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Le 2,4,6-Trinitrotoluène et ses intermédiaires de formations
Le 2,4,6-trinitrotoluène (2,4,6-TNT), également appelé tolite, a été préparé pour la première fois en 1863 par Wilbrand et a été fabriqué en Allemagne à partir de 1891, à l’initiative de Haussermann, à l’échelle industrielle comme alternative à l’acide picrique présenté par la suite (cf. I. 2. 2. 2). Le 2,4,6-TNT a rapidement été adopté par la plupart des armées au cours de la première guerre mondiale en raison de sa facilité de mise en oeuvre.
Ce composé résulte de la nitration du toluène, lui-même issu de la distillation du pétrole. Le procédé de nitration par substitution électrophile aromatique requiert l’utilisation d’acide nitrique et d’acide sulfurique anhydre à très haute température pour former l’ion nitronium, puissant électrophile [4-6]. En effet, l’acide sulfurique protone l’acide nitrique, qui après élimination d’eau, forme cet ion nitronium. Ce dernier va ainsi pouvoir réagir sur les électrons π délocalisés du noyau aromatiques. La présence du groupement méthyle (CH3) sur le noyau aromatique va orienter et faciliter cette nitration grâce à son caractère électrodonneur. Les différentes étapes de la mononitration du toluène sont illustrées Figure I. 2.
La mononitration permet d’obtenir majoritairement l’orthonitrotoluène (2-NT, 59,2%) et le paranitrotoluène (4-NT, 36,1%). Le métanitrotoluène (3-NT, 4,7%) est considéré comme une impureté car il ne permet pas d’obtenir par la suite le 2,4,6-TNT. Le groupement nitro (NO2) attracteur d’électrons, désactivent le noyau aromatique, la suite de la réaction est donc de plus en plus lente. La dinitration va permettre d’obtenir majoritairement les 2,4-dinitrotoluène (2,4-DNT, 75,6%) et 2,6-dinitrotoluène (2,6-DNT, 19,7%) car le groupement nitro oriente en méta. Enfin, la trinitration permet d’obtenir le 2,4,6-TNT à partir des dinitrotoluènes précédents. Ces derniers ne sont pas totalement consommés lors de cette étape et sont donc souvent présents dans des charges explosives à base de 2,4,6-TNT. De plus, ils ont également des propriétés explosives et peuvent donc être utilisés en tant que tel. Cependant, ils sont rarement employés seuls mais plutôt dans des mélanges comme certaines poudres propulsives. La Figure I. 3 présente tous les composés obtenus lors de la formation du 2,4,6-TNT.
Le 2,4,6-TNT, comme les nitroaromatiques en général, est un composé très stable vis-à-vis de la température. Ce composé est également stable en milieu aqueux, en milieu acide et en milieu alcalin doux. Cependant, il donnera des complexes colorés instables en présence de base forte [1, 4, 7] à cause de la présence des groupements nitro qui sont attracteurs d’électrons [5]. Il a l’avantage d’être un explosif peu sensible aux contraintes extérieures tels que le choc ou la friction et nécessitera un explosif primaire pour détoner. Il est d’ailleurs intéressant de remarquer que le 2,4,6-TNT est utilisé pour flegmatiser, c’est-à-dire rendre moins sensible, certains explosifs secondaires plus sensibles comme l’hexogène (RDX) ou l’octogène (HMX). Ainsi les propriétés du 2,4,6-TNT, notamment en terme de stabilité, en font la molécule explosive la plus utilisée au monde, notamment, c’est le produit de base de la plupart des chargements militaires, que ce soit pur ou en mélange, car sa température de fusion peu élevée permet de le couler facilement dans les munitions.
Le 2,4,6-Trinitrophenol
Le 2,4,6-Trinitrophenol (acide picrique, acide carbo-azotique ou encore mélinite) a été découvert en 1771 par Peter Woulfe lorsqu’il fit réagir de l’acide nitrique sur l’indigo. En 1873, Sprengel fait détonner le 2,4,6-trinitrophénol (2,4,6-TNP) qui entre ainsi dans la famille des explosifs alors qu’il était considéré jusque là comme inoffensif. Cet explosif a été très utilisé pendant la 1ère guerre mondiale surtout pour remplir des obus, le remplissage étant facilité par un large écart entre sa température de fusion et sa température de décomposition, assurant la sécurité des opérateurs. Cet explosif peut être fabriqué à partir du chlorobenzène ou du phénol.
Les nitrobenzènes
Le 1,3,5-trinitrobenzène (1,3,5-TNB) est un explosif plus puissant que le 2,4,6-TNT grâce à un bilan d’oxygène plus élevé. Cependant, il coûte plus cher à produire puisqu’il est le plus souvent fabriqué à partir de ce dernier. En effet, pour obtenir le 1,3,5-TNB, le 2,4,6-TNT est oxydé par l’acide chromique en l’acide 2,4,6-benzoïque qui est ensuite décarboxylé. D’autres méthodes de synthèse sont également possibles mais il ne peut être obtenu directement à partir du benzène. Son coût plus élevé que celui du 2,4,6-TNT en fait un explosif moins employé.
Le 1,3-Dinitrobenzène (1,3-DNB) est fabriqué quant à lui par nitration du benzène en présence d’un mélange d’acide fort. Cette réaction aboutit également à l’obtention de deux produits secondaires, le 1,4-dinitrobenzène (1,4-DNB) et le 1,2-dinitrobnzène (1,2-DNB). Moins oxygéné que le 1,3,5-TNB, il est donc moins puissant que celui-ci et est moins employé également.
