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Mode de préparation et conservation du matériel végétal
Les feuilles fraîches sont séchées au soleil. Elles sont ensuite broyées au moyen d’un microbroyeur (CULATTI) jusqu’à pulvérisation. La poudre fine ainsi obtenue est conservée à la température ambiante. Elle constitue notre matériel végétal de départ.
LES PRODUITS CHIMIQUES
Les produits chimiques utilisés sont des produits de qualité pure ou pour analyse et sont essentiellement de marque MERCK, PROLABO, BDH, ….
Des plaques de gel de silice KIESELGEL 60 F254 de marque MERCK, de dimension 20 cm x 20 cm, sont utilisées pour la chromatographie sur couche mince. Il s’agit d’un gel de silice pourvu d’indicateur fluorescent étalé sur feuille plastique et dont l’épaisseur de la couche est de 0,2 mm.
METHODES D’ EXTRACTION
Extraction à froid
La poudre de feuille est mise en suspension dans le solvant d’extraction (eau distillée ou éthanol absolu), suivant un rapport 1/10 (p/v). Le mélange, soumis à une agitation magnétique pendant 3 h à la température ambiante, est ensuite laissé macérer pendant une nuit à 4° C. Le macérat est filtré sur quatre épaisseurs de gaze pour éliminer les tourteaux. Le filtrat obtenu est centrifugé à 3000 tours par min pendant 30 min à l’aide d’une centrifugeuse de marque PARIS LABO (cette même centrifugeuse sera employée pour toutes les opérations de centrifugation ultérieures). Le surnageant est récupéré et le culot éliminé.
Dans l’extraction aqueuse, le surnageant est concentré tandis que dans l’extraction alcoolique, il est débarrassé du solvant par évaporation sous pression réduite (cf. § 2.2.3. p.13). Dans les deux cas, le volume final est de 1 ml pour 1 g de matériel de départ.
Une autre centrifugation à 3000 tours par min pendant 15 min est nécessaire afin d’éliminer le précipité apparu lors de la concentration pour que l’extrait brut obtenu soit limpide.
Extraction à chaud à reflux
La poudre de feuille est délayée dans de l’eau distillée selon le rapport 1/10 (p/v). Le mélange ainsi obtenu est chauffé à reflux sous agitation magnétique à 70° C pendant 2 h, puis laissé macérer pendant une nuit à 4° C.
Le macérat est filtré sur quatre épaisseurs de gaze afin de le débarrasser des tourteaux. Le filtrat obtenu est centrifugé à 3000 tours par min pendant 30 min. Le culot est éliminé et le surnageant concentré jusqu’à un volume final de 1 ml pour 1 g de matériel de départ.
Précipitation par l’éthanol 50%
Principe
Le pouvoir dissolvant de l’eau est diminué par addition d’un solvant organique peu polaire miscible à l’eau. Un tel traitement décroît la solubilité des molécules dissoutes et entraîne leur précipitation.
Mode opératoire
L’extrait, sous agitation magnétique, est additionné goutte-à-goutte d’un égal volume d’éthanol absolu. Le mélange est laissé au repos à 4° C pendant 15 min, temps nécessaire pour parfaire la formation de précipité, puis centrifugé à 3000 tours par min pendant 15 min.
L’éthanol contenu dans le surnageant est éliminé par évaporation, tandis que le culot est repris dans de l’eau distillée.
Dialyse
Principe
La dialyse est une technique permettant de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane appelée membrane de dialyse qui est constituée par du cellophane sous forme de cylindre allongé, fermé aux deux extrémités et qui contient le liquide à dialyser. Ce cylindre prend alors le nom de boudin de dialyse. La perméabilité sélective de la membrane permet la séparation des grosses molécules des petites en établissant un phénomène d’osmose et de diffusion. La membrane sépare ainsi deux solutions de concentrations différentes : le liquide à dialyser et le liquide de contre-dialyse contenu dans un récipient dans lequel est placé le boudin de dialyse et contre lequel s’effectue la dialyse. Les solutés diffusent de la solution la plus concentrée vers la plus diluée. Le phénomène s’achève dès que l’équilibre de concentration entre les deux solutions est atteint (MAHUZIER et HAMON, 1990 ; KAMOUN, 1991 ; AUDIGIER, 1992).
