Soutenance mémoire
Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit porte sur « la microscopie de fluorescence résolue en temps et en polarisation pour le suivi d’interactions protéiques en neurobiologie ». Ce doctorat a été effectué en co-tutelle entre l’Institut des Sciences Moléculaires d’Orsay (ISMO) et le Laboratoire Charles Fabry de l’Institut d’Optique (LCFIO). Toutes les expériences présentées ont été réalisées au Centre de Photonique Biomédicale (CPBM) du Centre Laser de l’Université Paris Sud (CLUPS). Le CLUPS est une plateforme d’applications dans le domaine des sciences physicochimiques ainsi que des sciences de la vie et de la santé. Dans le cadre de notre étude, nous avons établi des collaborations avec le Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière (CRICM) à Paris, avec l’Institut Curie à Orsay, avec l’Institut Langevin à Paris ainsi qu’avec le King’s College à Londres.
Au cours des quinze dernières années, la microscopie a évolué pour pouvoir répondre aux questions complexes posées par la biologie, telles que la localisation de molécules dans une cellule ou dans un tissu, le suivi de leur proximité avec les molécules voisines ou de leurs interactions avec leur environnement à des échelles allant du nanomètre à la dizaine de micromètres. Le choix de la modalité d’imagerie doit pouvoir mettre en évidence ces phénomènes pour faire le lien avec les fonctions biologiques sous-jacentes. Le développement de sondes ainsi que les progrès réalisés sur les sources lasers et les composants optiques, ont contribué à un véritable renouveau de la microscopie de fluorescence et à l’essor de nouvelles modalités de microscopie appliquées à la biologie.
Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre des protéines membranaires impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Pour suivre cette interaction, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence sous excitation en réflexion totale interne résolue en temps (TIRFLIM) et en polarisation. Une première version du montage TIRFLIM avait été développée au cours de la thèse de Pierre Blandin. Elle a permis de valider le dispositif avec des échantillons biologiques modèles. Dès mon arrivée en stage de Master 2, nous avons identifié ensemble les points critiques à modifier afin que l’on dispose d’un dispositif qui offre une bonne reproductibilité, nécessaire pour des applications en biologie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser les contrastes de durée de vie de fluorescence ainsi que la polarisation de la fluorescence pour pouvoir répondre à des questions biologiques relatives à la dimérisation de protéines.
La fluorescence est un des processus de luminescence par lequel une molécule passe d’un état électronique excité à un état d’énergie plus basse, en émettant de la lumière. La fluorescence peut ainsi être définie comme la propriété de certains corps à absorber la lumière à une certaine longueur d’onde pour l’émettre ensuite à une longueur d’onde plus grande (loi empirique de Stokes), ceci après un intervalle de temps moyen qui va correspondre à la durée de vie de fluorescence.
Le processus de fluorescence se compose de trois étapes avec des temps caractéristiques très distincts : l’excitation, les relaxations vibrationnelles et l’émission de fluorescence. L’excitation d’une molécule fluorescente s’effectue par absorption de photons. La durée caractéristique associée à ce processus est de l’ordre de la femtoseconde (10⁻¹⁵ s) alors que les durées associées aux relaxations vibrationnelles sont de l’ordre de la picoseconde (10⁻¹² s). Le processus final d’émission de fluorescence s’opère sur des temps plus longs de l’ordre de la nanoseconde (10⁻⁹ s).
Une molécule possède différents états excités (S0, S1, S2 ) et chaque état est divisé en un certain nombre de niveaux d’énergie vibrationnels associés au noyau atomique ainsi qu’aux orbitales de liaison. Le diagramme de Perrin-Jablonski représente les différents niveaux d’énergie impliqués dans l’absorption et l’émission de lumière par un fluorophore. On peut ainsi caractériser un fluorophore par ses spectres d’absorption et d’émission de fluorescence .
Après l’absorption d’un photon, plusieurs processus peuvent intervenir mais le plus probable est la relaxation vers le niveau vibrationnel le plus bas du premier état électronique excité. Il s’agit des processus de relaxation vibrationnelle ou conversion interne, par lesquels l’énergie est perdue sans émission de lumière et est transférée sous forme de chaleur aux autres molécules environnantes. Le passage du plus bas niveau vibrationnel de l’état excité au niveau fondamental S0 peut s’accompagner d’émission de lumière, il s’agit dans ce cas-là de la fluorescence, dont la longueur d’onde d’émission est plus grande que la longueur d’onde d’absorption.
