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METHODES DE COLORATION EN CYTOLOGIE
Les différents protocoles de coloration
Différents protocoles de coloration ont été comparés lors d’une étude réalisée sur les cytologies cornéenne et conjonctivale : la coloration automatique « Hema Tek », la coloration au May-Grünwald/Giemsa, la coloration « Diff-Quik / Cam Quik » et la coloration au bleu de méthylène. (Bauer 1999)Seule la coloration au bleu de méthylène appartient au groupe de coloration de type « Papanicolaou. » Ce type de coloration donne une t rès bonne coloration du noyau et des détails cytoplasmiques. Par contre cette technique ne donne pas de bonne coloration du cytoplasme mais elle permet de suivre les changements au niveau du noyau puisqu’elle permet de visualiser parfaitement les détails nucléaires et nucléolaires.
Les autres méthodes de coloration font partie des colorations de type « Romanowsky. »
Ce sont des colorations bon marché, faciles à préparer, à conserver et à utiliser.
Ces colorations permettent d’identifier correctement les cellules inflammatoires, néoplasiques, les bactéries, les champignons et les inclusions cytoplasmiques. Il est facile de reconnaître et de différencier les coqueset les bâtonnets. (Curiel, Moore et al. 1992)
La coloration du noyau n’est pas aussi précise qu ‘avec les colorations de type « Papanicolaou » mais est suffisante pour distingue r certains processus anormaux. 2.2. Comparaison des différentes techniques
La coloration automatique « Hema Tek »
Elle donne des échantillons de bonne qualité malgré quelques dépôts de colorant regrettables. Néanmoins, cet appareil ne représente pas un investissement justifiable pour un cabinet vétérinaire, à moins que ce cabinet ne pratique beaucoup de travail de laboratoire.
La coloration de May-Grünwald/Giemsa
Elle donne des lames de très bonne qualité. Cette technique ne présente plus les mêmes problèmes de dépôt de colorant que la précédente. Elle est très facile d’emploi et donne de bons détails cytoplasmiques et une bonne image du noyau.
La coloration Diff-Quik/Cam-Quik
Cette méthode de coloration est très bien connue de tous les vétérinaires praticiens car c’est sûrement la plus utilisée dans les cabinets privés. Elle se présente sous forme de kit, facile à utiliser, peu onéreux et qui permet une lecture rapide des lames tout en donnant de bons détails cytoplasmiques et nucléaires. Cependant, la coloration de May-Grünwald Giemsa est de meilleure qualité et permet de conserver les lames.
L’avantage majeur de cette méthode est de pouvoir être utilisée durant la consultation.
La coloration au bleu de méthylène
C’est probablement la coloration la plus facile et la plus rapide à utiliser. La solution n’est pas chère mais elle doit être filtrée régulièrement pour enlever les précipités de coloration qui compromettraient sérieusement la qualité de la lame colorée. De plus, cette solution ne dure pas longtemps car elle s’évapore facilement.
Conclusion sur les différentes méthodes de coloration
Il apparaît que, pour l’utilisation du vétérinairepraticien, les kits de coloration rapide ainsi que le bleu de méthylène sont les plus faciles à utiliser, les plus rapides et les moins onéreux.
Cependant, pour notre étude, nous souhaitons conserver les échantillons réalisés ; nous avons donc besoin d’une coloration qui ne se détériore pas avec le temps. De plus, nous n’avons pas besoin de distinguer les détails du noyau mais plutôt de bien visualiser le cytoplasme (taille, couleur…) ainsi que d’éventuels micro-organismes présents sur notre frottis.
C’est pourquoi il nous a semblé justifié de colorer nos échantillons avec la coloration de May-Grünwald/Giemsa étant donné que c’était celle qui répondait le mieux à nos besoins.
Recommandations pour la coloration des lames
Certains problèmes de mauvaise qualité de coloration peuvent être évités en respectant certaines règles simples :
• il faut utiliser des solutions colorantes nouvellement préparées ou bien filtrées auparavant,
• il faut colorer les étalements cytologiques le plus tôt possible après les avoir fixés à l’air,
• et, il faut faire attention à ne pas toucher avec les doigts la surface de la lame ou bien la surface colorée à aucun moment.