La vitesse de la dialyse est influencée par :
– la température
– le rapport surface de la membrane / volume de la solution à dialyser
– le calibre des pores de la membrane
– le temps de contact
– la différence de concentrations entre les deux milieux.
Mode opératoire
La membrane de dialyse contient de la glycérine, des composés sulfurés et des métaux lourds qu’il faut préalablement éliminer. Pour ce faire, elle est mise à bouillir dans de l’eau distillée pendant 15 min. L’eau est ensuite changée et l’opération est répétée trois fois. La membrane ainsi préparée peut être conservée dans de l’eau distillée à 4° C pendant quelques jours.
Le boudin de dialyse contenant l’extrait à dialyser est noué à ses deux extrémités en prévoyant suffisamment d’espace pour les échanges. Il est immergé complètement dans le liquide de contre-dialyse. La formation de gradient de concentration des substances diffusibles dans le bécher qui contient le liquide de contre-dialyse est évitée par agitation magnétique. L’utilisation d’un volume important de liquide de contre-dialyse ou son fréquent renouvellement permet d’accélérer la dialyse.
Fractionnement par le n-butanol
C’est une technique d’extraction liquide-liquide basée sur la solubilité relative d’une ou de plusieurs substances vis-à-vis de deux solvants non miscibles, et utilisant son ou leur transfert d’une phase liquide (phase aqueuse) à une autre phase liquide (phase butanolique) (MAHUZIER et HAMON, 1990).
Mode opératoire
A l’extrait aqueux placé dans une ampoule à décanter est ajouté un égal volume de n-butanol. Le mélange est agité fortement, puis laissé reposer jusqu’à décantation totale aboutissant à la formation de deux phases bien nettes : une phase supérieure butanolique ou phase organique et une phase inférieure aqueuse. Les deux phases sont récupérées séparément et la phase aqueuse est soumise de nouveau à deux autres fractionnements successifs.
Les trois phases butanoliques obtenues sont rassemblées, puis filtrées sur papier filtre afin d’éliminer les gouttelettes d’eau de saturation. Un grand volume d’eau distillée est ajouté au filtrat ainsi obtenu, le butanol est ensuite évaporé.
La phase aqueuse est débarrassée des traces de butanol par évaporation après addition d’eau distillée.
Précipitation par le mélange acétone / éther
Il s’agit d’un procédé de fractionnement basé sur les différences de solubilité. Les substances les moins solubles précipitent par diminution du pouvoir dissolvant du milieu, consécutive à l’addition d’un solvant moins polaire.
Mode opératoire
L’extrait à traiter est évaporé à sec. Le résidu obtenu est repris dans du méthanol selon le rapport 3/5 (p/v). Les substances peu solubles sont précipitées par addition goutte-à-goutte d’un volume déterminé du mélange acétone / éther (v/v). Le traitement se poursuit jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité. Toute cette opération est réalisée à basse température dans un bac à glace et sous agitation magnétique. Le mélange est ensuite laissé reposer à froid jusqu’à décantation complète du précipité formé. Le surnageant est aspiré puis éliminé, tandis que le précipité est récupéré dans de l’ eau distillée. Les traces de solvant sont éliminées par évaporation.
Précipitation par l’acétate neutre de plomb
L’acétate neutre de plomb (ANP), tout comme d’autres sels de métaux lourds, permet la défécation d’extraits biologiques en précipitant les grosses molécules comme les protéines, les acides nucléiques, les polysaccharides ainsi que d’autres molécules telles que les acides organiques.
Mode opératoire
Une solution aqueuse d’ANP à 20% (p/v) de volume déterminé est ajoutée goutte-à-goutte dans l’extrait soumis à une agitation magnétique. Le précipité formé est écarté par centrifugation à 3000 tours par min pendant 10 min.
Un volume déterminé d’une solution aqueuse de phosphate disodique à 10% (p/v) est versé goutte-à-goutte au surnageant afin d’éliminer l’excès de plomb qui s’y trouve. Une autre centrifugation à 3000 tours par min pendant 10 min est réalisée afin d’écarter le précipité formé. Le surnageant est récupéré.