D’autres processus peuvent entrer en compétition avec l’émission de fluorescence. La molécule à l’état excité peut ainsi retourner au niveau fondamental de façon non radiative par transfert de chaleur. Des interactions avec d’autres molécules peuvent induire des transferts non radiatifs d’énergie (FRET), phénomènes que nous détaillerons par la suite. L’énergie peut également être transmise au plus bas état triplet excité, lors de croisements intersystèmes. De manière générale, à température ambiante, la désexcitation de l’état triplet à l’état fondamental se fait de manière non radiative. En revanche, à de faibles températures, cette désexcitation devient radiative et correspondra à de la phosphorescence. L’émission de phosphorescence a lieu à une longueur d’onde plus haute que l’émission de fluorescence (étant donné que l’énergie du niveau vibrationnel le plus bas de l’état triplet est plus faible que celle de l’état S1) et les durées de vie associées sont beaucoup plus longues (supérieures à la milliseconde).
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Table des matières
INTRODUCTION
Chapitre I : Contexte de l’étude et état de l’art
1 Principe de la fluorescence
1.1 Mécanisme de la fluorescence
1.2 Grandeurs caractéristiques de la fluorescence
1.2.1 Durée de vie de fluorescence
1.2.2 Rendement quantique de fluorescence
1.3 Les marqueurs fluorescents
1.3.1 Marqueurs organiques
1.3.2 Quantums dots
1.3.3 Protéines fluorescentes
2 Choix de la configuration optique pour l’étude de phénomènes à l’interface substrat/échantillon
2.1 Microscopie sous illumination structurée
2.2 Microscopie 4Pi
2.3 Microscopie STED
2.4 Microscopie à onde évanescente
2.5 Techniques de superlocalisation
2.6 Microscopie supercritique
3 Microscopie de fluorescence résolue en temps
3.1 Domaine temporel
3.1.1 Méthode de comptage de photon unique corrélé dans le temps (TCSPC)
3.1.2 Mesures de durée de vie de fluorescence avec un intensificateur à déclenchement périodique
3.2 Domaine fréquentiel
3.3 Analyses des mesures
3.3.1 Détermination de la durée de vie de fluorescence par ajustement mono ou multi-exponentiel
3.3.2 Détermination de la durée de vie de fluorescence sans ajustement
4 Suivi d’interactions moléculaires par imagerie de FRET
4.1 FRET : Principe et conditions
4.2 Mises en œuvre pour la détection
4.2.1 Imagerie de FRET en intensité de fluorescence (méthode ratiométrique)
4.2.2 Imagerie de FRET par photoblanchiment de l’accepteur
4.2.3 Mesure du FRET par mesure de durée de vie de fluorescence
5 Autres techniques pour suivre des interactions moléculaires
5.1 BRET : Bioluminescence Resonance Energy Transfer
5.2 BiFC : Bimolecular Fluorescence Complementation
5.3 La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
5.4 La spectroscopie en corrélation croisée de fluorescence (FCCS)
5.5 Anisotropie de fluorescence
5.6 Analyse de la brillance
Chapitre II : Microscope TIRFLIM
1 Principe de la microscopie TIRF
1.1 Principe physique de la réflexion totale interne
1.2 Application en microscopie de fluorescence
1.3 Configurations utilisées
1.3.1 Configuration TIRF avec prisme
1.3.2 Configuration « à travers l’objectif »
2 Présentation du microscope TIRFLIM
2.1 Mesure FLIM en plein champ
2.2 Schéma du montage
2.3 Interface pour le pilotage, l’acquisition et le traitement
2.4 Mesures de durée de vie de fluorescence sous excitation TIRF et en épifluorescence : effet de l’interface
3 Calibrations et optimisation du dispositif TIRFLIM
3.1 Calibration de la voie de détection résolue en temps
3.2 Calibrations : mesure de la résolution spatiale en illumination en épifluorescence et en TIRF
3.2.1 Résolution latérale
3.2.2 Résolution axiale
3.3 Recherche de la profondeur de pénétration du champ évanescent
3.3.1 Evaluation de la profondeur de pénétration de l’onde évanescente sous excitation TIRF
3.3.2 Utilisation de surfaces plasmoniques
3.3.2.1 Conditions d’existence et relation de dispersion
3.3.2.2 Exaltation de la fluorescence et diminution de la durée de vie de fluorescence à la proximité d’une surface métallique
3.3.2.3 Dispositif SPETIRF
3.3.2.4 Evaluation de la profondeur de pénétration de l’onde évanescente sous excitation SPETIRF
3.4 Imagerie cellulaire en SPETIRF sur cellules vivantes et fixées
CONCLUSION
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