Le tétryl
Le tétryl (Ty), ou 2,4,6,N-tétranitrométhylaniline, a été synthétisé pour la première fois en 1877 par Mertens et a été utilisé comme explosif à partir de 1906. Ce composé est en réalité à la fois un nitroaromatique et une nitramine puisqu’il possède à la fois des liaisons C-NO2 et N-NO2. Le tétryl est fabriqué par oxydation d’un méthyle et trinitration du noyau benzénique de la diméthylaniline en présence d’acide nitrique et d’acide sulfurique concentré.
Ce composé s’hydrolyse lentement et n’est pas stable en milieu alcalin. De plus, sa faible stabilité thermique (décomposition à partir de 100°C) en fait un explosif plus sensible que les précédents. C’est pour cela qu’il a surtout été utilisé en association avec d’autres explosifs ou en tant que détonateur [1]. Il est moins employé à l’heure actuelle mais ce fut l’un des explosifs les plus utilisés au début du 20ème siècle après le 2,4,6-TNT, c’est pourquoi il est souvent recherché dans les eaux et les sols.
Les nitramines
Les nitramines les plus fréquemment rencontrées et donc principalement recherchées dans les échantillons post-attentats sont le RDX et le HMX.
Le RDX (cyclotriméthylènetriamine ou cyclonite ou, plus couramment, héxogène) a été découvert pour un usage médical par Friedrich Henning en 1899 et son pouvoir explosif n’a été reconnu qu’en 1920 par Herz qui l’a synthétisé par nitration directe de l’héxamine. Compte tenu du coût élevé de cet explosif, il est principalement utilisé dans des charges militaires.
Quant au HMX (High Melting point eXplosive, également appelé cyclotétraméthylènetétramine ou octogène), il a été isolé accidentellement comme sous-produit de réaction lors de la synthèse du RDX en 1940 par W. E. Bachmann. Il a fallut trois ans pour élucider sa structure et mettre au point sa synthèse en adaptant la synthèse du RDX. Le HMX est maintenant synthétisé par action de l’acide nitrique concentré sur l’hexamine en présence de nitrate d’ammonium et d’acide acétique concentré.
Ce dernier explosif fait partie de la liste des explosifs non nucléaires les plus puissants répertoriés en 2008. Il est cependant très peu utilisé dans le civil car il est très cher et reste donc un explosif militaire pour des missiles ou des bombes performantes.
Analyses chromatographiques des composés ciblés
L’analyse d’échantillons contenant des explosifs organiques a été largement étudiée, mais essentiellement sur des échantillons environnementaux provenant de cours d’eau, d’eaux souterraines ou de sols. En effet, peu de travaux ont été réalisés sur des échantillons post attentats. De plus, l’analyse des explosifs organiques, dont les nitroaromatiques, les nitramines et les esters nitrés, a été réalisée à l’aide de différentes techniques séparatives telles que la chromatographie en phase gazeuse (GC) [8-22], la chromatographie en phase supercritique [23-24] ou l’électrophorèse capillaire (EC) [25-29]. Cependant, la technique la plus utilisée pour ces composés reste la chromatographie en phase liquide (LC). En effet, la LC présente l’avantage de permettre l’analyse de l’ensemble des composés ciblés ce qui est difficile en GC en raison de la faible volatilité des nitramines et de la décomposition thermique des esters nitrés. C’est donc cette méthode qui a retenu notre attention.
Chromatographie liquide haute performance
Les explosifs nitroaromatiques, les nitramines et les esters nitrés sont des composés moyennement polaires, ils peuvent donc être analysés et séparés par chromatographie de partage normal ou inverse suivant la nature de l’échantillon à analyser. Cependant, la majorité des séparations s’effectuent en mode inverse ce qui permet de limiter l’utilisation de solvants chlorés et d’associer aisément une détection par spectrométrie de masse [30]. Le Tableau I. 2 récapitule les conditions d’analyses reportées dans la littérature, accompagnées de la liste des explosifs sur lesquels porte la séparation. L’ensemble des travaux présente des analyses chromatographiques de nitroaromatiques auxquels s’ajoutent souvent les nitramines et parfois les esters nitrés. Cependant, peu d’études ciblent l’ensemble des composés appartenant à ces trois familles simultanément, puisque ce sont des composés de polarité proches qui sont donc difficiles à séparer. Dans la plupart des cas, l’analyse est réalisée à l’aide d’une colonne en silice greffée C18 [31-43], mais des alternatives ont également été envisagées, devant la difficulté d’obtenir une bonne séparation. En effet, l’ajout d’une précolonne greffée cyanopropyle (CN) en amont de la colonne C18 [44-45] ou l’utilisation d’autres colonnes de chromatographie en phase inverse comme des colonnes C8 [46-48], phényle [49], cyanopropyle [50], amide [51] et de carbone graphite poreux (PGC ou Hypercarb) [52-56] a en effet également été testée.