Filtration sur charbon actif
Principe
Le charbon est un adsorbant peu spécifique ayant une affinité pour des substances de nature aromatique. Il est utilisé en chromatographie pour la déprotéinisation ou la décoloration des extraits liquides ainsi que pour la séparation des acides aminés aromatiques.
Mode opératoire
La technique utilisée est celle développée par JEANNODA (1986). Une couche de charbon actif (MERCK) est déposée dans un entonnoir bouché avec de la laine de verre. L’entonnoir muni d’un bouchon en caoutchouc est monté sur une fiole à vide. La couche de charbon est préalablement humectée d’eau distillée avant d’y déposer l’extrait à purifier. La filtration est assurée par une légère aspiration à l’aide d’une pompe à vide. Le filtrat obtenu est filtré sur membrane millipore de porosité 0,45 µm afin d’éliminer les éventuelles fines particules de charbon, rendant le filtrat grisâtre. Ce filtrat est par la suite concentré.
METHODE DE CONCENTRATION
Toute opération de réduction de volume, de concentration et d’évaporation de solvant est réalisée à l’aide d’un évaporateur rotatif HEIDOLPH. La température est de 55° C et la pression est réduite au moyen d’une pompe à vide.
Chromatographie sur couche mince
C’est une technique d’analyse permettant d’apprécier l’homogénéité d’extraits. Elle fait intervenir des phénomènes de partage et d’adsorption. Elle utilise le transfert des substances à séparer d’une phase stationnaire ou fixe vers une autre qui est mobile. La vitesse de déplacement est fonction de l’affinité des substances pour la phase mobile organique d’une part, et des forces d’adsorption dues au support stationnaire d’autre part (RANDERATH, 1964 ; VERNIN, 1970 ; AUDIGIER, 1989 ; MAHUZIER et HAMON, 1990).
Mode opératoire
Dépôt des échantillons
Sur une plaque découpée aux dimensions voulues, les extraits à chromatographier sont déposés à l’aide d’un capillaire en fins tirets horizontaux de 7 mm de long, espacés de 6 mm et situés à 1,5 cm du bord inférieur et à 1,3 cm des bords latéraux de la plaque. Les dépôts sont séchés à l’aide d’un séchoir à main.
Développement
La plaque précédemment préparée est placée verticalement dans une cuve à chromatographie DESAGA préalablement saturée par les vapeurs du solvant de migration en tapissant ses parois internes de papier filtre imprégné de solvant.
Le système de solvant Butanol / Acide acétique / Eau distillée (B/A/E) 60/20/20 (p/p) est utilisé comme solvant de migration.
Il s’agit d’une migration ascendante qui est arrêtée dès que le front du solvant arrive à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque. La plaque est retirée de la cuve puis séchée au moyen d’un séchoir à main.
Révélation des chromatogrammes
La révélation des chromatogrammes est assurée par deux méthodes :
– 1ère méthode : examen des spots en lumière ultraviolette à 254 nm et à 366 nm.
– 2ème méthode : pulvérisation sur la plaque du réactif à la ninhydrine ou celui à la vanilline-sulfurique. La pulvérisation du premier réactif entraîne des taches roses ou violettes quelques minutes après séchage à l’air chaud. Pour le second réactif, sa pulvérisation provoque l’apparition de taches roses violacées qui noircissent après chauffage à l’étuve à 120° C pendant 5 min.
Les compositions de ces réactifs peuvent être consultées en annexe II (p.64).
Détection des familles chimiques (criblage phytochimique)
Pour chaque opération de détection, le résidu d’évaporation à sec de 1 ml de l’extrait à étudier est utilisé.
Les alcaloïdes
– Macération chlorhydrique
Le résidu d’évaporation à sec est macéré dans 3 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2N. Le mélange obtenu est filtré sur du papier filtre. Le filtrat est ensuite réparti dans quatre tubes à essai dont un sert de témoin et les trois autres pour les tests préliminaires. Ces derniers sont relatifs à ceux de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF.
Les compositions des réactifs sont données en annexe II (p.64).
– Déroulement des tests.
Cinq gouttes de chaque réactif sont ajoutées dans chacun des trois tubes.
L’apparition d’un précipité ou d’une floculation démontre la présence d’alcaloïdes dans l’extrait à analyser (DALTON, 1979 ; CORDELL, 1981 ; BRUNETON, 1993 ).
