Soutenance mémoire
Microsatellites en génétique des cétacés
LE DAUPHIN BLEU-ET-BLANC
Le dauphin bleu-et-blanc (Stenella cœruleoalba) est un animal mesurant autour de deux mètres de long à l’âge adulte, pour un poids pouvant excéder 100 kg. Il peut généralement être identifié du fait d’un motif clair « en écharpe » remontant vers la dorsale, et d’une ligne noire partant de l’œil et lui valant son nom vernaculaire dans plusieurs pays.La position taxonomique du dauphin bleu-et-blanc (d’après Berta et al., 2006) est la suivante : Classe : Mammalia, Sous-classe : Eutheria, Ordre : Cetacea, Sous-ordre : Odontoceti, Famille : Delphinidæ, Genre : Stenella, Espèce : S. cœruleoalba. Le dauphin bleu-et-blanc est donc un cétacé (Cetacea, Brisson 1762) appartenant au groupe des cétartiodactyles . Le tableau 1 présente plus précisément la place du dauphin bleu-et-blanc au sein de l’ordre des cétacés.
En Méditerranée, la maturité sexuelle est atteinte chez les femelles vers 12 ans d’âge (187 cm de longueur) (Calzada et al., 1996) et chez les mâles vers 11,3 ans (190 cm). Ces valeurs sont supérieures aux valeurs observées dans la population japonaise (Kasuya, 1972 ;1985), et également aux valeurs observées pour d’autres espèces du genre Stenella (Perrin et Reilly, 1984). En Méditerranée nord-occidentale, les mises bas ont lieu de la fin de l’été à l’automne (Aguilar, 2000), ce qui correspond à la période de l’année où les eaux sont les plus chaudes et précède un pic de productivité (Estrada et al., 1985). Les nouveaux-nés sont en principe rencontrés dans les plus grands troupeaux, généralement ceux de plus de 30 individus (Forcada et al., 1994) ; un phénomène analogue est observé dans les eaux du Japon (Miyazaki et Nishiwaki, 1978). On suppose que le pic d’accouplements se produit en août (Aguilar, 2000), la durée de la gestation étant ainsi estimée à quelque 12 mois ou un peu plus.Conservation du dauphin bleu-et-blanc Quelques populations de dauphin bleu-et-blanc sont plus ou moins gravement menacées, notamment dans le Pacifique nord-ouest et en Méditerranée. Pacifique Nord-ouest (Cetacean specialist group, 1996). Les captures de dauphins bleu-et-blanc au Japon se sont réduites de façon spectaculaire depuis les années 1950,principalement suite à une chasse excessive (et à un changement des méthodes halieutiques, car les captures accidentelles étaient nombreuses). Les estimations d’abondance dans les eaux japonaises, dans les années 1980, ont donné des valeurs supérieures au demi-million d’individus. Cependant plusieurs populations continuent d’être pêchées, et les dauphins bleuet-blanc ont été complètement ou presque éliminés de certaines zones autrefois fréquentées. La forte demande de viande de dauphin sur les marchés japonais rend l’accomplissement des mesures de conservation problématique. Méditerranée. Les menaces sont différentes dans ce bassin. Une épizootie de morbillivirose a probablement provoqué la mort de milliers d’individus (Aguilar et Raga, 1993), en Méditerranée centrale et occidentale, de 1990 à 1992. La population de Méditerranée occidentale, en 1991, a été estimée à 117 880 individus (intervalle de confiance à 95 % : 68 379 à 214 800 individus ; Forcada et al., 1994). La pollution et la réduction de la disponibilité des proies pourraient avoir aggravé les effets de l’épizootie, et persistent aujourd’hui. Des dauphins bleu-et-blanc sont capturés volontairement ou accidentellement dans de nombreuses autres parties du Monde, mais les stocks ne semblent pas beaucoup s’y réduire (rappelons cependant que l’estimation de l’abondance des cétacés est un travail délicat). Le dauphin bleu-et-blanc est considéré depuis 1996 comme présentant un faible risque d’extinction (« lower risk ») mais dépendant de mesures de conservation (« conservation dependant ») (Union Internationale pour la Conservation de la Nature, IUCN, www.redlist.org). L’étude de la biologie des populations de Stenella cœruleoalba est une étape préliminaire à la conception de politiques de conservation pertinentes et efficaces. En particulier, l’analyse de la structure génétique des populations apportera des indications concernant leur niveau de diversité génétique, leur stratégie de reproduction, ou encore leur histoire démographique récente ou plus ancienne.Thèmes de notre étude Ce projet a consisté en l’étude de la variabilité génétique intraspécifique chez le dauphin bleu-et-blanc, dans les eaux de Méditerranée occidentale et de la zone atlantique proche. La première partie de ce travail a d’abord consisté en une recherche bibliographique des marqueurs polymorphes de type « microsatellite » trouvés et testés chez les différentes espèces de cétacés. Puis l’amplification de cinq de ces marqueurs (trois di- et deux tétranucléotides), développés chez diverses espèce plus ou moins éloignées phylogénétiquement du dauphin bleu-et-blanc, a été mise au point chez ce dernier. Ces cinq marqueurs ont finalement été séquencés afin de vérifier la présence des répétitions et d’identifier les différences de séquence nucléotidique existant entre les espèces. La seconde partie de ce projet a été consacrée à l’étude de la variabilité de ces cinq marqueurs parmi diverses populations de dauphins bleu-et-blanc d’Europe sud occidentale, dans le cadre de l’étude de leur structuration génétique.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Structuration interne de la population méditerranéenne |
