Soutenance mémoire
Préparation du matériel biologique
Les truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) utilisées lors de cette étude proviennent de deux sources distinctes en fonction du protocole d’étude mis en œuvre.
– d’une pisciculture commerciale pour les poissons de 0.9 à 1.2 kg
– de la Salmoniculture Expérimentale du Drennec INRA (SEDI) pour les poissons de 0.1 kg.
Avant le début des expériences, les poissons sont maintenus une semaine au moins dans des aquariums en circulation semi-ouverte, dans une eau largement aérée. Les animaux sont nourris quotidiennement, à raison de 40g / kg de poids frais. Le sang est obtenu par venipuncture caudale à l’aide d’une seringue au préalable héparinée (1mg.ml-1 ) . Les globules rouges et le plasma sont immédiatement séparés par centrifugation (3 mins, 1000 g). La suspension de globules rouges est ensuite rincée à trois reprises (3 mins, 2000 tr.mins-1 ) à l’aide d’une solution saline de Ringer Cl- oxygénée (Tab. 2.). Les érythrocytes sont alors incubés durant une nuit à 5°C, à 30 % d’hématocrite sans mélange, ceci afin d’assurer un contenu en eau et en ions normal avant les expériences (Bourne et Cossins, 1984 ; Nielsen, et al. 1992). Avant toute expérience, les globules rouges sont à nouveau rincés trois fois avec une solution saline Ringer Cl- .
Mesure du contenu en eau (méthode du rapport eau sur poids sec)
Après 12 heures à 5 °C, les globules rouges sont rincés trois fois à l’aide de l’une des solutions salines isotoniques correspondant à l’expérience (Ringer chlore, Ringer nitrate ou Ringer methylsulfonate, MeSF). L’ensemble des solutions utilisées est filtré à 0.2 µm (filtre 0.2 µm en cellulose, Millipore, France). La suspension de globules rouges, à un hématocrite de 30 %, est ensuite mise en équilibre avec l’air durant une période de 30 minutes avant le début des expériences. Après équilibration à l’air, les globules rouges en suspension sont transférés dans les tubes expérimentaux. Pour soumettre les globules rouges à un choc hyposmotique (215 mOsm) et suivre les variations du contenu en eau des cellules, comme indicateur du volume cellulaire (Garcia-Romeu et al., 1991), le protocole suivant a été utilisé pour l’ensemble des expériences. Une partie de la suspension de globules rouges est utilisée comme témoins, c’est-àdire :
– témoin hypotonique, lot de cellules soumises à un choc hypotonique sans ajout de drogue,
– témoin isotonique, lot de cellules maintenues en isotonie sans ajout de drogue.
Quelle que soit la drogue employée, une partie de la suspension d’érythrocytes est utilisée comme contrôle, c’est-à-dire un lot de cellules soumises à un «choc » isotonique avec ajout de drogue, à la même concentration que celle utilisée durant l’expérience. Le choc hypotonique est réalisé par dilution de moitié de la solution de globules rouges placés en isotonie par une solution ne contenant pas de chlorure de sodium (64 mOsm, osmolarité finale 215 mOsm, Tab. 2.). Aussi, les lots de cellules servant de contrôles isotoniques subissent également une dilution de moitié par ajout de solution isotonique correspondante. Lorsque l’effet des différentes drogues est testé, les globules rouges sont incubés 10 minutes en isotonie en présence de l’inhibiteur, la concentration finale en drogue étant maintenue constante au moment du choc osmotique. Lorsque la drogue utilisée nécessite une préparation dans un solvant organique (éthanol ou DMSO), la concentration finale en solvant n’excède pas 0.025% vol/vol.
Pendant toute la durée des expériences, les suspensions de globules rouges sont agitées, et les expériences conduites à une température de 15 °C. Trois échantillons de sang sont prélevés à intervalle régulier (t= 5 , 60 120 et 180 mins) et placés dans des tubes en plastiques de 400 µl (type Beckman, Polylabo, France). Après centrifugation (7 mins, 20000 g), le culot de globules rouges est séparé du surnageant en coupant le tube. Chaque cône ainsi obtenu est pesé sur une feuille de papier aluminium, elle-même pesée au préalable, le tout constituant ainsi le poids humide. L’ensemble culot+papier aluminium est alors séché à 90 °C pendant 24 heures jusqu’à l’obtention d’un poids constant, puis pesé à nouveau, ce qui permet de déterminer le poids sec, après pesée du cône plastique.
