Microfluidique en gouttes pour la biologie cellulaire

La cellule

Rappels sur la cellule 

On peut distinguer deux classes de cellules. La plus simple du point de vue structural est la cellule procaryote. Les procaryotes sont des cellules sans noyau possédant une paroi cellulaire et un ADN circulaire unique, elles sont dites cellules haploïdes (les chromosomes sont présents en un seul exemplaire) et sont caractéristiques du règne bactérien. La deuxième classe correspond aux cellules eucaryotes, elle comprend la grande majorité des espèces vivantes (animaux, plantes …). La cellule eucaryote est une cellule de structure et d’organisation complexes comportant de nombreux organites. Elle contient un noyau délimité par une enveloppe et qui renferme deux jeux de chromosomes dépositaires du matériel génétique (cellule dite diploïde). Dans la suite de ce travail, nous nous intéresserons uniquement à ce type cellulaire. Le terme gène désigne une unité d’information génétique, codée sous forme d’une séquence de nucléotides sur un brin d’ADN. Les gènes codent pour les protéines, leur expression détermine donc la vie cellulaire. Le dogme central définit le paradigme de la biologie moléculaire ; les gènes sont conservés sous forme d’acides nucléiques mais ils exercent leur fonction sous forme de protéines. Trois types de réactions sont responsables de la transmission de l’information génétique et de sa transformation d’un gène à l’autre :
• L’information est conservée grâce à la réplication ; un acide nucléique double brin est dupliqué en deux copies identiques. L’information est exprimée selon un mode semi-réplicatif.
• La transcription produit un ARN dont la séquence est identique à celle des brins du duplex d’ADN. Une cellule eucaryote contient typiquement 20 pg d’ARN, dont moins de 5 % correspond à l’ARN messager (ARNm), au rôle central de vecteur de l’information génétique.
• La traduction convertit la séquence nucléotidique de l’ARN en une chaîne d’acides aminés qui constituent une protéine. Un ARNm est traduit en une séquence protéique ; les ARN de transfert (ARNt) et ARN ribosomiaux (ARNr) sont d’autres constituants de la machine protéique. Chaque ARNm contient au moins une région codante qui correspond à une séquence protéique .

De la nécessité d’étudier la cellule à l’échelle individuelle

Les cellules d’un même type présentent, à l’échelle individuelle, une variété de comportements liée à une différence d’expression de gènes. Cette variation d’expression est due en partie à la nature discrète des évènements moléculaires et cellulaires comme l’initiation de la transcription où le nombre fini de protéines est traduit par transcrit [Paulsson 2004]. Elle implique de nombreuses conséquences sur les mécanismes de différenciation cellulaire et peut entraîner des hétérogénéités phénotypiques dans une population de cellules pourtant maintenues dans un environnement homogène. L’étude de l’ensemble d’une population ne permet que d’obtenir des grandeurs moyennées et laisse ouverte des questions fondamentales concernant les gènes exprimés dans la cellule unique, les communications intercellulaires et la réponse des cellules à différents stimuli [Levsky 2003]. La principale raison de ce manque d’information est due à la grande difficulté d’étudier la cellule unique avec des techniques conventionnelles : perte de matériel génétique au cours des différentes opérations d’analyse, contamination et volume non adapté rendent l’expérience de cellule unique fastidieuse. Or, savoir quand et où un gène est exprimé apporte des informations cruciales sur le rôle potentiel des gènes ; cette connaissance a été à l’origine de la découverte des gènes [Brady 2000].

Approches expérimentales conventionnelles de l’étude d’une cellule unique

Les variations observables d’une cellule à l’autre, loin d’être des artéfacts, peuvent donc être mesurées, soit au niveau de l’ARN, soit au niveau de la protéine. Les techniques d’analyse au niveau de la protéine sont souvent plus informatives que les études sur l’ARN mais elles nécessitent une grande quantité de matériel vivant car les protéines ne peuvent pas être amplifiées. L’analyse des taux d’ARNm suffit à quantifier l’expression d’un gène ; la réaction de polymérisation en chaîne quantitative, précédée d’une transcription inverse (RT-PCRq), est la méthode la plus reproductible et quantitative pour identifier et quantifier des acides nucléiques .

