Mode de calcul pour le cas d’un dénombrement ( ISO 7218)

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Pression osmotique et activité de l’eau (aw)

Dans l’eau pure, la levure absorbe par endosmose ou par la loi de diffusion cette eau et celle-ci augmente de volume et perd sa capacité à fermenter les sucres. Dans un milieu sec, celle-ci parait réduite à sa membrane. Toutefois, elle peut former de la zymase, transformer le sucre de canne et fermenter celui-ci (Malepeyre, 1875). En effet, les réactions biochimiques des levures nécessitent la disponibilité d’une certaine quantité d’eau appelée aw. La plupart des souches peuvent se développer à des activités de l’eau comprises entre 0,62 et 0,93 (Delarras, 2007). Généralement, les levures résistent mieux à la pression osmotique grâce à leur capacité à accumuler des polyols comme osmoprotecteurs (Bougeois et Leveau, 1991). Les espèces se développant à de fortes pressions osmotiques qualifiées d’osmophiles présentent un métabolisme lent (Bouix et Leveau, 1991 ; Bouix et Leveau, 1979).

Reproduction des levures

Les levures se multiplient par mitose, processus de reproduction suivant lequel une cellule se fragmente pour donner deux cellules filles. Cette multiplication végétative se présente sous deux aspects le bourgeonnement et la scissiparité. Certaines espèces de levures se multiplient par voie sexuée avec alternance d’une phase haploïde et d’une phase diploïde.

Multiplication asexuée

La gemmiparité et la scissiparité sont les deux modes de multiplication asexuée des levures. Ces deux processus présentent peu d’éléments de démarcation et aboutissent à la formation de nouveaux individus ayant la même information héréditaire. Pour la gemmiparité, après l’interphase, une petite hernie apparaît en un point de la surface d’une cellule mère, grossit et s’étrangle ; le bourgeon ou cellule fille peut alors se détacher, grossir encore, bourgeonner à son tour. L’état unicellulaire est facile à réaliser en milieu liquide agité, mais en milieu solide, le bourgeonnement donne naissance à des thalles buissonnants, formés de cellules de levure bout à bout qui, par accumulation, forment des colonies visibles à l’œil. Chez d’autres levures (Kloeckera, Hanseniaspora…), le bourgeonnement a lieu aux deux pôles de la cellule, qui prend fréquemment un aspect biapiculé ou en citron (Boiden et al, 2014). Cependant, certaines levures de distillerie ne bourgeonnent pas et se multiplient par fission (Schizosaccharomyces). A la fin de ce processus, il se forme une paroi au grand axe de la cellule permettant d’obtenir des cellules filles de taille similaire (Larone, 2011).
La figure 2 présente le bourgeonnement d’une cellule levurienne avec quelques cicatrices de bourgeonnements antérieurs.

Composition nutritionnelle

La composition nutritionnelle du tubercule de patate douce est rapportée dans de nombreux travaux. A partir de données issues de nombreuses études consultées, la teneur en moyenne en MS du tubercule est d’environ 30 %, mais elle est extrêmement variable d’une étude à l’autre (19 à 40 %). Le tubercule de patate est riche en amidon (86 % en moyenne). Comme pour le manioc, la teneur en protéine de la patate est relativement faible (5,1 % en moyenne) et inconstant en fonction des variétés. En moyenne, la teneur en énergie brute (EB) est de 16,5 MJ/kg (Sauvant et al., 2004). La composition de la matière sèche révèle 4,1% de cellulose brute (CB), 3,5% de cendres (MM), et 5,8% de matière azoté totale. La patate douce contient des facteurs antinutritionnels ayant une activité anti-trypsique (Ly, 2009). Elle est riche en vitamine et renferme de nombreux minéraux. La composition nutritionnelle pour 100g de tubercule est donnée dans le tableau 1 suivant.

Préparation de la suspension mère (NFV 08 002)

25g de l’échantillon de patate douce à étudier ont été découpés en petits morceaux, mis en suspension dans 225g d’eau peptonée tamponnée (EPT) dans un sachet stérile. Le contenu du sachet est ensuite homogénéisé dans un stomacher.

Préparation des dilutions (NF V08-010)

Les dilutions décimales sont préparées à partir de la suspension mère. 1ml de la suspension mère est additionné à 9ml d’eau distillée dans un tube stérile pour former la dilution 10-1. La dilution 10-2 se prépare avec 1ml de ce mélange additionné à 9ml de diluant et ainsi de suite jusqu’à la dernière dilution (10-4).