Modes de détection
La détection des explosifs organiques peut se faire suivant différents modes couplés à la chromatographie liquide. Les détections possibles, et déjà étudiées par le passé, sont l’UV, la spectrométrie de masse (MS) ou la détection électrochimique. Le détecteur UV est le plus couramment utilisé car il est simple d’utilisation, le plus stable et le moins cher. Ce détecteur est d’ailleurs privilégié lors d’analyses de routine des nitroaromatiques et des nitramines [45]. En effet, il permet même d’obtenir dans certains cas, de plus faibles limites de détection (LDD) lors de l’analyse des nitroaromatiques par comparaison avec la spectrométrie de masse après une séparation dans des conditions identiques [54]. Cependant, pour l’analyse des esters nitrés qui possèdent des coefficients d’extinction molaire (ε) faibles, ce détecteur conduira à de faibles sensibilités.
Les explosifs nitroaromatiques possèdent des groupements NO2 qui peuvent être réduits en hydroxylamine puis en amine. Hilmi et al. ont exploité cette propriété pour mettre au point leur analyse des nitroaromatiques et des nitramines par chromatographie liquide couplée à une détection ampérométrique [43]. Marple et al. ont quant à eux employé une détection électrochimique photoassistée (PAED) [35, 38]. Cela consiste à faire circuler la phase mobile dans un photoréacteur avant son passage dans la cellule électrochimique dans le but d’irradier les analytes qui se décomposent pour former desions nitrite qui peuvent être oxydés en ions nitrate. La comparaison avec les résultats en UV montrent que le détecteur électrochimique apporte pour la plupart des composés ciblés (nitroaromatiques et nitramines), un gain en sensibilité.
Enfin, le détecteur émergent ces dernières années est le spectromètre de masse qui permet d’obtenir des chromatogrammes en fonction du rapport masse sur charge des composés. Ainsi, il n’est plus indispensable de séparer tous les analytes, puisque la détection est spécifique, exceptée lorsque les composés conduisent à des ions de même rapport masse sur charge comme c’est souvent le cas des isomères de position. De nombreuses études ont été réalisées pour la mise au point d’une méthode d’analyse la plus sensible possible. Plusieurs interfaces telles que le thermospray [47, 66], l’électrospray (ESI) [42, 49, 67], l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) [39, 53-56, 67] ou la photoionisation à pression atmosphérique (APPI) [40, 55] ont été étudiées.
Les groupements NO2 sont particulièrement électronégatifs c’est pourquoi l’ionisation des explosifs nitrés s’effectue le plus souvent en mode négatif. L’ESI est peu utilisée pour les nitroaromatiques contrairement à leurs métabolites car ils sont difficiles à détecter par cette interface. Seul le 2,4,6-TNT donne un ion [M-H]- abondant [2]. Cassada a toutefois observé la formation d’adduits entre certains nitroaromatiques et des ions méthanolate issus de la phase mobile constituée d’eau, de MeOH et d’acétate d’ammonium [67]. Ainsi, les nitroaromatiques sont analysés le plus souvent en mode APCI et ne nécessitent pas l’emploi d’additifs [2, 39]. En revanche, l’analyse d’autres explosifs nitrés nécessitera d’ajouter un additif tel que l’acétate d’ammonium [2] qui permet de les détecter sous la forme d’un ion moléculaire M.- abondant [39, 53, 56]. Les spectres de masse du 2,4,6-TNT et du 2,4-DNT sont également caractérisés par la présence d’ions fragments [M-OH]- et [M-H]-. D’ailleurs, ce dernier est parfois l’ion fragment majoritaire du 2,4-DNT [68] obtenu. Le spectre de masse du tétryl est plus complexe car il se décompose thermiquement en N-méthylpicramide (P) pour donner un ion [P-H]-.
En ce qui concerne la spectrométrie de masse en tandem (MS²) en mode APCI, les ions fils formés pour les nitroaromatiques sont le plus souvent des [M-OH]- et des [M-NO]-. Ainsi, le 2,4-DNT aura tendance à former le premier alors que les autres isomères formeront plutôt le second, c’est ainsi qu’il est possible de les distinguer en MS² [39].
Les différents travaux présentés précédemment montrent que la séparation des explosifs nitrés et plus particulièrement des isomères du DNT n’est pas si simple mais qu’il est possible de les séparer malgré tout dans certaines conditions souvent complexes. Ces composés sont le plus souvent détectés en UV après la séparation chromatographique bien que la spectrométrie de masse soit de plus en plus utilisée ces dernières années. Cependant, malgré les performances de l’analyse, le traitement des échantillons reste une étape indispensable au préalable pour permettre d’éliminer un maximum d’interférents pouvant rendre difficile l’identification des explosifs par des co-élution ou des phénomènes de suppression ou d’exaltation du signal en LC/MS.
Procédures de traitement de l’échantillon appliquées aux explosifs
L’analyse des explosifs a été largement étudiée ces dernières années pour permettre de développer des procédures capables de mettre en évidence la présence d’un explosif, d’une famille ou de plusieurs familles d’explosifs dans l’eau ou dans les sols pour la plupart des études. En effet, depuis les deux guerres mondiales, de nombreux cours d’eau et terrains sont contaminés et présentent des teneurs importantes en composés explosifs. Il a donc été nécessaire de mettre au point des méthodes d’analyses permettant de les identifier et de les quantifier dans ces matrices. Ces méthodes sont, pour la plupart, composées d’une étape de purification et/ou de préconcentration de l’échantillon avant de réaliser les analyses chromatographiques proprement dites.
Ces dernières années, de nombreuses études ont été réalisées afin de mettre au point des procédures de purification et de préconcentration des explosifs présents dans des échantillons divers. Ces travaux témoignent de l’utilisation de différentes techniques d’extraction qui seront brièvement décrites ci-après.