– Tests de confirmation.
La réalisation des tests de confirmation s’avère nécessaire dans le cas où les résultats des tests préliminaires seraient positifs.
Le résidu d’évaporation à sec est repris dans 3 ml d’HCl 5%. La solution obtenue est agitée dans un bain-marie bouillant pendant 5 min. Après refroidissement, le milieu est alcalinisé par l’ammoniaque, puis la solution est extraite trois fois par le chloroforme. Les solutions chloroformiques obtenues sont rassemblées puis évaporées à sec. Les substances à groupement ammonium quaternaire et N-oxyde éventuellement présentes se retrouvent dans la phase aqueuse alcaline qui est alors acidifiée par l’HCl 2N. La solution obtenue est filtrée. Le filtrat est réparti dans quatre tubes dont un sert de témoin. Les trois autre tubes sont testés respectivement par les réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF. La formation d’un précipité blanc soluble dans l’éthanol confirme la présence d’alcaloïdes dans l’extrait à tester.
Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes (FONG et coll., 1977)
Le résidu d’évaporation à sec est repris dans 3 ml d’éthanol 80%, puis filtré sur papier filtre. Le filtrat obtenu est réparti dans quatre tubes à essai dont un sert de témoin.
Les flavonoïdes : test de WILSTATER (test à la cyanidine)
Dans le premier tube, 0,5 ml d’acide chlorhydrique concentré et deux tournures de magnésium sont additionnés.
Dans le deuxième tube, outre les composants précédents, 1 ml d’eau distillée et 1 ml d’alcool isoamylique sont versés.
La présence de flavonoïdes est indiquée par les virages de coloration suivants :
au rouge pour les flavones ;
au rouge violacé pour les flavonones ;
au pourpre pour les flavonols.
Les leucoanthocyanes : test de BATE – SMITH (FONG et coll., 1977)
Dans le troisième tube : 0,5 ml d’acide chlorhydrique concentré est additionné, puis le tout est porté au bain-marie bouillant pendant 30 min.
Si après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge est observée, l’extrait renferme alors des leucoanthocyanes.
Les tanins et les polyphénols (HEMINGWAY et KARCHESY, 1989)
Le résidu d’évaporation à sec est dissous dans 3 ml d’eau distillée chaude. Le mélange est partagé dans quatre tubes à essai dont le premier sert de témoin et les trois autres pour analyser la présence ou non de tanins et pour identifier les types éventuellement présents.
Test à la gélatine
Au contenu du premier tube sont ajoutées quatre gouttes de gélatine aqueuse à 1% (p/v).
L’apparition d’un précipité révèle la présence de tanins hydrosolubles de type catéchique.
Test à la gélatine salée
Au contenu du deuxième tube sont additionnées quatre gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse à 1% mélangée avec du NaCl à 10%).
La formation d’un précipité démontre la présence de tanins condensés de type pyrogallique.
Test au chlorure ferrique
Au contenu du troisième tube sont versées quatre gouttes de chlorure ferrique 10% en solution méthanolique.
La présence de tanins se manifeste par un changement de la coloration du contenu du tube en :
bleu verdâtre pour les tanins de type catéchol ;
bleuâtre pour ceux de type pyrogallol.
Si le test à la gélatine est négatif alors que le test au chlorure ferrique est positif, l’extrait à analyser contient des composés polyphénoliques autres que les tanins.
Les anthraquinones : test de BORNTRÄGER
Le résidu d’évaporation à sec est dissous dans 3 ml d’eau distillée. La solution ainsi obtenue est transvasée dans une ampoule à décanter puis additionnée d’un égal volume de benzène. Le mélange est secoué énergiquement puis laissé au repos. La formation de deux phases est observée : une phase aqueuse et une phase benzènique. Cette dernière est recueillie puis ajoutée de cinq gouttes d’ammoniaque à 25%.
Après agitation du mélange, le virage au rouge de la phase alcaline (phase inférieure) indique la présence d’anthraquinones dans l’extrait à analyser.
Les saponines (FONG et coll., 1977)
Le résidu d’évaporation à sec est dissous dans 3 ml d’eau distillée. La solution obtenue est fortement agitée pendant 30 s.