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Table des matières
Introduction générale
Le dauphin bleu-et-blanc
Conservation du dauphin bleu-et-blanc
Thème de notre étude
Première partie. Microsatellites en génétique des cétacés: recherche et amplification de marqueurs polymorphes
Introduction
Intérêt des microsatellites
Identification des microsatellites par PCR
Obtention de microsatellites utilisables et polymorphes
Objectifs de cette première partie
Matériel et Méthodes
I. Constitution du tableau de données d’amplification
II. Manipulations de laboratoire
A. Echantillons
1) Espèces étudiées
2) Nature des échantillons ; leur obtention
3) Conservation des échantillons
B. Extraction d’ADN
1) Les réactifs et leur conservation
2) Description des principales étapes
3) Constitution d’aliquots directement utilisables pour la PCR
C. Choix des microsatellites
1) Polymorphisme
2) Type de motif répété
3) Amplification préalable chez Stenella cœruleoalba
4) Bilan des six microsatellites choisis
D. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
1) Amorces et « multiplex »
2) Thermocycleur et programmation
3) Mode opératoire
4) Exemple de feuille de manipulation
E. Electrophorèse en gel d’acrylamide
1) Principe de l’électrophorèse
2) Détermination des génotypes
F. Clonage et réaction de séquence
1) Principales étapes du clonage
2) Séquençage
3) Alignement de séquences
Résultats
I. Banque de données d’amplifications
A. Bilan des amplifications
B. Nature des motifs répétés
C. Essais d’amplification de GATA053 chez quelques espèces
II. Proposition de multiplex chez Stenella cœruleoalba
A. Succès des amplifications
B. Constitution de multiplex
C. Probabilités d’identité
III. Séquence des marqueurs chez Stenella cœruleoalba
Discussion
I. Bilan des amplifications de microsatellites chez les cétacés
A. Rappel : les microsatellites sont des marqueurs très utilisés en génétique des populations
B. Conservation des séquences flanquantes au sein de l’Ordre des cétacés
C. Utilité du tableau récapitulatif
1) En génétique des populations
2) Pour l’identification d’espèces
II. Utilité des multiplex
A. En génétique des populations
B. Différenciation entre les individus : probabilités d’identité
1) PID sib
2) PID et PID unbiased
C. Association de cinq marqueurs en un multiplex
III. Séquence de GATA053 et évolution des cétacés
A. Séquence « propre à Stenella » : hypothèses phylogénétiques
B. Apports du bilan d’amplifications et perspectives d’études futures
Seconde partie. Structure génétique des populations de Ste n ella cœrule o alb a en Méditerranée occidentale et zone atlantique proche
Introduction
Objectifs de cette étude
Résultats d’études antérieures
Matériel et Méthodes
I. Les échantillons utilisés
A. Description de l’échantillonnage
B. Obtention des échantillons
II. Expérimentations : extraction d’ADN, PCR et électrophorèse
III. Analyse des données
A. Vérifications
1) Exactitude des données
2) Déséquilibre de liaison
B. Fréquences alléliques par population
C. Paramètres de diversité génétique
D. Paramètres de structuration génétique
1) Structure génétique d’une population
2) Différenciation génétique entre populations
E. Significativité des valeurs : tests sur permutations
Résultats
I. Vérifications
A. Cohérence des données
B. Déséquilibre de liaison
II. Fréquences alléliques
III. Diversité génétique
A. Nombre d’allèles par locus
B. Hétérozygotie attendue
IV. Différenciation génétique
A. Structuration au sein de chaque bassin
B. Allèles nuls : calculs sur quatre locus
C. Différenciation entre les bassins
1) Distance de Nei (1978)
2) FST de Wright (1969)
Discussion
I. Vérifications
A. Cohérence des données et erreurs de lecture
B. Déséquilibre de liaison
II. La population méditerranéenne serait a priori plus fragile
A. Une population moins variable
1) Une variabilité nucléaire réduite
2) Une variabilité mitochondriale également réduite
3) Bilan des comparaisons de variabilité
B. Une population plus réduite ?
C. Variabilité et viabilité à long terme
III. Différenciation génétique entre les populations des trois bassins
A. Dans son ensemble, la population méditerranéenne est génétiquement différenciée de celle des autres bassins
1) Divergences nucléaires
2) Divergences mitochondriales
3) Des femelles philopatriques ?
4) Des résultats concordants avec les études morphologiques et épidémiologiques
B. Quels sont les liens entre les populations atlantique et pacifique ?
IV. Structuration interne de la population méditerranéenne
A. L’échantillon méditerranéen présente un excès d’homozygotes
1) Un possible effet Wahlund
2) Une structuration géographique ?
3) Une autre interprétation du défaut d’hétérozygotes
B. Deux lignées mitochondriales en Méditerranée
1) Mise en évidence
2) Variabilité génétique au sein de ces deux lignées
3) Interprétation de l’excès d’homozygotes observé avec les marqueurs nucléaires
C. Origine de la structuration génétique au sein de la population méditerranéenne
V. Préserver la population méditerranéenne
Conclusions générales
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