L’extraction liquide-liquide
L’extraction liquide-liquide (ELL) est basée sur la distribution d’un soluté entre deux phases liquides en fonction de son affinité pour chacune d’elles [69]. Cette technique est très simple de mise en oeuvre avec la possibilité d’utiliser un grand choix de solvants d’extraction avec des propriétés de sélectivité et de solubilités différentes. Cependant, ce type d’extraction est relativement long et nécessite de grands volumes de solvants organiques, souvent toxiques, lorsqu’il est appliqué à des échantillons environnementaux pour obtenir des facteurs d’enrichissement élevés. Ce dernier est défini par le rendement d’extraction multiplié par le rapport entre le volume percolé et le volume de l’échantillon. A cela, s’ajoute un grand risque de contamination et de pertes lors des étapes de transfert qui peuvent être nombreuses en fonction du nombre de répétitions de l’extraction. Cette méthode est également difficilement automatisable et peut conduire à une mauvaise reproductibilité à cause du risque de formation d’émulsion à l’interface des deux liquides.
L’ELL est la méthode d’extraction proposée par la méthode EPA 8330 pour les explosifs nitroaromatiques et les nitramines en faible concentration présents dans les eaux résiduaires. Leggett a comparé la procédure d’ELL pour les nitroaromatiques et les nitramines avec différents solvants d’extraction : le dichlorométhane (DCM) avec ou sans ajout de sel dans l’échantillon et l’ACN avec ajout de sels pour limiter la solubilité de celui-ci avec l’eau [70]. Finalement, ce dernier solvant extracteur a donné les meilleurs rendements et a été également appliqué à une gamme plus large de nitroaromatiques ainsi qu’aux esters nitrés (NG et PETN). Les rendements obtenus sont supérieurs à 90 % pour l’ensemble des composés avec une seule étape d’extraction. La méthode EPA qui reprend l’utilisation d’ACN et de sels mentionne l’emploi d’un grand volume d’échantillon (770 mL d’eau) et d’un grand volume d’ACN (environ 200 mL). Quatre étapes d’extraction successives sont réalisées avec des temps d’agitation et de décantation de 15 et 10 mn respectivement pour chaque extraction. Cette procédure demande donc environ deux heures pour récupérer un faible volume d’ACN (environ 5 à 6 mL) qui est ensuite dilué par deux dans l’eau avant d’être injecté. Cette méthode longue et fastidieuse permet d’obtenir des rendements également supérieurs à 90 % et des limites de quantification comprises entre 0,020 et 0,84 μg/L pour les composés en commun avec notre étude excepté pour le HMX et le Ty dont les limites de quantification (LDQ) ne sont pas mentionnées. Dans la seconde version, la méthode EPA 8330B, la même procédure de ELL est toujours la technique décrite. Cependant, l’extraction sur phase solide est également mentionnée comme étant une possibilité qui se révèle souvent préférée lors des analyses.
Compte tenu des grands volumes d’échantillons et de solvants organiques nécessaires, de nombreux travaux ont récemment porté sur l’extraction des explosifs par ELL en format miniaturisé.
Extraction liquide-liquide en format miniaturisé
Microextraction par simple goutte
La microextraction par simple goutte (Single Drop MicroExtraction, SDME) a été développée en 1996 par Jeannot et al. [71]. Ce système d’extraction liquide-liquide miniaturisé est fondé sur l’équilibre de partage des analytes entre l’échantillon aqueux et une goutte de solvant organique non-miscible à l’eau se trouvant à l’extrémité de l’aiguille d’une seringue d’injection de chromatographie gazeuse. Le transfert de masse a lieu par diffusion. Le principal avantage de cette technique est qu’une fois l’extraction faite, la goutte de solvant organique dans laquelle est contenue les analytes extraits est directement injectée en GC comme l’illustre la Figure I. 9.
Comme pour toute ELL, le solvant et le volume de la goutte doivent être convenablement choisis, et le temps d’extraction est généralement réduit en agitant l’échantillon. En revanche, l’agitation ne peut pas être trop vigoureuse compte tenu de la fragilité de la goutte. Néanmoins, cette technique est simple, nécessite peu d’équipement et une faible quantité de solvant.
Microextraction liquide-liquide par dispersion
La microextraction liquide-liquide par dispersion (DLLME) a été mise au point par Rezaee et son équipe en 2006 [74]. Cette technique est une microextraction triphasique qui consiste à introduire dans l’échantillon liquide aqueux, un petit volume de solvant de dispersion dans lequel est dilué quelques microlitres (jusqu’à 100 μL) de solvant extracteur. La Figure I. 10 présente les différentes étapes de l’extraction. Après agitation et centrifugation, les fines gouttelettes du solvant d’extraction se retrouve alors au fond du tube et prélevées avec une seringue [74-75]. L’extrait peut être analysé directement en GC ou évaporé pour reprendre les analytes dans un solvant approprié pour une injection en LC.
Lors de l’extraction de composés contenus dans un échantillon aqueux, le solvant de dispersion est généralement du MeOH, de l’ACN, du tétrahydrofurane (THF) ou de l’acétone. Le solvant d’extraction doit quant à lui être non miscible à l’eau et de forte densité afin de le récupérer après la centrifugation. Ainsi le sulfure de carbone (CS2), le tétrachlorométhane (CCl4), le perchloroéthylène (C2Cl4), le chloroforme (CHCl3) ou le dichloroméhtane sont généralement choisis. La DLLME présente plusieurs avantages dont la simplicité de la procédure, sa rapidité ainsi que de grands rendements d’extraction et de grands facteurs d’enrichissement.
