Méthodes classiques pour l’étude de la structure tridimensionnelle des protéines

Méthodes classiques pour l’étude de la structure tridimensionnelle des protéines

Cristallographie des protéines

La cristallographie est la science qui étudie les systèmes cristallins à l’échelle atomique. Les macromolécules dont font partie les protéines sont généralement trop petites pour être observées directement par microscopie optique. En effet, leur taille n’est pas suffisante pour diffracter la lumière dans les longueurs d‟onde du domaine visible du spectre électromagnétique. En revanche, les distances interatomiques au sein des protéines (environ 1,5 Å) sont du même ordre de grandeur que la longueur d‟onde des rayons X. Par conséquent, la diffraction des rayons X par les atomes d‟une protéine peut, quant à elle, être envisagée. Dans un cristal régulier, les protéines forment un arrangement périodique, suivant des axes de l‟espace tridimensionnel, de mailles élémentaires définies comme étant le plus petit élément représentant le cristal entier. Des translations suivant les axes d‟une maille élémentaire permettent de reconstituer l‟ensemble du cristal.

Chaque atome d‟une protéine a donc exactement la même position dans toutes les mailles. Le cristal est ainsi composé de plans d‟atomes. Ces plans d‟atomes, ou plutôt les nuages d‟électrons correspondants, produisent un motif de diffraction lors de l‟irradiation du cristal aux rayons X (17). Le motif de diffraction contient les informations sur la position de tous les atomes de la maille. Par conséquent, il est possible, par l‟analyse de ce motif, de calculer les angles de diffraction ainsi que les distances interatomiques pour reconstituer la structure moléculaire.

La haute résolution reste le principal avantage de cette technique. Malgré des données relativement complexes à analyser, la diffraction des rayons X donne des informations très précises sur la structure moléculaire des protéines, souvent à une résolution atomique inférieure ou égale à 1,2 Å (18). A des résolutions encore plus élevées, i.e. inférieures ou égales à 0,8 Å, les atomes d‟hydrogène deviennent visibles et les atomes ne peuvent plus être considérés comme des sphères en raison de la déformation des nuages électroniques. Une telle visualisation des électrons permet de déterminer la distribution des charges et la polarisation des liaisons (19). Une image très détaillée de la structure de la protéine est alors obtenue.

Toutefois, la technique présente des limites. La principale difficulté liée à la méthode reste l‟obtention de cristaux avec des tailles suffisantes. Il est indispensable de disposer de plusieurs cristaux identiques car ils sont souvent dégradés en présence des rayons X (par chauffage ou par des radicaux libres). Pour faire pousser des cristaux, il est nécessaire de produire une protéine extrêmement pure. Il est également indispensable d‟exprimer des quantités importantes de protéine afin de trouver les conditions optimales de cristallisation. Ces dernières étant protéines dépendantes, il est impératif d‟en tester un grand nombre. Les cristaux peuvent se former rapidement ou au contraire apparaître après un temps considérablement long. Parfois même, il est malheureusement impossible d‟en obtenir. Les chaînes polypeptidiques partiellement repliées telles que le prion, sont un exemple probant de protéines difficilement cristallisables (20). De plus, si des cristaux sont finalement obtenus alors les segments peptidiques qui sont non structurés en solution apparaîtront soit ordonnés par des liaisons intermoléculaires au sein du système cristallin ou n‟apparaîtront pas. Par conséquent, il est important de développer une méthode alternative permettant d‟étudier la structure de protéines partiellement repliées ou même désordonnées.

Par définition, l‟étude cristallographique est basée sur des structures statiques (les cristaux) de l‟état le plus stable. Il est donc peu probable que cette technique renseigne sur la dynamique des molécules. Si la protéine cristallisée présente une dynamique sans mouvement à grande échelle, alors des événements dynamiques peuvent être caractérisés. En revanche, les mouvements à grande échelle sont quasiment toujours bloqués dans le cristal. D‟importants développements technologiques ont été apportés à la technique pour améliorer l‟observation de la dynamique à courte échelle. Il s‟agit de la cryo-cristallographie (21-23) ou des méthodes de cristallographie en temps résolu (24-26).