Etude des sécrétions conjonctivales
A l’inverse du frottis conjonctival, les sécrétions contiennent principalement des cellules mortes qui proviennent de la desquamation de l’épithélium conjonctival ainsi que des cellules ayant migré par diapédèse.(Clerc 1997;Bleuer-Elsner 1992)
Méthode de prélèvemen t
L’animal ne doit avoir reçu aucun traitement. On ne doit avoir utilisé aucun collyre : ni colorant vital, ni anesthésique et on ne doit pas avoir réalisé de test de Schirmer.
On utilise pour le prélèvement une anse de platine identique à celle utilisée par les bactériologistes. Elle est simplement déposée dans l’angle interne de l’œil pour recueillir la sécrétion. L’anse est stérilisée après chaque utilisation par chauffage sur un bec Bunsen.
Traitement de l’échantillon
Le prélèvement est ensuite étalé sur une lame porte-objet propre et dégraissée, par un mouvement circulaire. La coloration est réalisée au May-Grünwald-Giemsa.
Renseignements apportés par cette méthode
Cette méthode permet d’observer des cellules épithéliales, des cellules à mucus ainsi que des cellules résultant de l’inflammation : polynucléaires neutrophiles, éosinophiles, histiocytes, macrophages, lymphocytes, ainsi que des bactéries.
Sécrétion conjonctivale non pathologique
On trouve des cellules desquamées en voie de lyse, des polynucléaires neutrophiles altérés et quelques histiocytes. On trouve en plus des bactéries qui proviennent de la flore saprophyte des conjonctives.
Intérêt de cette méthode
C’est une méthode simple, rapide et bon marché qui peut être réalisée au chevet du malade. D’après les auteurs, l’étude des sécrétionsconjonctivales serait plus spécifique que le frottis conjonctival pour le diagnostic des allergies oculaires.(Clerc 1997; Bleuer-Elsner 1992)
De plus, elle peut aussi orienter le vétérinaire vers une infection virale en présence de pus stérile et d’une réaction lymphohistiocytaire.
Ces arguments nous amènent à penser qu’il faudrait systématiquement procéder au recueil des sécrétions conjonctivales avant même de réaliser tout frottis de raclage. Néanmoins, il faut réaliser ce prélèvement avant tout acte thérapeutique ou à visée diagnostique pour ne pas modifier les résultats.
Méthodes de prélèvement des cellules conjonctivales
Pendant longtemps, on a considéré la spatule de Kimura comme étant l’instrument de choix pour la cytologie conjonctivale. En 1990, des auteurs ont commencé à s’intéresser à la cytobrosse utilisée d’ordinaire en gynécologie humaine pour les frottis cervicaux. Ils ont obtenu de bons résultats en cytologie oculaire avec cet instrument, qui a commencé à être utilisé en médecine vétérinaire en 1992. (Tsubota, Kajiwara et al. 1990; Anagnostopoulou-FotinopoulouR.Rammon-Kinia 1991; Bauer, Spiess et al. 1996)
D’autres instruments peuvent aussi être utilisés pour réaliser un frottis conjonctival. Il s’agit de coton-tige, de spatules et de lames de bistouri. (Bauer, Spiess et al. 1996 ; Willis 1997). Ces différents instruments ont fait l’objet d’études menées respectivement par ces deux auteurs.
BAUER et al ont étudié les avantages et les inconvénients des différents instruments à partir de prélèvements réalisés à l’aide de coton-ige,t de spatule de chimie arrondie de 3 mm, de micro-spatule de chimie de 3 mm et de cytobrosse afin de distinguer la meilleure méthode de collecte des cellules conjonctivales.
Avant chaque prélèvement, le cul-de-sac conjonctival est débarrassé de tout mucus ou saleté à l’aide d’un coton-tige puis les paupières sont maintenues en position ouverte jusqu’à ce que le prélèvement soit réalisé.
Dans cette étude, les auteurs se sont d’abord intéressés au coût et à la facilité de se procurer chacun des instruments, puis à leur éventuel effet traumatique et enfin à leur plus ou moins facile degré de manipulation.
Ensuite, ils se sont intéressés à la quantité de cellules prélevées avec chacune des méthodes, à leur distribution sur la lame et à leur intégrité.
Willis et al ont quant à eux comparé des frottis réalisés avec une spatule de Kimura et une cytobrosse. La cytobrosse utilisée était la « Microbrush : IDE Interstate, Amityville, NY » qui est une tige en plastique de 8 cm de long surmontée de poils non absorbant de 3-4 mm de long en nylon à son extrémité. La spatule de Kimura qui était utilisée est de la marque « Spatula Platinum Kimura : Storz Instument Company, St. Louis, MO ».