Microextraction en phase liquide assistée par fibre creuse
La microextraction en phase liquide assistée d’une fibre creuse poreuse (Hollow Fibre based on Liquid Phase MicroExtraction, HF-LPME) est fondée sur le partage des analytes entre un milieu donneur (échantillon) et un milieu accepteur situé dans une fibre en polypropylène. Le schéma de la fibre est illustré en Figure I. 12.
L’extraction peut être réalisée en mode biphasique avec un solvant organique contenu à la fois dans les pores et au centre de la fibre ou en mode triphasique, en remplissant le centre de la fibre d’une solution aqueuse et les pores d’un solvant organique. Suivant la nature de la phase acceptrice (aqueuse ou organique), l’extrait peut être directement analysé par GC [84], LC [85-87] ou par électrophorèse capillaire [88].
L’avantage de cette technique, outre son format miniaturisé, est la présence de la fibre permettant une meilleure purification de l’échantillon par rapport à une ELL classique notamment vis-à-vis des macromolécules. Comme pour toutes les techniques de partage, la limitation de la HF-LPME réside dans l’extraction de composés polaires à partir de matrices aqueuses comme c’est le cas pour les composés de cette étude. Ainsi, la HF-LPME n’a été employée pour les explosifs nitroaromatiques que dans une seule étude référencée à ce jour. C’est à nouveau l’équipe de Psillakis qui a étudié l’extraction de 11 explosifs nitroaromatiques comme lors de sa précédente étude en SDME. Après optimisation des différents paramètres d’extraction (solvant d’extraction, agitation, concentration en sel, temps d’extraction), les explosifs ont pu être extraits en mode biphasique pendant 20 min à partir de 5 mL d’échantillon dopé d’eau pure, d’eau du robinet et de surface, avec l’assistance de la fibre remplie de toluène. Cette procédure a permis d’obtenir des LDD en milieu pur pour les composés ciblés également dans notre étude allant de 0,38 μg/L pour le 2,6-DNT à 0,87 μg/L pour le tétryl. Les estimations des concentrations d’explosifs dans les échantillons dopés montrent que ce système permet de quantifier les explosifs et qu’il n’y a pas d’effet de matrices d’après l’auteur. Cependant, les facteurs d’enrichissement et les rendements d’extraction ne sont pas présentés et ne permettent donc pas d’évaluer l’efficacité de cette méthode, notamment pour des échantillons réels.
Formats des supports SPE et couplages aux techniques chromatographiques
Formats pour l’analyse en différé
Une extraction est dite en différé lorsque l’étape de SPE est totalement dissociée de l’étape d’analyse. Cela signifie que les différentes fractions issues de la procédure d’extraction (percolation, lavage et élution) sont collectées puis analysées.
Le principal avantage de l’approche en différé est sa grande flexibilité. De nombreux paramètres peuvent être modifiés et optimisés : la quantité d’adsorbant, la nature et le volume de la solution d’élution ou le format du dispositif d’extraction. De plus, l’équipement requis est très simple ce qui en fait une méthode peu coûteuse. Il est également possible d’automatiser la procédure d’extraction grâce à l’utilisation d’un robot.
Pour ce faire, plusieurs formats de phase SPE, représentés Figure I. 14, sont actuellement commercialisés : cartouches, plaque 96-puits, disques, seringue, cône de pipette.
L’extraction en différé est réalisée dans la plupart des cas à l’aide d’une cartouche d’extraction en polypropylène. L’adsorbant, dont la granulométrie est généralement comprise entre 40 et 60 μm, est confiné entre deux frittés. Cette granulométrie est choisie pour permettre l’écoulement de l’échantillon et des différents solvants sans que la perte de charge ne soit trop importante. Il existe des cartouches contenant de 20 mg à 1 g d’adsorbant. L’amélioration de la sensibilité des systèmes analytiques a permis de réduire nettement le volume d’échantillon nécessaire et par conséquent de diminuer la quantité d’adsorbant employée. Ainsi, les cartouches de 1 mL, contenant moins de 100 mg d’adsorbant, sont donc de plus en plus répandues [93].
Extraction sur phase solide des explosifs protéines analytes barrière physique (groupement diols) sites d’interaction des petites molécules (C18)
L’extraction sur phase solide d’explosifs organiques a suscité un grand intérêt ces trente dernières années et les recherches ont suivi l’évolution des phases SPE disponibles. Ainsi, le nombre d’études portant sur le développement d’une méthode SPE est important devant le nombre de publications sur le développement de systèmes d’extraction liquide-liquide précédemment présentés. Les procédures mises au point dans ces différentes études portent sur l’extraction des explosifs présents dans des extraits organiques ou aqueux. En effet, la majorité des études est encore une fois liée à l’environnement et destinée à la purification et la préconcentration d’échantillons pour vérifier la présence d’explosifs polluant les eaux. Il y a néanmoins quelques études qui portent sur des échantillons post-attentat. Le Tableau I. 3 présente les conditions d’extraction développées dans les différentes études réalisées à ce sujet.