La biologie moléculaire de la cellule unique est une branche scientifique de la biologie relativement nouvelle. La première analyse de la cellule unique concerne la caractérisation de l’ADN mitochondrial en 1988 [Li 1988]. Les techniques employées pour étudier l’expression génique de la cellule unique impliquent une première étape d’isolation de la cellule avant analyse par la RT-PCR. Les méthodes conventionnelles utilisées pour isoler et trier les cellules sont basées sur les méthodes de micro-manipulation, telles que des aspirations du cytosol par patch clamp [?] (consistant à mettre en continuité électrique une micropipette en verre remplie d’une solution ionique de composition définie avec la membrane d’une cellule vivante isolée) ou des aspirations de cellules individuelles dans une micropipette (les risques de contamination et de perte de matériel génétique sont importants), des microdissections par captures laser (rapides et efficaces mais délicates) et des cytométries de flux (pour le tri de cellules). Ces étapes sont ensuite généralement suivies d’une RT-PCR quantitative, méthode robuste et fiable. La potentialité de ces études offre de nouvelles perspectives dans l’étude des tissus hétérogènes [Hinkle 2003], notamment en neurologie pour la compréhension de mécanismes impliqués dans les maladies neurologiques [Hinkle 2003], mais aussi dans la détection et l’étude de pathogènes microbiaux [Makino 2003] ou dans l’étude des tumeurs [Klein 2002]. De nombreux protocoles d’analyse de la cellule unique ont été élaborés [Liss 2002], [Hartshorn 2005]. Récemment Taniguchi et al. ont réussi à quantifier l’expression de quatre gènes d’une cellule unique par immobilisation de l’ADNc sur billes magnétiques et PCR successives sur le même échantillon [Taniguchi 2009]. Les ADNc ainsi fixés sont ensuite amplifiés par PCR successives ; les températures de cycles de PCR ont été optimisées de façon à ne pas complètement dénaturer l’ADNc à chaque amplification, le rendant disponible pour l’étude d’un autre gène (cf. figure 1.2). Les protocoles sur cellule unique impliquent une multitude d’étapes complexes et délicates, la principale difficulté résidant dans l’inadéquation entre les volumes manipulés avec les techniques conventionnelles (de 10 à 100 µL) et le volume d’une cellule (≈ 10⁻⁶ µL). Pour pallier à cette difficulté, la microfluidique, parce qu’elle manipule des petits volumes de fluide, est un outil adapté pour l’étude de l’expression génique au niveau de la cellule.

La microfluidique, un outil adapté à l’étude de la cellule

La microfluidique ou l’art de manipuler des petits volumes de liquide

La microfluidique étudie le transport de fluides dans des canaux de dimensions transverses allant de quelques micromètres à quelques centaines de micromètres, et de longueur caractéristique le millimètre ou le centimètre. A cette échelle, les nombres de Reynolds sont inférieurs à 1, les effets inertiels (à l’origine de la turbulence) sont donc généralement négligeables. Les premiers dispositifs microfluidiques ont vu le jour dans les années 80 avec quelques réalisations isolées, inspirées de l’utilisation de nouvelles techniques de microfabrication développées pour les composants électroniques afin de réaliser des systèmes miniatures au sein desquels circulaient des fluides. La microfluidique a réellement connu un essor dans les années 90 avec pour objectif des analyses en chimie ou biochimie, plus efficaces que les méthodes « macroscopiques » habituelles. Le développement d’une technologie beaucoup plus légère que les techniques de gravures du silicium a révolutionné la thématique ; ainsi, l’apparition des systèmes en PolyDiMethylSiloxane (PDMS) fabriqués par lithographie douce, a permis la réalisation de circuits en des temps très courts avec des coûts de fabrication très faibles. La microfluidique offre de nouvelles opportunités pour l’analyse des cellules. Grâce à des contrôles et des manipulations de petits volumes de fluides précis, elle ouvre des voies à l’analyse des constituants cellulaires.

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Table des matières

Introduction
1 Microfluidique en gouttes pour la biologie cellulaire
1.1 La cellule
1.1.1 Rappels sur la cellule
1.1.2 De la nécessité d’étudier la cellule à l’échelle individuelle
1.1.3 Approches expérimentales conventionnelles de l’étude d’une cellule unique
1.2 La microfluidique, un outil adapté à l’étude de la cellule
1.2.1 La microfluidique ou l’art de manipuler des petits volumes de liquide
1.2.2 Analyse de l’expression des gènes d’une cellule en microfluidique
1.3 La microfluidique discrète dans des gouttes
1.3.1 Génération de gouttes dans des microsystèmes
1.3.2 Manipulation de gouttes
1.3.3 Stabilisation des gouttes pour une observation à long terme
2 Analyse quantitative haut débit de l’expression de gènes sur la cellule
2.1 Stratégie expérimentale développée lors de cette thèse
2.1.1 Conception des microsystèmes : matériaux employés
2.1.2 Connectiques, stockage, génération et stabilisation des gouttes
2.1.3 Montage expérimental
2.2 Analyse quantitative de l’expression de gènes sur ARN et cellule en microfluidique
2.2.1 Analyse d’un échantillon d’ARN
2.2.2 RT-PCR quantitative sur cellule unique
3 Extraction liquide-liquide dans les microgouttes : fondements et applications
3.1 Article : Microfluidic droplet-based liquid liquid extraction
3.2 Extraction réactive du zinc suivi par fluorescence dans des gouttes
3.3 Premières étapes de purification de l’ARN dans des gouttes
3.3.1 Transfert de l’ADN à l’interphase
3.3.2 Précipitation des protéines
4 Génération contrôlée d’émulsions micrométriques pour la phagocytose
4.1 Introduction
4.2 Article : Monodisperse colloids generated with nanofluidic technology
4.3 Vers des émulsions submicrométriques
Conclusion
Annexes

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