Dans cette étude, des prélèvements conjonctivaux ont été réalisés sur 20 chiens et 15 chats sans affection oculaire apparente ainsi que sur 15 chiens et 9 chats présentant des signes cliniques de conjonctivite.
Le prélèvement à l’aide de la cytobrosse a été réalisé sur la conjonctive palpébrale inférieure de l’œil droit alors que le frottis réalisé à l’aide de la spatule de Kimura a été effectué sur la conjonctive palpébrale inférieure de l’œil gauche.
Les auteurs se sont principalement intéressés à la facilité de la réalisation du prélèvement, au nombre de cellules collectées, à ladistribution des cellules ainsi qu’à leur intégrité.
Les différents instruments et leur utilisation
Le coton-tige
Les cotons-tiges ont l’avantage d’être peu coûteux et faciles à se procurer. De plus, ils sont simples d’emploi et sûrs à manipuler.
Un facteur important à prendre en compte est la qualité du coton-tige, c’est à dire la solidité avec laquelle le coton est attaché à la tige en plastique. En effet, plus cette attache est forte et plus le prélèvement sera de bonne qualité étant donné que l’on retrouvera peu de fibres de coton sur la lame.
D’après Bauer et al, l’utilisation de collyre anesthésique n’est pas nécessaire pour le prélèvement de cellules à partir de la conjonctive palpébrale. Le coton tige est roulé 3 ou 4 fois sur la surface à prélever en appuyant modérément, puis il est de même tamponné sur la lame en verre. Les cellules sont ensuite séchées à l’air libre en agitant la lame.
Il n’a pas été noté de différence pour les prélèvements effectués avec un coton-tige humidifié ou non.
Spatule arrondie de chimie de 3 mm
On peut se procurer cette spatule par l’intermédiaire des entreprises de fabrication de matériel de chimie. Elle n’est pas chère, elle est à la fois arrondie, plate et facile d’emploi. C’est un matériel d’une grande précision, puisque igide,r et qui est donc idéal à utiliser sur des animaux de petite taille. (Oiseaux, Nouveaux Animaux de Compagnie…) Elle s’avère être moins dangereuse à utiliser qu’une lame de sca lpel.
D’après Bauer et al, l’œil est anesthésié localement à l’aide d’un collyre et l’excès de mucus est débarrassé du sac conjonctival. Ensuite, la spatule est délicatement frottée perpendiculairement à la surface à prélever toujours dans la même direction quatre ou cinq fois selon que l’on souhaite ou non obtenir des cellules des couches profondes de l’épithélium, jusqu’à l’obtention d’un petit amas cellulaire à l’extrémité de la spatule. Les cellules sont transférées sur la surface de la lame porte-objet et étalées en un petit cercle de 1 cm ou bien en petites lignes et séchées à l’air.
Il faut particulièrement prendre soin de ne pas appuyer trop fort ou bien d’étaler trop rapidement le prélèvement pour ne pas abîmer les cellules.
Micro-spatule de chimie de 3 mm
L’extrémité de cette spatule est pointue et aiguisée comme une lame de couteau. Ceci représente un des inconvénients majeurs de cet instrument ; il faut envisager un risque non négligeable d’accident. L’utilisation de cet instrument est quasiment à bannir sur des animaux très nerveux comme les chevaux.
Cependant, l’avantage de cette extrémité pointue est que l’on peut réaliser des prélèvements bien précis dans de petites zones biendéfinies.
Cette spatule est utilisée pour prélever de fines tranches de tissu sur la conjonctive. Ensuite, les amas cellulaires sont déposés de la même façon que précédemment tout en prenant soin de ne pas écraser les cellules.
La spatule de Kimura
Figure 11 : Spatule de Kimura (T.Ramsey 1994)
C’est une spatule en platine qui a été spécialementconçue pour récolter des cellules conjonctivales. Traditionnellement, c’est cette spatule que l’on utilise pour récolter les cellules conjonctivales par frottis de raclage.
Son extrémité est arrondie et elle est assez facile d’utilisation. Elle doit être stérilisée à l’aide d’une flamme et rapidement refroidie avant utilisation.