Procédure du LCPP concernant les composés organiques
Le Laboratoire Central de la Préfecture de Police de Paris est composé d’une équipe chargée d’analyser les preuves relevées sur les lieux d’une explosion. L’objectif est de pouvoir reconstituer la composition des bombes utilisées pour proférer des attaques terroristes ce qui permet d’aider les services de police dans leur enquête pour retrouver les auteurs des faits.
L’analyse des preuves récupérées après un attentat s’effectue en suivant les nombreuses étapes d’un protocole permettant de retrouver une partie de la composition initiale de l’explosif. Le mode opératoire suivi a été développé lors de la thèse de R. Tachon [1] et est présenté Figure I. 20.
Immunoextraction des explosifs
Les propriétés des anticorps ont été exploitées dans la conception de plusieurs bioessais destinés aux explosifs [144-152]. Smith et son équipe ont publié une revue en 2008 présentant le grand nombre de publications portant sur les bioessais et les immunocapteurs destinés aux explosifs [153]. Cependant, les études publiées ne présentent que des anticorps anti-TNT [144, 151-152], anti-DNT [144] et anti-RDX [144]. De plus, ils ont pour la plupart été mis au point dans le but de pouvoir analyser des eaux souterraines ou des extraits de sols in situ et être plus rapides et plus sensibles que la méthode EPA 8330. Ces méthodes bio-analytiques présentent l’avantage d’être simples à utiliser et plus mobiles que les méthodes chromatographiques conventionnelles. Cependant, des phénomènes d’effets de matrices, perturbant la réponse du bioessai et conduisant à des résultats erronés, ont cependant été observés [112].
Finalement, une seule immunoextraction a été décrite en 2001 pour l’extraction du 2,4,6-TNT par immobilisation d’anticorps anti 2,4,6-TNT par voie sol-gel [154]. Pour cela, une solution de tampon phosphate salin (PBS) dopée avec du 2,4,6-TNT peut alors être percolée suivi d’un lavage avec du PBS et d’une élution à l’éthanol absolu. La quantification du 2,4,6-TNT est ensuite réalisée avec un test ELISA pour lequel la fraction d’élution est diluée pour ne pas dépasser 10 % de solvant organique. La procédure d’extraction présente des rendements d’environ 100 %. L’étude des interactions non spécifiques a également été réalisée en parallèle de l’étude de la capacité des supports. Dans ce but, deux supports de contrôle ont été réalisés, le premier avec des anticorps non spécifiques du 2,4,6-TNT greffés sur la matrice sol-gel, et le second sans aucun greffage. En revanche, aucune application en milieu réel n’a été réalisée et la réactivité croisée n’a pas été évaluée. A ce titre, plusieurs anticorps anti-TNT sont actuellement disponibles et ont été comparés lors de leur utilisation en tests ELISA [146]. Ces derniers ont des réactivités croisées variables mais l’un d’entre eux présente une forte affinité vis-à-vis du 1,3,5-TNB qui peut donc également être détecté.
L’immunoextraction des explosifs n’a pas suscité d’intérêt depuis cette étude. Cela peut s’expliquer par le coût élevé de production des anticorps mais peut être également parce que jusqu’à présent la majorité des développements a porté sur l’extraction de plusieurs explosifs simultanément dans des matrices environnementales pour lesquelles la méthode EPA 8330 semble être satisfaisante. De plus, ces dernières années des alternatives à l’utilisation des anticorps pour développer des supports d’extraction sélectifs ont émergé comme les polymères à empreintes moléculaires et les oligoadsorbants.
Les oligoadsorbants
Présentation des aptamères
Les oligoadsorbants sont basés sur l’utilisation d’aptamères immobilisés sur un support solide. Les aptamères sont des oligonucléotides artificiels de longueur généralement comprise entre 20 et 60 nucléotides capables de se lier spécifiquement à un ligand avec une affinité qui peut atteindre celle des anticorps pour leur antigène. Ces acides nucléiques sont sélectionnés parmi une banque très complexe d’acides nucléiques par un procédé itératif appelé SELEX c’est-à-dire « Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment ». Les aptamères peuvent être conçus pour différentes cibles comme les ions métalliques divalents [155], les petites molécules organiques [156], les protéines [157] et les cellules [158].
A l’heure actuelle, les aptamères peuvent avoir plusieurs applications. En effet, ils peuvent être utilisés sur des capteurs, dans des bioessais, sur des supports chromatographiques et dernièrement sur des supports d’extraction destinés à la SPE [159]. D’ailleurs, quelques études ont été menées très récemment dans notre laboratoire pour développer des supports destinés à la SPE à base d’aptamères sélectifs vis-à-vis de la cocaïne [160-161] et de l’ochratoxine A [162]. Les aptamères constituent une sérieuse alternative aux IS. En effet, une fois la séquence identifiée par le SELEX, l’aptamère est synthétisé chimiquement. C’est donc un mode de synthèse peu coûteux et entraînant peu de variation lot à lot. De plus, il est possible d’introduire des modifications lors de leur synthèse pour améliorer leur stabilité, leur spécificité, leur immobilisation ou la détection du dispositif final lors de leur utilisation en bioessais. La taille plus réduite des aptamères, qui représente environ un dixième de celle des anticorps [163], doit aussi permettre un greffage plus dense sur le support d’immobilisation.
La principale limitation actuelle des aptamères est le nombre encore limité de cibles pour lesquelles les aptamères ont été sélectionnés. Cependant, cette technologie est très jeune et en plein essor, la multiplication des applications et les récentes avancées du procédé SELEX démontrent leur grand potentiel.