Mesure du contenu en potassium des cellules
Lorsqu’une mesure du contenu en potassium est effectuée en parallèle à la mesure du contenu en eau, deux réplicats supplémentaires sont prélevés aux mêmes intervalles de temps que lors de la mesure du rapport eau sur poids sec, centrifugés et pesés. Les culots de sang frais sont alors dissouts dans 5 ml d’une solution de lithium à 15 mEq.l -1 . Après dissolution complète du culot de globules rouges, 100 µl d’acide perchlorique sont ajoutés à la suspension, afin de précipiter les protéines. Après centrifugation (45 mins, 20000g), le surnageant est conservé pour l’analyse du contenu en cations (potassium). La mesure du contenu en cations est effectuée à l’aide d’un photomètre de flamme (IL 243 -05, Instrumentation Laboratory, France).
Que ce soit pour la mesure du rapport eau sur poids sec ou pour la mesure du contenu en cations, aucune correction n’a été apportée quant à la quantité de fluide susceptible d’être piégée après centrifugation. Lorsque le contenu en ions et les rapports eau sur poids sec sont mesurés sur les mêmes lots expérimentaux, ceux-ci contiennent de la ouabaï ne (100 µM) en plus de la drogue utilisée, afin de s’affranchir de tout artefact dû à l’activité de la pompe Na/K AT Pase. De plus, il convient de remarquer que l’addition de ouabaï ne ne modifie pas le rapport eau sur poids sec des cellules, que ce soit à l’isotonie ou lors d’une stimulation hypotonique (Garcia-Romeu et al., 1991).
Mesure de flux isotopiques
Des mesures de flux isotopiques (influx de potassium) ont été réalisées afin de déterminer le flux de potassium à travers la membrane au cours du temps, suite à un choc hyposmotique. La mesure a été effectuée en influx, car la cinétique de l’influx de potassium est similaire à celle de l’efflux (Bourne et Cossins, 1984).
La suspension cellulaire (2 à 7 ml, 25 -30% d’hématocrite) est incubée dans des tonomètres (Eschweiler) à une température de 15 °C et équilibrée avec un mélange gazeux de 5:95 (vol/vol) air/azote, afin de s’assurer que le volume cellulaire est stable et que le cotransport K-Cl est désactivé. Le mélange gazeux est fourni par des pompes Wösthoff (Bochum) à 15°C et humidifié. 100µM de ouabaï ne préparée en solution stock 0.1M dans du DMSO sont ajoutés 15 minutes avant le début des expériences. Les drogues utilisées lors de ces expériences sont ajoutées 10 minutes avant le choc osmotique (215 mOsm).
Le flux (influx) unidirectionnel de potassium est déterminé à 15°C en utilisant le 86Rb+ comme traceur (Amersham International, Angleterre), comme il a été précédemment décrit par Garcia-Romeu et al. (1991) et Nielsen et al. (1992). Des aliquots (100 µl) de la suspension de cellules prééquilibrés sont prélevés à intervalles réguliers (5, 35, 70,105 et 140 mins) et placés dans 0.9 ml de solution saline, prééquilibrée avec le même mélange gazeux, donnant ainsi un hématocrite final de 3%. La mesure de l’incorporation de 86Rb+ est initialisée par l’addition de 20 µl de solution saline contenant le 86Rb+ (0.3-0.5 µCi/ml en final). Après 5 minutes, durant lesquelles la suspension est toujours équilibrée avec le même mélange gazeux, trois aliquots sont prélevés et placés dans des tubes Eppendorf. Les aliquots sont rapidement lavés à trois reprises par centrifugat ion (microcentrifugeuse Eppendorf 5s, 10000 g) avec une solution froide de MgCl2/Imidazole (100 mM/10mM) pH 7.90 , 320 mOsm afin de stopper la réaction d’incorporation du traceur radioactif. Les culots de sang sont ensuite lysés avec 0.5 ml de Triton X 0.05% (vol/vol) et les protéines sont finalement précipitées avec 0.5 ml d’acide trichloroacétique 10% (masse/vol). L’ensemble est précipité par centrifugation (10 mins, 10000 g) et la radioactivité du surnageant est déterminée par comptage Cérenkov. Le taux d’incorporation du 86Rb+ (équivalant à l’influx de K+ insensible à la ouabaï ne) durant la période de 5 minutes est calculé en mmol K+ .(l paquet de cellules)-1 .h-1 . Chaque valeur est la moyenne ± l’écart type (SD) de trois réplicats. Le « paquet » de cellules est déterminé à partir de l’hématocrite de la suspension cellulaire.
