis aux cellules alvéolaires
3.3.2. Interactions avec la matrice extracellulaire
3.3.3. Interaction avec le surfactant
4. LA PNEUMOCYSTOSE
4.1. Facteurs de risque
4.1.1. Le risque lié à l’infection par le VIH
4.1.2. Les risques liés à d’autres causes d’immunodépression
4.2. Prévalence et incidence de la Pneumocystose
4.2.1. Population VIH
4.2.2. Population non VIH
4.3. Influence des variations saisonnières
4.4. Présentations cliniques
4.4.1. Pneumocystose
4.5. Diagnostic de la pneumonie à Pneumocystis
4.5.1. Prélèvements
4.5.2. Mise en évidence
4.6. Traitement
5. IMPLICATION DU SYSTEME IMMUNITAIRE
5.1. Immunité innée
5.2. Immunité adaptative
5.3. La réponse cytokinique
6. TRANSMISSION
6.1. Prévalence de la colonisation asymptomatique et impact clinique
6.2. Réactivation ou contamination de novo
6.3. Transmission horizontale et verticale
6.4. Source environnementale et forme infectante
6.5 Variations génétiques des isolats de Pneumocystis et conséquences sur la transmission
7. MODELES D’ETUDE
7.1. Modèles animaux
7.2. Modèles de culture in vitro
7.2.1. Les co-cultures
7.2.2. Les cultures axéniques
CONCLUSION

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