Reconnaissance des explosifs par les aptamères
A l’heure actuelle, seules deux études ont été publiées sur l’utilisation d’un aptamère capable de retenir sélectivement le 2,4,6-TNT [164-165]. Ces aptamères ont été immobilisés pour réaliser des capteurs du 2,4,6-TNT avec une détection par fluorescence pour des extraits de sols [164] et par microbalance à quartz (QCM) pour des échantillons aqueux [165]. Cette dernière présente également une séquence capable de retenir sélectivement le DNT, mais sans préciser quel est l’isomère ciblé. La rétention du 2,4,6-TNT et du DNT a été comparée dans cette étude avec la rétention sur le support d’immobilisation sans greffage d’aptamère et la sélectivité du support a ainsi été démontrée.
Il est donc maintenant envisageable de concevoir des supports de SPE avec des aptamères immobilisés ciblant le 2,4,6-TNT ou le DNT puisque la séquence a été publiée très récemment [165] et cela à moindre coût. Cependant, les aptamères sont en général très spécifiques de la cible utilisée et il est fort probable qu’ils ne présentent pas de réactivité croisée vis-à-vis des autres explosifs organiques ciblés dans notre étude. Ainsi, devant la nécessité de faire fabriquer les aptamères pour nos différentes cibles et la grande réactivité croisée souhaitée dans notre étude, l’utilisation de support aussi sélectif que les aptamères a semblé difficile. C’est pourquoi, une autre approche de reconnaissance moléculaire a été envisagé en tant que support de SPE pouvant être synthétisé rapidement et à moindre coût. Il s’agit des supports à empreintes moléculaires.
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Table des matières
Chapitre I Etude bibliographique de l’analyse des résidus d’explosifs
I. 1. Contexte de l’étude
I. 2. Structures et propriétés des explosifs étudiés
I. 2. 1. Présentation générale
I. 2. 2. Les nitroaromatiques
I. 2. 2. 1. Le 2,4,6-Trinitrotoluène et ses intermédiaires de formations
I. 2. 2. 2. Le 2,4,6-Trinitrophenol
I. 2. 2. 3. Les nitrobenzènes
I. 2. 2. 4. Le tétryl
I. 2. 3. Les nitramines
I. 2. 4. Les esters nitrés
I. 2. 5. Propriétés physicochimiques des explosifs ciblés
I. 3. Analyses chromatographiques des composés ciblés
I. 3. 1. Chromatographie liquide haute performance
I. 3. 1. Modes de détection
I. 4. Procédures de traitement de l’échantillon appliquées aux explosif
I. 4. 1. L’extraction liquide-liquide
I. 4. 2. Extraction liquide-liquide en format miniaturisé
I. 4. 2. 1. Microextraction par simple goutte
I. 4. 2. 2. Microextraction liquide-liquide par dispersion
I. 4. 2. 3. Extraction au point trouble
I. 4. 2. 4. Microextraction en phase liquide assistée par fibre creuse
I. 4. 2. 5. Conclusion
I. 4. 3. L’extraction sur phase solide
I. 4. 3. 1. Principe [89]
I. 4. 3. 2. Formats des supports SPE et couplages aux techniques chromatographiques
I. 4. 3. 3. Extraction sur phase solide des explosifs
I. 4. 4. La microextraction sur phase solide
I. 4. 4. 1. Principe
I. 4. 4. 2. Applications
I. 5. Procédure du LCPP concernant les composés organiques
I. 6. Conclusions
Chapitre II Supports à empreintes moléculaires pour le traitement de composés à l’état de traces dans des échantillons complexes
II. 1. Introduction
II. 2. Les immunoadsorbants
II. 2. 1. Principe
II. 2. 2. Immunoextraction des explosifs
II. 3. Les oligoadsorbants
II. 3. 1. Présentation des aptamères
II. 3. 2. Reconnaissance des explosifs par les aptamères
II. 4. Les supports à empreintes moléculaires
II. 4. 1. Principe de l’impression moléculaire
II. 4. 2. Synthèse de polymères à empreintes moléculaires par voie radicalaire
II. 4. 2. 1. Introduction
II. 4. 2. 2. Principe de la polymérisation radicalaire
II. 4. 2. 3. Application aux MIP
II. 4. 3. Synthèse de support à empreintes moléculaires par voie sol-gel
II. 4. 3. 1. Introduction
II. 4. 3. 2. Principe du procédé sol-gel
II. 4. 3. 3. Propriétés
II. 4. 3. 4. Application aux MIS
II. 4. 4. Caractérisation des supports imprimés comme supports d’extraction
II. 4. 4. 1. Caractérisation par chromatographie d’élution
II. 4. 4. 2. Caractérisation par étude de fixation
II. 4. 4. 3. Caractérisation par profil d’élution ou SPE
II. 4. 5. Applications des supports imprimés aux explosifs nitroaromatiques86
II. 5. Conclusion
Chapitre III Synthèse et caractérisation de MIP pour l’extraction sélective des explosifs nitroaromatiques
III. 1. Introduction
III. 2. Mise au point des conditions d’analyse des molécules ciblées
III. 2. 1. Introduction
III. 2. 2. Détection UV