L‟avènement du synchrotron a considérablement accéléré la vitesse d‟acquisition des données. En effet, celle-ci a été réduite de quelques semaines à quelques heures grâce à la production d‟un rayonnement X intense, stable, de longueur d‟onde variable et de grande qualité optique. Actuellement, la plupart des données de cristallographie sont collectées à partir d‟un synchrotron. La diffraction des rayons X est également un outil de choix pour l‟étude de complexes protéiques permettant d‟obtenir des informations structurales de très grande qualité, même pour des systèmes très complexes (27) ou membranaires (28-29).

Spectroscopie RMN

La spectroscopie RMN est également devenue une méthode performante pour l‟étude de la conformation des protéines. Développée en 1945, elle n‟a cessé d‟être améliorée depuis sa mise au point. En raison de l‟impact scientifique exceptionnel qu‟elle a eu au fil des années, elle a été récompensée par quatre prix Nobel. Le dernier en date (2002) a été décerné au Professeur Kurt Wüthrich pour ses développements portés à la RMN qui ont permis l‟élucidation de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques en solution. Plus particulièrement, il a été primé pour son étude structurale de la protéine prion partiellement repliée (30).

Technique d‟analyse chimique et structurale non destructive, elle est basée sur l‟absorption de la radiation à une radio fréquence par des noyaux atomiques. Les niveaux d‟énergie de spin des noyaux sont séparés dans un champ magnétique (effet Zeeman). Sous l‟effet d‟une radio fréquence, chaque noyau de la molécule va résonner à sa fréquence spécifique (fréquence de Larmor). Chaque noyau de la protéine a donc sa propre fréquence de Larmor, qui dépend de l‟environnement local du noyau (par exemple protection par des champs magnétiques locaux). Un spectre RMN contient ainsi des pics correspondants aux résonances de tous les noyaux de l‟échantillon, chacun avec une fréquence (caractérisée par le déplacement chimique δ) caractéristique de son environnement chimique. De plus, la surface sous un pic est proportionnelle au nombre des noyaux résonnant à cette fréquence, ce qui permet de quantifier les résidus identifiés et caractérisés.