La présence de saponines dans l’extrait à analyser se traduit par la formation d’une mousse d’une hauteur de 3 cm, persistante pendant 30 min.
Les stéroïdes et triterpènes et les stérols insaturés (FONG et coll., 1977)
Le résidu d’évaporation est repris dans 3 ml de chloroforme. La solution obtenue est filtrée sur papier filtre. Le filtrat est distribué dans trois tubes à essai dont le premier sert de témoin.
Les stéroïdes et triterpènes : test de LIEBERMANN – BÜRCHARD
Dans le deuxième tube, deux gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées au filtrat précédemment obtenu. Le mélange est ensuite soumis à une légère agitation. Quelques gouttes d’acide sulfurique concentré sont ensuite additionnées au mélange en inclinant le tube.
L’observation se fait au bout d’une heure. La présence de triterpènes est révélée par l’apparition d’un anneau rouge ou violet à l’interface, tandis que celle des stéroïdes se manifeste par une coloration verdâtre de la phase aqueuse. Les deux phénomènes peuvent être observés simultanément.
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Table des matières
PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE DES PRINCIPES TOXIQUES
1. Introduction
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériels
2.1.1. Matériel végétal
2.1.1.1. Description botanique de Deinbollia boinensis
2.1.1.2. Distribution géographique et lieu de récolte
2.1.1.3. Mode de préparation et conservation du matériel végétal
2.1.2. Les produits chimiques
2.2. Méthodes
2.2.1. Méthodes d’extraction
2.2.1.1. Extraction à froid
2.2.1.2. Extraction à chaud à reflux
2.2.2. Méthodes de purification
2.2.2.1. Précipitation par l’éthanol 50%
2.2.2.1.1. Principe
2.2.2.1.2. Mode opératoire
2.2.2.2. Dialyse
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.2.3. Fractionnement par le n-butanol
