Mémoire culture, transfection, stimulation et fixation des cellules HEK  

Rapport de stage les interactions moléculaires et la mobilité de la CaMKII à la synapse en PDF

A- Résumé II
B- Avant propos II
C- Table des matières IV
C1 – Liste des figures VI
D- Introduction  
D1 – Le système nerveux
D2- Le neurone
D3- Les synapses
D4- La plasticité synaptique
D5- L’épine post-synaptique
D6-La CaMKII
D7- La CaMKII : sa structure et son activation
D8- La CaMKII : ses auto-phosphorylations
D9- La CaMKII : ses interactions protéiques
D10- La CaMKII : ses interactions au récepteur NMDA
DM- La CaMKII : son auto-association
D12- La CaMKII : sa localisation synaptique et ses changements de localisation
D13- La CaMKII : les enjeux de la régulation de sa localisation
E- Matériel et méthodes  
El-Constructions de CaM Kl I-GFP et de NR2B
E2- Culture, transfection, stimulation et fixation des cellules HEK
E3- Immunocytochimie
E4- Microscopie confocale
E5- Analyse des images
E6- Cultures, transfections et imagerie de neurones
E7-Analyse du FRAP
F- Résultats  
FI- La CaMKII translocalise dans le neurone suite à l’activation des récepteurs NMDA
F2- L’interaction de la CaMKII avec le récepteur NMDA (via NR2B) dépend d’une élévation de la concentration de calcium
F3- L’auto-association de la CaMKII dépend d’une élévation de la concentration de calcium et d’une baisse de pH
F4- L’auto-association de la CaMKII dépend de la structure multimérique de la CaMKII, de l’activation par le Ca2+/CaM et d’interactions du domaine catalytique, mais est inhibée par l’auto phosphorylation de laT286
F5- L’auto-phosphorylation de la thréonine 286 de la CaMKlI diminue son auto-association mais des CaMKII auto-phosphorylées sont présentes dans les agrégats de CaMKII auto-associées
F6- Le FRAP permet de mesurer la mobilité de protéines dans les épines de neurones en culture
F7- FRAP de laGFP-CaMKII dans les épines de neurones en culture
F8- Caractérisation de l’étendue du photoblanchiment lors du FRAP
F9- Des protéines de différentes grosseurs ont des mobilités différentes dans les épines de neurones en culture
F10- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII dans les épines
Fil- Interprétation de la courbe du FRAP de la GFP-CaMKII 1-326 dans l’épine
FI2- Interprétation de la courbe du FRAP de laGFP dans l’épine
FI 3- La mobilité des protéines dépend de la morphologie compartimentée du neurone
F14- L’activation transitoire des récepteurs NMDA induit des changements pour la mobilité des protéines (GFP) dans l’épine post-synaptique
F15- L’effet de l’activation transitoire des récepteurs NMDA sur la mobilité de la CaMKII dans : – L’épine post-synaptique   – La dendrite
FI6- L’activation transitoire des récepteurs NMDA modifie la mobilité de la CaMKII 1-326 dans l’épine
G- Discussion  
Gl- Étude des interactions de la CaMKII
G2- Étude de la mobilité de la CaMKII
Conclusion générale

Rapport PFE, mémoire et thèse avec la catégorie biochimie

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L’épine post-synaptique

L’épine post-synaptique est une structure spécialisée pour répondre aux stimulations pré-synaptiques glutamatergiques. Elle est formée d’un compartiment partiellement isolé de la dendrite, appelé tête de l’épine, qui communique avec la dendrite en utilisant un conduit étroit appelé cou de l’épine (Nimchinsky et al., 2002; Sabatini et al., 2001). Les dimensions (volume de la tête -0.01 -lum ; diamètre du cou -0.1 um) et la géométrie des épines varient grandement selon les régions du cerveau, l’état des synapses, les divers processus physiologiques tels que le développement neuronal et les diverses conditions pathologiques telles que les retards mentaux.

La CaMKII : ses auto-phosphorylations

Une particularité importante de la CaMKII réside dans sa structure multimérique où 12 sous-unités sont assemblées grâce à leur domaine d’association pour former une structure en disque avec les domaines catalytiques situés en périphérie (Rosenberg et al., 2005). Cette structure confère plusieurs avantages à la CaMKII dont celui de pouvoir s’auto-phosphoryler, c’est-à-dire qu’une sous-unité peut phosphoryler une sous-unité voisine lorsque les deux sous-unités sont activées simultanément. La thréonine 286 est située à la base du domaine régulateur et son auto-phosphorylation produit trois effets importants sur la kinase (Hudmon et Schulman, 2002). 1) L’auto-phosphorylation de T286empêche l’inhibition par le domaine régulateur et rend l’enzyme autonome, donc constitutivement active même lorsque la concentration de Ca 2+ diminue et que Ca 2+ /CaM se dissocie de l’enzyme. Cette auto-phosphorylation augmente de 1000 fois l’affinité de la CaMKII pour Ca 2+ /CaM. 2) De plus, l’auto-phosphorylation de la T286 expose un site d’interaction de la CaMKII avec différentes protéines synaptiques dont le récepteur NMDA. 3) Les thréonines 305 et 306 sont également situées sur le domaine régulateur de la CaMKII et peuvent être auto phosphorylées. Par contre, ces auto-phosphorylations sont inhibitrices puisqu’elles empêchent la liaison de Ca 2+ /CaM (Hudmon et Schulman, 2002).

Conclusion

Le remodelage synaptique dépendant de l’activation des récepteurs NMDA est un processus qui semble être important pour la potentialisation ou la dépression synaptique dépendante de l’activité de la synapse (Collingridge et Bliss 1995). L’entrée de calcium associée à cette activation est un point de départ d’une multitude de voies de signalisation qui conduiront au remodelage synaptique. La CaMKII, qui est présente à la synapse, est activée par cette entrée de calcium, via la calmoduline. Or, en plus de l’activation des CaMKIIs présentes dans la synapse, l’entrée de calcium cause un recrutement synaptique de CaMKII additionnelle à partir des dendrites. Les résultats obtenus au cours de mon projet de maîtrise montrent que l’interaction de la CaMKII à NR2B et l’auto-association de la CaMKII sont deux phénomènes qui sont susceptibles de contribuer à la translocalisation synaptique de la CaMKII. De plus, mes résultats montrent comment la régulation de l’activation de la CaMKII peut participer à la régulation de ces interactions. Ce qui est particulièrement intéressant est que la translocalisation synaptique de la CaMKII n’est pas totalement réversible et qu’une fraction significative de l’enzyme demeure dans la synapse après sa stimulation. On peut penser que cette rétention de CaMKII dans la synapse serait un élément clé dans la signalisation qui mène aux changements plastiques à long-terme associés à l’activation des récepteurs NMDA (Lisman et al., 2002; Rongo, 2002). Ein effet, la rétention de la CaMKII dans la synapse la place à un endroit clé pour agir sur ses substrats synaptiques. De plus, l’enzyme s’y retrouve dans un mode partiellement autonome, par son autophosphorylation (Forest, 2006) et son interaction avec le récepteur NR2B (Bayer et al, 2001, 2006). Ainsi, il sera très intéressant de tester si cette rétention de l’enzyme à long terme dans la synapse joue un rôle sur la plasticité synaptique.

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