Soutenance mémoire
Méthodes analytiques des fumonisines
Chromatographie sur couche mince (CCM)
La technique la plus ancienne est la CCM, elle est rapide et peut être automatisée ce qui est un avantage non négligeable. La technique est utilisable sans phase de purification.Sans purification, la limite de détection est de 100 μg/g et avec purification 5 μg/g. La première méthode développée utilisait deux types de plaques. La première est une plaque de silice de phase C18 ou C8 avec un solvant MeOHH2O (3/1). L’autre est une plaque de silice normale avec un solvant chloroforme-MeOH-H2O-EtOH .La dérivatisation a lieu en fin de séparation des molécules. La vaporisation de panisaldéhyde ou de ninhydrine permet la visualisation des molécules de fumonisines. La meilleure technique consisterait en l’utilisation de ninhydrine pour détecter les fumonisines dans les extraits purifiés. Le p-anisaldéhyde serait plus avantageux dans les extraits non purifiés contenant plus de 150 μg/g de FB1 [49]. Les limites de détection n’étant pas suffisantes pour détecter des fumonisines dans du maïs naturellement contaminé, de nouvelles techniques ont été mises au point. Pour obtenir une limite de détection de 100 μg/g, il est possible de développer en deux étapes. La section la plus basse de la plaque de silice est retirée entre les 2 étapes et les fumonisines sont quantifiées par spectrophotodensitométrie après application d’un spray de p-anisaldéhyde .L’utilisation de fluorescamine pour la révélation sous UV augmente la sensibilité et la sélectivité rendant la CCM utilisable pour le dosage des maïs naturellement contaminés [39]. La LD est alors de 0,1 μg/g. Des interférences dues à la matrice peuvent toutefois augmenter la LD à 1 μg/g. Mais le nettoyage des échantillons sur une colonne SAX avant la CCM permet d’obtenir une LD de 0,250 μg/g avec une plaque phase inverse. La visualisation des fumonisines fait suite à la vaporisation d’une solution composée de 0,5% de vaniline dans 97% d’acide sulfurique-EtOH (4/1). Un spot bleu-pourpre correspondant à la FB1 apparaît après chauffage 10 minutes à 120°C [50].
Chromatographie gazeuse (CG)
Le gaz utilisé est l’hélium. Cette technique s’utilise en association avec des détecteurs faisant appel à des techniques telles la spectrométrie de masse (MS) [50, 51] et l’ionisation de flamme (FID) [48]. Deux techniques essentielles émergent :
-la première consiste en une hydrolyse acide des fumonisines, entraînant un clivage des liaisons esters. L’acide tricarboxylique estérifié avec l’isobutanol est détecté par spectrométrie de masse. Avec la spectrométrie de masse, on obtient une LD de 1 μg/g [48].
-une autre technique utilise une hydrolyse alcaline : la fumonisine contenue dans l’échantillon est hydrolysée par action de KOH à 60°C pendant 1 heure. L’acide 1,2,3-propane-tricarboxylique est libéré et méthylé. L’ester ainsi formé est volatile et détecté par ionisation de flamme. La LD est de 0,5 μg/g.
La quantification peut être biaisée car la moisissure peut synthétiser d’autres composés qui permettent de produire le même acide [48].
Notons que le dosage par SM peut être amélioré par marquage des groupements méthyle de la fumonisine au deutérium. Ainsi, on obtient une LD de 0,01 μg/g.
Chromatographie liquide haute pression (HPLC)
La chromatographie liquide haute pression est très utilisée. 90% des laboratoires l’utilisent comme technique de référence. Une colonne à phase inverse, C8 ou C18 est utilisée pour la séparation [54, 55]. La fluorométrie est la méthode la plus utilisée pour la détection. La spectrométrie de masse et la radiodétection sont également utilisables.
HPLC/ Fluorométrie
Pour la détection en fluorométrie, la dérivatisation est indispensable. Elle a lieu dans la majorité des cas avant le passage dans la colonne HPLC. Tous les agents de dérivatisation ne sont pas adaptés à la recherche des fumonisines. Ces agents sont choisis en fonction de leurs propriétés et des différentes matrices. Une étude comparative montre que le 9-fluorenylméthyl-chloroformate (FMOC) et la fluorescamine ne sont pas de bons agents de dérivatisation pour la recherche des fumonisines dans le maïs, alors que le 4-fluoro-7-Nitrobenzofurazan (NBD) et le 4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (DBD) sont recommandés.
– Les premières techniques utilisant l’anhydride maléique permettaient d’obtenir une LD de 10 μg/g. Le pic obtenu était mal individualisé du fait d’autres composés présents dans le maïs. La LD est obtenue à partir de maïs contaminé artificiellement, la technique n’est pas recommandable pour la détection de contaminations naturelles [48].