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Table des matières

Introduction générale
Chapitre I : Introduction
I.1. Analyse de complexes protéiques
I.1.1. Structure des protéines
I.1.1.1. Structure primaire
I.1.1.2. Structure secondaire
I.1.1.3. Structure tertiaire
I.1.1.4. Structure quaternaire
I.1.2. Méthodes d’analyse physico-chimique
I.1.2.1. Méthodes classiques pour l‟étude de la structure tridimensionnelle des protéines
I.1.2.1.1. Cristallographie des protéines
I.1.2.1.2. Spectroscopie RMN
I.1.2.2. Méthodes pour l‟étude de la structure quaternaire des protéines et des assemblages macromoléculaires
I.1.2.2.1. Diffusion aux petits angles
I.1.2.2.2. Cryomicroscopie électronique
I.1.2.2.3. Chromatographie d‟exclusion stérique
I.1.2.2.4. Résonance plasmonique de surface
I.1.2.2.5. Spectrométrie de masse
I.1.3. Méthodes d’analyse biochimique
I.2. Méthode associant les échanges hydrogène/deutérium à la spectrométrie de masse pour l’étude de la dynamique structurelle des protéines en solution
I.2.1. Principe des échanges isotopiques hydrogène/deutérium appliqués aux protéines en solution
I.2.1.1. Quel type d‟hydrogène va-t-on sonder dans nos expériences HDX ?
I.2.1.2. Des échanges isotopiques dépendant de la structure et de l‟accessibilité des protéines
I.2.1.3. Mécanismes de la réaction d‟échange hydrogène/deutérium dans les protéines et peptides
I.2.1.3.1. Définition du facteur chimique
I.2.1.3.2. Facteurs influençant le facteur chimique
I.2.1.3.3. Catalyse de la réaction
I.2.1.3.4. Cinétique d‟échange au niveau de la protéine et définition du facteur de protection
I.2.1.3.5. Deux modèles de cinétique d‟échange en fonction de la vitesse de dépliement et repliement des protéines
I.2.2. Techniques d’incorporation des deutériums dans les protéines
I.2.2.1. Marquage continu
I.2.2.2. Marquage pulsé
I.2.3. Analyse de l’incorporation des deutériums dans les protéines par spectrométrie de masse
I.2.3.1. Analyse des échanges : avantages de la MS vs. RMN
I.2.3.2. Approche classique « bottom-up »
I.2.3.2.1. Digestion protéolytique et analyse par LC-MS
I.2.3.2.2. Fragmentation en phase gazeuse des peptides protéolytiques
I.2.3.3. Approche moderne « top-down » ECD ou ETD
I.2.3.3.1. Méthodes de fragmentation de protéines intactes par ECD ou ETD
I.2.3.3.2. Approches top-down et HDX
I.2.3.3.3. Limitations des approches top-down HDX
I.3. Bibliographie
Chapitre II : Analyse de peptides modèles : validation de l’approche combinant échanges H/D et fragmentation ECD
II.1. Introduction
II.1.1. Spectrométrie de masse en tandem et HDX
II.1.2. Principe des peptides modèles développés par T. Jørgensen
II.2. Résultats
II.2.1. Système d’introduction des échantillons
II.2.2. Marquage des peptides de référence
II.2.3. Influence des paramètres de source sur le « scrambling »
II.3. Conclusions
II.3.1. Conclusion sur l’APEX III
II.3.2. Autres instruments FT-ICR
II.4. Bibliographie
Chapitre III : Développement de l’approche “HDX top-down ECD”
III.1. Pourquoi faire une analyse « top-down » des échanges H/D ?
III.1.1. Problèmes et limitations de l’approche « bottom-up »
III.1.2. Etat de l’art de la stratégie « top-down »
III.2. Comparaison des différentes techniques de fragmentation lors d’études HDX/MS par approche « top-down »
III.2.1. Développement de l’approche « top-down » HDX
III.2.1.1. Protéines d‟étude
III.2.1.2. Protocole d‟analyse HDX/MS
III.2.1.3. Instruments utilisés
III.2.2. Fragmentation par ECD
III.2.2.1. Analyse de la sous-unité aIF2α3
III.2.2.1.1. Spectre de masse
III.2.2.1.2. Résultats obtenus en ECD
III.2.2.1.3. Résultats en HDX/ECD
III.2.2.1.4. Analyse des données
III.2.2.2. Analyse du sous-complexe aIF2α3/γ
III.2.2.2.1. Optimisation du protocole d‟analyse
III.2.2.2.2. Résultats obtenus en HDX/ECD
III.2.3. Fragmentation par ETD
III.2.3.1. Spectre de masse
III.2.3.2. Résultats obtenus en ETD
III.2.3.3. Résultats en HDX/ETD
III.2.3.4. Analyse de données et comparaison avec les résultats d‟ECD
III.2.3.5. Conclusion
III.2.4. Fragmentation par CID
III.2.4.1. Analyse de la protéine aIF2α3
III.2.4.1.1. Spectres de masse
III.2.4.1.2. Résultats obtenus en HDX/CID
III.2.4.2. Analyse de la protéine aIF2α3 avec une étiquette poly-histidines
III.3. Détermination du taux maximal de deutération : mise en évidence du phénomène d’échange inverse
III.4. Conclusion
III.5. Bibliographie
Conclusion générale

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