Son inconvénient majeur est qu’elle n’est pas disponible rapidement et qu’elle coûte cher. (Bauer 1999)
Bien que l’hydrochlorure de propacaïne soit connucomme étant toxique pour les surfaces épithéliales, une coloration au rose Bengale n’a pas montré de cellules dégénératives suite à l’application d’une seule goutte de collyre anesthésique. Willis et al ont donc considéré que cette administration n’avait pas de conséquence sur l’intégrité des cellules récoltées au cours de l’étude.
Figure 12 : Prélèvement à la spatule de Kimura (T.Ramsey 1994)
La cytobrosse
Figure 13 : Cytobrosse
La cytobrosse se commande facilement, est peu onéreuse et elle est facile d’emploi. Bauer et al ont utilisé une cytobrosse identique à celle dont on se sert en gynécologie humaine pour réaliser des frottis cervicaux.
Elle est utilisée sans le danger que représente l’utilisation d’instruments rigides. Cette étude a prouvé que la cytobrosse était l’instrumentle plus facile et le plus sûr à utiliser : on peut s’attendre à des prélèvements de grande cellularité, de bonne distribution et de bonne intégrité cellulaire.
Willis et al ont décrit que même les chats présentent peu de réactions de défense lors de la réalisation du frottis, ce qui les amène à penser que l’utilisation de la cytobrosse provoque très peu d’irritation chez l’animal prélevé.
Dans la technique décrite par Willis et al, la cytobrosse était tournée à peu près cinq fois dans le même sens au contact de la conjonctive palpébrale inférieure. Ensuite, l’extrémité de la cytobrosse était roulée délicatement sur la lame, sans frotter pour ne pas créer de lésion cellulaire.
Bauer a procédé de la même manière mais il conseille de faire 3 à 4 tours complets de cytobrosse sur la conjonctive. De même, il insiste sur le fait que l’étape la plus délicate quant à la conservation de l’intégrité cellulaire est le transfert des cellules de la cytobrosse à la lame de verre.
Comparaison des différents instruments
Dans chacune des deux études, les lames réalisées avec les différents instruments, ont toutes été examinées au microscope à différentsgrossissements. Des objectifs de grossissement *4 et *10 ont été utilisés pour évaluer la distribution des cellules sur la lame et pour avoir une impression d’ensemble de la cellularité de la lame.
Ensuite, des objectifs de grossissement *20, *50 et *100 ont été utilisés pour l’examen des zones de forte concentration cellulaire afin de juger de l’intégrité cellulaire des lames et d’observer plus minutieusement les cellules une à une.
Quantité de cellules prélevées
La quantité de cellules prélevées au coton-tige surune conjonctive saine est faible. Ce nombre s’avère en revanche nettement supérieur lorsqu’il s’agit de conjonctives présentant une lésion.
Avec une spatule arrondie de chimie de 3 mm, la quantité de cellules prélevées est satisfaisante. Cette quantité est encore plus satisfaisante avec une micro-spatule de chimie de 3 mm ; on obtient un grand nombre de cellules.Pour estimer la cellularité, Willis et al ont compté les cellules sur 3 champs de microscope observés au grossissement *20 ; le nombre de cellules comptabilisé a été ensuite divisé par 3.La spatule de Kimura a procuré une quantité de cellules satisfaisante. Sur un champ de microscope observé au grossissement *20, on a en moyenne 30 cellules présentes aussi bien chez le chien que chez le chat.La quantité de cellules prélevées à la cytobrosse était satisfaisante. Néanmoins, le nombre de cellules était significativement plus petit que celui obtenu avec la spatule de Kimura : elle était en moyenne de 13 cellules conjonctivales indifféremment chez le chien et le chat sur un champ de microscope observé au grossissement *20.Par contre, pour les prélèvements réalisés sur deschiens et des chats présentant des signes cliniques de conjonctivite, le nombre de cellules recueillies a été sensiblement supérieur au nombre de cellules prélevées avec la spatule de Kimura : le nombre de cellules présentes sur la lame est passé à 32 cellules en moyenne chez le chien, et à 53 cellules en moyenne chez le chat.