– L’utilisation de la fluorescamine présente une sensibilité intéressante.
Cependant, sur le chromatogramme, la FB1 donne deux pics correspondant à une lactone et un produit d’hydrolyse formés lors de la réaction avec la fluorescamine. Ces deux pics rendent l’interprétation des chromatogrammes
difficile, donc la fluorescamine est peu recommandée pour la dérivatisation des fumonisines.
– L’O-phtaldialdéhyde (OPA) est le réactif de choix pour la dérivatisation, il a une très bonne sensibilité et est utilisé par la plupart des laboratoires [59].
L’adjonction de 2β-mercaptoéthanol à l’OPA permet une réaction rapide et reproductible sur un échantillon contenu dans un tampon borate à pH 9-10 à température ambiante. Cet agent présente cependant des limites. La réaction de fluorescence n’est pas stable au-delà de 4 minutes après la préparation. Une diminution de 5% de fluorescence a lieu à 8 minutes et cela empire au-delà. Une
standardisation du temps de réaction a été mise au point pour limiter cet inconvénient. L’injection dans la colonne HPLC est faite 2 minutes après mise en solution. Ainsi, une LD de 0,05 μg/g est obtenue. Les solutions d’OPA sont conservées 10 jours maximum à l’abri de la lumière car elles y sont instables [43].
– Le naphtalène-2,3-dicarboxyaldéhyde additionné à du KCN donne une très bonne fluorescence. Il permet une détection de 50 pg de FB1 standard [41, 60].
La technique a été utilisée dans le dosage de FB1 dans le lait avec une LD de 0,005 μg/ml [61]. La stabilité des produits dérivatisés est supérieure à 24 heures.
– Le 4-fluoro-7-Nitrobenzofurazan (NBDF) permet d’obtenir une LD de 0,1 μg/g. [62]. Il présente des limites de stabilité.
– Le 9-fluorenylméthyl-chloroformate (FMOC) donne une LD de 0,2 μg/g [63].
L’utilisation de cet agent est bonne dans la recherche de fumonisines dans les aliments. Les solutions dérivatisées sont stables 72 heures.
– Le 6-aminoquinoyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate permet de détecter la FB1 avec une LD 0,26 μg/g. Les dérivés sont stables pendant 4 heures [64].
– Le 1-diméthylaminonaphtalène-5-sulphonyl-chloride est un agent inutilisable sur le maïs en raison d’interférences analytiques [62].
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Table des matières
I. Introduction générale
II. Etude bibliographique
II.1. Toxicocinétique
II.1.1. Passage membranaire
II.1.2. Absorption
II.1.2.1. Mammifères monogastriques
II.1.2.2. Mammifères polygastriques
II.1.2.3. Volailles
II.1.3. Distribution
II.1.3.1. Mammifères monogastriques
II.1.3.2. Mammifères polygastriques
II.1.3.3. Volailles
II.1.4. Métabolisme
II.1.5. Elimination
II.1.5.1. Mammifères monogastriques
II.1.5.2. Mammifères polygastriques
II.1.5.3. Volailles
II.2. Méthodes analytiques des fumonisines
II.2.1. Echantillonnage, homogénéisation
II.2.2. Extraction
II.2.3. Purification
II.2.3.1. SAX
II.2.3.2. C18
II.2.3.3. Colonnes à immunoaffinité
II.2.3.4. Purification des échantillons d’origine animale
II.2.4. Dérivatisation
II.2.5. Détection, quantification
II.2.5.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
II.2.5.2. Chromatographie gazeuse (CG)
II.2.5.3. Chromatographie liquide haute pression (HPLC)
II.2.5.3.1. HPLC/ Fluorométrie
II.2.5.3.2. HPLC/ Spectrométrie de masse
II.2.5.3.3. HPLC/ Evaporative light scattering detection
II.2.5.4. Electrophorèse capillaire
II.2.5.5. Techniques ELISA
II.2.5.6. Autres techniques associées étudiées
II.2.6. Adaptation aux matrices carnées
II.2.7. Etude comparative des techniques analytiques
III. Etude Expérimentale
III.1.Matériel
III.2. Réactifs et produits chimiques
III.3. Animaux
III.3.1. Prélèvement des échantillons
III.3.2. Traitement des échantillons
III.4. Résultats-Discussion
III.4.1. Validation de la méthode chromatographique
III.4.2. Méthode de calcul
III.4.3. Standards et gammes
III.3.4. Limites de détection et de quantification
III.3.5. Données obtenues sur les plasmas
III.3.6. Données obtenues sur le foie
III.3.7. Données obtenues sur le muscle
III.3.8. Répartition de la FB1 dans les différentes matrices
IV. Conclusion et perspectives
Bibliographie
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