Mode opératoire

Les milieux stériles, conditionnés dans des tubes vissés ont été d’abord régénérés par un passage pendant 30 min au bain bouillant, puis refroidi. Un ensemencement profond en spirale est ensuite effectué. Apres incubation pendant 24h à 37°C, 5 cas peuvent se présenter : -Développement des microorganismes, caractérisé par la turbidité en profondeur du milieu de culture, il s’agit des germes anaérobies stricts.
-Prolifération des microorganismes dans la zone superficielle du milieu de culture : ce sont les germes aérobies stricts.
-Développement sur toute la hauteur du milieu avec une abondance près de la zone superficielle : ce sont les germes aéro- anaérobies facultatifs.
-Croissance sur toute la hauteur du milieu, mais plus marquée en profondeur, il s’agit des germes anaéro – aérobies facultatifs.
-Croissance dans la zone intermédiaire aérobiose – anaérobiose ; il s’agit des germes micro-aérophiles.

Etude des caractères biochimiques

L’étude des caractères biochimiques des levures consiste à rechercher les modifications apportées au milieu de culture par le métabolisme du germe afin de définir l’équipement enzymatique spécifique de celui-ci. Elle est effectuée sur des galeries biochimiques constituées par de nombreux milieux différentiels comme le milieu Hajna Kligler, le milieu citrate de Simmons, le milieu viande-foie, le milieu Mannitol-Mobilite-Nitrate, le milieu Lysine-Fer. L’Auxanogramme du carbone complète cette étude.

Milieu Hajna- Kligler

Ce milieu solide de couleur rouge est composé de 2 parties : le culot contenant du glucose et la pente formée par le lactose.

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Table des matières

Première partie: SYNTHESE BIBLIOGRPHIQUE
1. LES LEVURES
1.1. Généralités
1.2. Morphologie
1.3. Ecologie
1.4. Besoins nutritionnels
1.4.1. Source de carbone
1.4.2. Source d’azote
1.4.3. Autres éléments minéraux
1.4.4. Les facteurs de croissance
1.5. Métabolisme
1.6. Besoins physicochimiques
1.6.1. Effets de la Température
1.6.2. pH
1.6.3. Besoin en oxygène.
1.6.4. Pression osmotique et activité de l’eau (aw)
1.7. Reproduction des levures
1.7.1. Multiplication asexuée
1.7.2 Multiplication sexuée
1.8. Aptitude à la filamentation
1.9. Morphologie des spores
1.10. Classification
1.11. Applications des levures en biotechnologie
2. LA PATATE DOUCE : Ipomea batatas
2.1. Généralités et description botanique
2.2. Position systématique
2.3. Composition nutritionnelle
3. INTERACTIONS LEVURES-PLANTES
Deuxième partie: MATERIELS ET METHODES
1.MATERIELS
1.1. Matériel végétal
1.2. Matériels de laboratoire
2.METHODES
2.1. Récolte des tubercules
2.2. Milieu de culture
2.3. Dénombrement et isolement
2.3.1. Préparation de la suspension mère (NFV 08 002)
2.3.2. Préparation des dilutions NF V (08-010)
2.4. Dénombrement des levures (NFV 08 059)
a. Principe
b. Mode opératoire
2.5. Mode de calcul pour le cas d’un dénombrement ( ISO 7218)
2.6. Isolement et purification
2.7. Identification
2.7.1. Etude des caractères culturaux
a. Principe
b. Mode opératoire
2.7.2. Etude des caractères morphologiques
a. Principe
b. Mode opératoire
2.7.3. Etude des caractères physiologiques
a. Principe
b. Mode opératoire
2.7.4. Etude des caractères biochimiques
A. Milieu Hajna- Kligler
a. Principe
b. Mode opératoire
B. Milieu Citrate de Simmons
a. Principe
b. Mode opératoire
C. Milieu lysine – Fer
a. Principe
b. Mode opératoire
D. Milieu Mannitol Mobilité Nitrate
a. Principe
b. Mode opératoire
E. Auxanogramme de carbone
a. Principe
b. Mode opératoire
2.8. Etude de l’influence de la temperature
a. Principe
b. Mode opératoire
2.9. Conservation des souches
a. Principe
b. Mode opératoire
Troisième partie: RESULTATS ET DISCUSSIONS
1.Récolte des tubercules
2.Dénombrement
3.Isolement et purification
4.Identification
4.1. Etude des caractères culturaux
4.2. Etude des caractères morphologiques cellulaires
4.3. Etude des caractères physiologiques
4.3. Etude des caractères biochimiques
5.Etude de l’influence de la température
6.Détermination du genre et de l’espèce des souches
7.Discussion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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