III. 2. 3. Mise au point des analyses par LC/UV
III. 2. 3. 1. Séparation des nitroaromatiques sur la colonne PGC
III. 2. 3. 2. Séparation des nitroaromatiques sur une colonne diphényle
III. 2. 3. 3. Séparation des nitroaromatiques sur une colonne en silice greffée C18 99
III. 2. 4. Analyse par LC/MS
III. 2. 5. Conclusion
III. 3. Développement de supports à empreintes moléculaires
III. 3. 1. Choix de la molécule empreinte
III. 3. 2. Présentation des différents MIP synthétisés et principe d’évaluation
III. 3. 3. Evaluation des MIP fondés sur une rétention par interactions polaires
III. 3. 3. 1. Caractérisation des MIP 1, 2 et 3
III. 3. 3. 2. Caractérisation des MIP 4 et 5
III. 3. 3. 3. Conclusion
III. 3. 4. Evaluation des MIP fondés sur une rétention hydrophobe et des interactions de type π-π
III. 3. 4. 1. Caractérisation du MIP1
III. 3. 4. 2. Caractérisation du MIP 6
III. 3. 4. 3. Caractérisation du MIP 7
III. 3. 5. Conclusion
Chapitre IV Synthèse et caractérisation de MIS pour l’extraction sélective des explosifs nitroaromatiques
IV. 1. Introduction
IV. 2. Evaluation du potentiel d’un MIS pour l’extraction sélective des explosifs nitroaromatiques
IV. 2. 1. Préparation du support de silice imprimé
IV. 2. 1. 1. Choix des réactifs et conditions de synthèse
IV. 2. 1. 2. Elimination de la molécule empreinte
IV. 2. 2. Pré-évaluation de la sélectivité du MIS
IV. 2. 2. 1. Mise en évidence de la sélectivité du MIS vis-à-vis du 2,4-DNT122
IV. 2. 2. 2. Extraction du 2,4,6-TNT
IV. 2. 3. Optimisation du protocole d’extraction
IV. 2. 3. 1. Procédure d’extraction simultanée du 2,4-DNT et du 2,4,6-TNT 124
IV. 2. 4. Etude de la rétention des autres explosifs nitroaromatiques
IV. 2. 5. Détermination de la capacité du support
IV. 2. 6. Etude de la répétabilité de la synthèse
IV. 2. 7. Evaluation du MIS sur un échantillon réel
IV. 2. 8. Conclusion
IV. 3. Modification des conditions de synthèse du MIS
IV. 3. 1. Introduction
IV. 3. 2. Utilisation d’un analogue structural comme molécule empreinte
IV. 3. 3. Utilisation d’un monomère polaire
IV. 3. 4. Influence du ratio molaire sur les performances du support
IV. 3. 4. 1. Conditions de synthèse
IV. 3. 4. 2. Potentiel des MIS 1/4/20 et 1/4/30
IV. 3. 5. Conclusion
IV. 4. Caractérisation des MIS 1/4/20 et 1/4/30
IV. 4. 1. Développement d’une procédure d’extraction optimale
IV. 4. 2. Etude de la rétention des autres nitroaromatiques
IV. 4. 3. Détermination de la capacité des supports
IV. 4. 4. Etude de la répétabilité de la synthèse
IV. 4. 5. Extraction en milieu réel
IV. 4. 5. 1. Etudes préliminaires
IV. 4. 5. 2. Choix des échantillons
IV. 4. 5. 3. Purification sélective d’un extrait contenant de l’huile de moteur
IV. 4. 5. 4. Purification sélective d’un extrait contenant du sang humain post-mortem
IV. 4. 5. 5. Purification sélective d’un extrait issu de l’explosion d’une porte de gymnase
IV. 4. 6. Conclusion
IV. 5. Potentiel des supports imprimés pour l’extraction sélective des nitramines et des esters nitrés
IV. 5. 1. Extraction des nitramines
IV. 5. 1. 1. Extraction des nitramines par le MIS 1/4/30
IV. 5. 1. 2. Evaluation d’un support spécifique aux nitramines
IV. 5. 2. Extraction des esters nitrés
IV. 6. Conclusion
Chapitre V Miniaturisation des différents outils analytiques et identification rapide des explosifs nitrés
V. 1. Introduction
V. 2. Extraction en ligne des nitroaromatiques
V. 2. 1. Objectifs
V. 2. 2. Dispositif expérimental
V. 2. 3. Développement de la procédure en ligne en milieu pur
V. 2. 3. 1. Etude préliminaire
V. 2. 3. 2. Evaluation du couplage en ligne
V. 2. 3. 3. Performances de la méthode
V. 2. 4. Extraction en ligne des nitroaromatiques en milieu complexe
V. 2. 5. Conclusion
V. 3. Développement d’une méthode d’identification rapide des explosifs nitrés par une détection électrochimique
V. 3. 1. Principe du test diagnostic de terrain envisagé
V. 3. 2. Détection électrochimique des explosifs nitrés
V. 3. 2. 1. Principe
V. 3. 2. 2. Formats de détection
V. 3. 2. 3. Applications
V. 3. 3. Mise au point sur électrode imprimé de la détection électrochimique du 2,4,6-TNT
V. 3. 3. 1. Choix des paramètres principaux
V. 3. 3. 2. Mesures préliminaires
V. 3. 3. 3. Evaluation de la répétabilité des mesures
V. 3. 3. 4. Optimisation de certains paramètres
V. 3. 3. 5. Quantification du 2,4,6-TNT par détection électrochimique
V. 3. 3. 6. Conclusions
V. 4. Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
Références bibliographiques
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