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Table des matières
I. PREMIERE PARTIE : DONNEES SUR LA CYTOLOGIE CONJONCTIVALE
1. PRESENTATION GENERALE DE L’ORGANISATION ANATOMIQUE DE LA CONJONCTIVE
1.1. Anatomie macroscopique de la conjonctive
1.2. Anatomie microscopique de la conjonctive
1.2.1. Organisation générale
1.2.1.1. Histologie de la conjonctive
1.2.1.2. Les glandes de la conjonctive palpébrale
1.2.1.3. Les glandes de la membrane nictitante
1.2.1.4. Le film lacrymal précornéen
1.2.2. Description des cellules d’un frottis conjonctival après coloration
1.2.2.1. Les cellules de la conjonctive
1.2.2.2. Les autres cellules
1.2.3. Eléments non cellulaires pouvant être observés sur un frottis
1.2.3.1. Noyaux nus et débris kératinisés
1.2.3.2. Grains de mélanine
1.2.3.3. Flore normale de la conjonctive
2. METHODES DE COLORATION EN CYTOLOGIE
2.1. Les différents protocoles de coloration
2.2. Comparaison des différentes techniques
2.2.1. La coloration automatique « Hema Tek »
2.2.2. La coloration de May-Grünwald/Giemsa
2.2.3. La coloration Diff-Quik/Cam-Quik
2.2.4. La coloration au bleu de méthylène
2.3. Conclusion sur les différentes méthodes de coloration
2.4. Recommandations pour la coloration des lames
3. ETUDE DES SECRETIONS CONJONCTIVALES
3.1. Méthode de prélèvement
3.2. Traitement de l’échantillon
3.3. Renseignements apportés par cette méthode
3.4. Sécrétion conjonctivale non pathologique
3.5. Intérêt de cette méthode
4. METHODES DE PRELEVEMENT DES CELLULES CONJONCTIVALES
4.1. Les différents instruments et leur utilisation
4.1.1. Le coton-tige
4.1.2. Spatule arrondie de chimie de 3 mm
4.1.3. Micro-spatule de chimie de 3 mm
4.1.4. La spatule de Kimura
4.1.5. La cytobrosse
4.2. Comparaison des différents instruments
4.2.1. Quantité de cellules prélevées
4.2.2. Distribution des cellules
4.2.3. Intégrité des cellules
4.3. Bilan d’utilisation des différents instruments et conclusion sur les méthodes de prélèvement de la conjonctive
5. AUTRE METHODE DE PRELEVEMENT CONJONCTIVAL : LA TECHNIQUE D’EMPREINTE.
5.1. Principe
5.1.1. Matériel
5.1.2. Réalisation pratique
5.1.3. Traitement du filtre
5.1.3.1. Méthode de transfert
5.1.3.2. Méthode de transparisation
5.2. Intérêts et limites de cette méthode
6. CONCLUSION : INDICATIONS CLINIQUES DE LA CYTOLOGIE CONJONCTIVALE.
6.1. Les utilisations fréquentes du frottis conjonctival
6.2. Les autres utilisations du frottis conjonctival
6.2.1. Utilisation du frottis conjonctival en bactériologie
6.2.2. Utilisation du frottis conjonctival en mycologie
6.2.3. Utilisation du frottis conjonctival en virologie
6.2.4. Utilisation du frottis conjonctival en immunologie
6.2.5. Utilisation du frottis conjonctival en PCR (polymerase chain reaction)
II. DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE DE LA CYTOLOGIE CONJONCTIVALE D’UNE POPULATION DE CHEVAUX SAINS EN REGION TOULOUSAINE
1. MATERIELS ET METHODES
1.1. Animaux de l’étude
1.2. Méthode de prélèvement
1.2.1. Préparation de l’animal
1.2.2. Réalisation pratique du frottis
1.2.3. Etalement du frottis
1.2.4. Fixation du frottis
1.2.5. Identification de l’échantillon
1.3. Protocole de coloration suivi pour l’étude
1.4. Montage des lames
1.5. Lecture des lames
1.5.1. Appréciation de la qualité des lames
1.5.1.1. Qualité de la coloration
1.5.1.2. Qualité de l’étalement
1.5.2. Méthode de lecture
1.5.2.1. Evaluation qualitative des frottis
1.5.2.2. Approche quantitative des frottis
2. RESULTATS
2.1. Appréciation de la qualité des prélèvements cytologiques
2.1.1. Evaluation qualitative
2.1.2. Analyse quantitative
2.2. Descriptif quantitatif d’une cytologie conjonctivale
2.2.1. En nombre absolu
2.2.2. En pourcentage
2.3. Descriptif cytologique
3. DISCUSSION
3.1. Méthode de préparation d’un frottis conjonctival
3.2. Population cellulaire rencontrée lors d’un frottis conjonctival chez le cheval
4. CONCLUSION
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