2.2.2.3.1. Principe
2.2.2.3.2. Mode opératoire
2.2.2.4. Précipitation par le mélange acétone / éther
2.2.2.4.1. Principe
2.2.2.4.2. Mode opératoire
2.2.2.5. Précipitation par l’acétate neutre de plomb
2.2.2.5.1. Principe
2.2.2.5.2. Mode opératoire
2.2.2.6. Filtration sur charbon actif
2.2.2.6.1. Principe
2.2.2.6.2. Mode opératoire
2.2.3. Méthode de concentration
2.2.4. Méthodes d’analyse
2.2.4.1. Chromatographie sur couche mince
2.2.4.1.1. Principe
2.2.4.1.2. Mode opératoire
2.2.4.1.2.1. Dépôt des échantillons
2.2.4.1.2. Développement
2.2.4.1.2.3. Révélation des chromatogrammes
2.2.4.2.1. Les alcaloïdes
2.2.4.2.2. Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
2.2.4.2.2.1. Les flavonoïdes : test de WILSTATER (test à la cyanidine)
2.2.4.2.2.2. Les leucoanthocyanes : test de BATE – SMITH
2.2.4.2.3. Les tanins et les polyphénols
2.2.4.2.3.1. Test à la gélatine
2.2.4.2.3.2. Test à la gélatine salée
2.2.4.2.3.3. Test au chlorure ferrique
2.2.4.2.4. Les anthraquinones
2.2.4.2.5. Les saponines
2.2.4.2.6. Les stéroïdes et triterpènes et les stérols insaturés
2.2.4.2.6.1. Les stéroïdes et triterpènes : test de LIEBERMANNBÜRCHARD.
2.2.4.2.6.2. Les stérols insaturés : test de SALKOWSKI
2.2.4.2.7. Les désoxyoses
2.2.4.2.8. Les iridoïdes
3. Résultats
3.1. Extraction
3.2. Purification
3.2.1. Précipitation par l’éthanol 50%
3.2.2. Dialyse
3.2.3. Fractionnement par le n-butanol
3.2.4. Précipitation par le mélange acétone / éther
3.2.5. Précipitation par l’acétate neutre de plomb
3.2.6. Filtration sur charbon actif
3.2.7. Degré d’homogénéité des différents extraits
3.2.8. Rendement
.3. Caractérisation chimique
3.3.1. Propriétés physico-chimiques
3.3.2. Nature chimique
4. Discussions et conclusion
DEUXIEME PARTIE : ETUDE DES PROPRIETES TOXICOLOGIQUES DES EXTRAITS DE FEUILLES DE Deinbollia boinensis
1. Introduction
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériels
2.1.1. Les animaux d’expérimentation
2.1.1.1. Les animaux à sang chaud
2.1.1.1.1. Les souris
2.1.1.1.2. Les autres espèces
2.1.1.2. Les animaux à sang froid
2.1.1.2.1. Les alevins de poisson
2.1.1.2.2. Les têtards de grenouille
2.1.1.3. Les insectes
2.1.2. Les végétaux d’expérimentation
2.1.3. Les souches microbiennes utilisées comme germes-test
2.1.4. Les milieux de culture
2.1.5. Stérilisation
2.2. Méthodes
2.2.1. Méthodes d’étude de l’extrait sur les animaux
2.2.1.1. Tests sur des animaux à sang chaud
2.2.1.1.1. Expérience sur la souris
2.2.1.1.1.1. Estimation de la toxicité
2.2.1.1.1.2. Détermination de la DL50 (24 h)
2.2.1.1.1.3. Examens histopathologiques
2.2.1.1.1.3.1. Prélèvement et fixation des organes
2.2.1.1.1.3.2. Inclusion
2.2.1.1.1.3.3. Microtomie et étalement des coupes
2.2.1.1.1.3.4. Coloration des coupes et montage des lames
2.2.1.1.2. Test de sensibilité avec d’autres espèces
2.2.1.1.3. Test hémolytique
2.2.1.1.3.1. Principe
2.2.1.1.3.2. Mode opératoire
2.2.1.2. Tests sur des animaux à sang froid
2.2.1.2.1. Principe
2.2.1.2.2. Mode opératoire
2.2.1.2.2.1. Test sur les alevins de carpe
2.2.1.2.2.2. Test sur les têtards de grenouille
2.2.1.3. Test sur les insectes
2.2.2. Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
2.2.2.1. Effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.2.2. Effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.2.3. Effets sur le développement des bourgeons axillaires
2.2.3. Méthodes d’étude des effets des extraits sur la croissance des microorganismes
2.2.3.1. Isolement et purification des germes
2.2.3.1. Isolement
2.2.3.2. Purification
2.2.3.2. Identification des germes
2.2.3.2.1. Méthode de coloration GRAM
2.2.3.2.2. Identification
2.2.3.2.2.1. Milieu de SIMMONS (citrate de sodium)
2.2.3.2.2.2. Milieu mannitol-mobilité-nitrate
2.2.3.2.2.3. Milieu HAJNA – KLIGLER (lactose-glucose-H2S)
2.2.3.2.2.4. Milieu lysine-fer
2.2.3.2.2.5. Milieu urée-indole
2.2.3.3. Spectre d’activité anti-microbienne des extraits
2.2.3.3.1. Principe
2.2.3.3.2. Mode opératoire
3. Résultats
3.1. Effets de l’extrait sur les animaux
3.1.1. Effets de l’extrait sur les animaux à sang chaud
3.1.1.1. Effets sur la souris
3.1.1.1.1. Description des symptômes développés après injection d’une dose létale
3.1.1.1.2. Description des symptômes développés après injection d’une dose sublétale
3.1.1.1.3. Evaluation de la toxicité (DL50 24 h)
3.1.1.1.4. Examens histopathologiques
3.1.1.2. Etude de la sensibilité des autres espèces
3.1.1.3. Effets de l’extrait sur les hématies de mouton
3.1.2. Effets de l’extrait sur les animaux à sang froid
3.1.2.1. Effets sur les alevins de carpe
3.1.2.2. Effets sur les têtards de grenouille
3.1.3. Effet de l’extrait sur les larves de moustique
3.2. Effets des extraits sur les végétaux
3.2.1. Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif des graines
3.2.2. Effets de l’extrait brut sur la croissance de jeunes plantules
3.2.3. Effets des extraits sur la levée de la dominance apicale
3.3. Effets des extraits sur la croissance des microorganismes
3.3.1. Isolement et identification des germes
3.3.2. Recherche des propriétés anti-microbiennes des extraits
4. Discussions et conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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