Mémoire master développement d’un test sérologique pour le diagnostic de la cysticercose porcine

Mémoire pour l’obtention du diplome de master parcours : biochimie, biodiversité et santé

METHODOLOGIE GLOBALE

Ce travail de Master est inclus dans le projet de recherche de l’Unité d’Immunologie des Maladies Infectieuses (IMI) visant à développer des tests de diagnostic sérologiques et moléculaire pour améliorer le diagnostic de la cysticercose Humaine et porcine. Le travail réalisé durant ce Master a été effectué en suivant la méthodologie globale schématisée dans la Figure 8. Les sérums de porcs (atteints ou non de la cysticercose) ont d’abord été testés par EITB-CS50 (tests de référence sérologique) en utilisant les glycoprotéines natives totales extraites et purifiées à partir de cysticerques de T. solium selon la méthode de Tsang et al., 1989. La présence d’anticorps anti-T. solium (immunoglobulines de type G, IgG) dirigés contre les glycoprotéines contenues dans la CS50 ou dirigés contre chacune des 3 protéines recombinantes produites au sein de l’Unité a ensuite été analysée par ELISA.

COLLECTION DE SERUMS DE PORCS

Afin de valider l’utilisation des protéines recombinantes produites comme marqueurs sérologiques, des campagnes de prélèvement de sérums de porcs atteints ou pas de cysticercose ont été réalisées avec le Laboratoire National de Diagnostic Vétérinaire de Madagascar (LNDV) et avec le Département de biologie des maladies vétérinaires de l’Université de Copenhague – Danemark. D’autres sérums, provenant des porcs élevés à Madagascar ou provenant d’une zone non-endémique (Danemark) pour la cysticercose porcine, ont été également obtenus. Les résultats obtenus au cours de cette étude ont été générés à partir d’une collection de sérums de porcs constituée de:  Douze sérums de porcs (appelés Cel1-Cel5, Cel8-Cel12, Cel14 et Cel15) provenant de l’abattoir d’Arivomamo (Région d’Itasy) et pré-diagnostiqué par les méthodes de langueyage et d’examen approfondis des carcasses ainsi que par l’utilisation d’un scanner portatif (Master de Céline LACROIX, IPM2016)  Onze sérums de porc (appelés LNDV) provenant des élevages à Madagascar et de deux abattoirs d’Antananarivo (Anosizato et Anosipatrana)  Quarante sérums de porcs sains provenant de zones non-endémiques à la cysticercose (appelés Belg)  Quatorze sérums de porcs atteints de la trichinellose (appelés Tric et Exuda).

Les tests de mise au point et de validation des techniques ELISA (utilisant la CS50 ou utilisant les protéines recombinantes) ont été réalisés en incluant systématiquement des sérums de porcs provenant de l’abattoir d’Anosizato et préalablement testés et identifiés au laboratoire comme témoins négatifs et témoins positifs.
a. Le témoin négatif : il s’agit d’un sérum de porc totalement exempt de cysticerques de T.solium (après examen minutieux de la carcasse) et testé négativement avec la méthode de référence EITB-CS50.
b. Le témoin positif: c’est un sérum de porc atteint de cysticercose détectés après langueyage et inspection des différents organes (cysticerques présents dans l’échine et les membres) et analysé positivement par EITB-CS50.

ANTIGENES DE T. solium Les antigènes utilisés dans les tests sérologiques (ELISA et EITB/Western Blot) au cours de cette étude sont constitués par :  La fraction totale de glycoprotéines membranaires de cysticerques de T. solium extraite et purifiée selon la méthode de Tsang et al., 1989.  Les antigènes recombinants de T. solium (rGP18, rGP14 et rGP8) correspondant respectivement aux glycoprotéines natives T18, T14 et T8 et produits sous forme solubles en utilisant un système de production de protéine recombinante chez la bactérie (E. coli).

Antigènes membranaires de cysticerques de T. solium (CS50) La CS50 est une fraction glycoprotéique totale issue de la purification d’un extrait protéique de cysticerques prélevés sur porcs ladres selon le protocole initialement décrit par Tsang et al., 1989. Brièvement, les cysticerques de T. solium sont prélevés sur porcs ladres et broyés en présence d’inhibiteurs de protéases. Une purification des protéines totales par chromatographie d’exclusion ou “gel filtration” en tampon Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, pH=7,4 en utilisant une colonne Sephadex-G25 (Pharmacia, système AKTA purifier, GE-Healthcare Life Sciences) est ensuite réalisé à partir du surnageant du broyat brut les cysticerques de T. solium. Les glycoprotéines antigèniques natives sont ensuite purifiées par chromatographie d’affinité sur une colonne de lectine [Concanavaline A (ConA) couplée à la Sépharose-4B (Amersham Biosciences)]. La fraction antigènique CS50 ainsi obtenue est utilisée dans les tests sérologiques pour le diagnostic de la cysticercose Humaine. La CS50 déjà produite à l’Unité avant le début de mon stage de Master a été utilisé pour les tests d’ELISA-CS50 et d’EITB-CS50.

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Mots clés : cysticercose porcine, glycoprotéine, protéine recombinante, diagnostic sérologique, ELISA, EITB.

Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
GENERALITES SUR LA CYSTICERCOSE
A. LE PARASITE : T. solium
B. REPARTITION GEOGRAPHIQUE ET EPIDEMIOLOGIQUE
C. LA CYSTICERCOSE PORCINE
D. MOYENS DE DIAGNOSTICS DE LA CYSTICERCOSE PORCINE
E. OBJECTIFS DU TRAVAIL
MATERIELS ET METHODES
I. METHODOLOGIE GLOBALE
A. COLLECTION DE SERUMS DE PORCS
B. ANTIGENES DE T.solium
II. TESTS SEROLOGIQUES
1. Test ELISA
a. Principe du test ELISA
b. Mise au point de la technique ELISA CS50
c. Validation des protéines recombinantes par la technique ELISA
2. Test WESTERN BLOT (EITBCS50) RESULTATS
I. CLASSIFICATION DES SERUMS DE PORCS
II. MISE AU POINT DE L’ELISA CS50
III. ANALYSE DE LA QUALITE DES PROTEINES RECOMBINANTES
IV. VALIDATION DES PROTEINES RECOMBINANTEST8, T14 et T18
1. Antigénicité et seuil de positivité
2. Détermination de la spécificité et de la sensibilité
3. Etude des réactions croisées
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE I
ANNEXE II

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