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Table des matières
Introduction générale
Matériels et méthodes
1. Préparation du matériel biologique
2. Mesure du contenu en eau (méthode du rapport eau sur poids sec)
3. Mesure du contenu en potassium des cellules
4. Mesure de flux isotopiques
5. Mesure de la fragilité osmotique
6. Patch-clamp
6.1. Principe
6.2. Enregistrement des courants et électronique du poste de « patch-clamp »
6.3.Protocole
6.4.Analyse des courants ioniques traversant un canal
6.5.Analyse des caractéristiques électriques d’un canal en configuration « cell-attached » et « inside-out »
6.6.Analyse des caractéristiques électriques de la membrane en « configuration « whole-cell »
7. Présentation des données et analyse statistique des résultats
8. Produits chimiques utilisés au cours des différentes expériences
Chapitre 1. Caractérisation des voies de conductance ioniques de la membrane des érythrocytes nucléés de truite
Introduction
Résultats
1. Mise en évidence en conditions isosmotiques d’une voie de conductance chlore en configuration « whole-cell »
2. Enregistrement de l’activité isolée des canaux ioniques sur la membrane des globules rouges en configuration « cellattached »
2.1. Enregistrement de l’activité d’un canal cationique non sélectif sur la membrane des globules rouges en configuration « cellattached »
2.1.1. Détermination de la perméabilité aux cations et de la conductance du canal
2.1.2. Essais de modulation de l’activité du canal cationique non sélectif (CNS) en configuration « cell-attached »
2.1.3. Mécano-sensibilité du canal cationique non sélectif
2.2. Enregistrement de l’activité d’un canal chlore à conductance linéaire sur la membrane des globules rouges en configuration « cell-attached »
2.3. Enregistrement de l’activité d’un canal cationique non sélectif sur la membrane des érythrocytes en configuration « inside-out »
2.3.1. Détermination de la perméabilité aux cations et de la conductance du canal
2.3.2. Analyse cinétique de l’activité du canal cationique non sélectif
2.3.3. Mécano-sensibilité du canal cationique non sélectif en configuration « inside-out »
2.3.4. Action d’agents pharmacologiques inhibiteurs sur l’activité du canal cationique non sélectif
2.4. Enregistrement de l’activité d’un canal chlore à conductance linéaire sur la membrane des globules rouges en configuration « inside-out »
2.4.1. Détermination de la perméabilité au chlore et de la conductance du canal
2.4.2. Détermination de la sélectivité anionique du canal
2.4.3. Fréquence d’occurrence du canal chlore à conducta nce linéaire et cinétique du canal
2.4.4. Inhibiteurs du canal chlore à conductance linéaire
2.5. Enregistrement de l’activité d’un canal chlore rectifié sortant sur la membrane des globules rouges en configuration « inside-out »
2.5.1. Détermination de la perméabilité aux ions chlore et de la conductance du canal
2.5.2. Détermination de la sélectivité cationique et anionique du canal
2.5.3. Analyse cinétique du canal chlore rectifié sortant
2.5.4. Effets des inhibiteurs des canaux chlores sur l’activité du canal chlore rectifié sortant
3. Mise en évidence de l’activation de voies de conductance lors d’un choc hyposmotique
3.1. Mise en évidence de l’augmentation des courants membranaires globaux de l’érythrocyte de truite en conditions hyposmotiques
3.2. Dépendance vis-à -vis des ions chlores et sensibilité au DIDS des courants globaux en conditions hyposmotiques
3.3. Activation réversible des courants globaux par le choc osmotique
4. Essai de caractérisation des voies de conductances impliquées dans l’augmentation de conductance membranaire observée en conditions hypotoniques en configuration « cell-attached »
Discussion
Conclusion
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