Soutenance mémoire
Mécanismes de la résistance bactérienne aux Bêta-lactamines
Trois mécanismes de résistance d’importance variable sont décrits. On cite :
– la diminution de la perméabilité membranaire
– la modification de la cible des bêta-lactamines (PLP)
– l’inactivation enzymatique de la bêta-lactamine.
En ce qui concerne les bacilles à Gram négatif, les deux premiers phénomènes restent mineurs et seul prédomine l’inactivation enzymatique.
L’Inactivation enzymatique des Bêta-lactamines
Deux types d’enzymes sont incriminés dans l’inactivation enzymatique des bêta-lactamines notamment les amidases et les bêta-lactamases. Mais l’inactivation par les bêta-lactamases demeure le mécanisme principal de résistance aux bêta-lactamines.
Définition des bêta-lactamases
Produites par certaines bactéries, les bêta-lactamases sont des enzymes dont l’action sur les molécules de bêta-lactamines provoque une ouverture du noyau bêta lactame et donne lieu à la formation de nouvelles molécules dépourvues d’activité antibactérienne.
Classification des bêta-lactamases
Plusieurs classifications sont proposées pour classer les bêta-lactamases des bacilles à Gram négatif.
L’étude de ces classifications est d’autant plus complexe qu’elles sont très souvent basées sur des critères différents (le groupe bactérien, la séquence peptidique, le point isoélectrique, l’activité enzymatique etc.…).
Toutefois, dans l’optique de la thérapeutique, il n’est pas nécessaire de retenir toutes les subtilités d’identification répertoriées dans la littérature telles que TEM-1,TEM 2,OXA 1,OXA-3, HMS-PIT,PSE… d’autant plus qu’il ne s’agit quelques fois que d’un seul exemplaire rapporté dans la littérature.
En revanche, la signification en terme de résistance (pénicillinase chromosomique ou plasmidique, cephalosporinase inductible ou constitutive, bêta-lactamase à spectre élargi…), sa fréquence par espèce et par pays est d’une grande importance en raison du choix qu’elle permet d’affiner.
Ainsi, on peut distinguer 5 principales bêta-lactamases :
Les pénicillinases chromosomiques
Elles hydrolysent les noyaux bêta lactames des pénicillines, des céphalosporines de 1ère et 2ème génération en dehors de la céfoxitine.
Elles sont sensibles à l’action des inhibiteurs des bêta-lactamases. (Acide clavulanique, Sulbactam, Tazobactam)
Les pénicillinases plasmidiques
Leur spectre d’action comprend celui des pénicillinases chromosomiques auquel on ajoute une céphalosporinase de 3ème génération : le céfoperazone.
Elles sont sensibles à l’action des inhibiteurs des bêta-lactamases. (Acide clavulanique, Sulbactam, Tazobactam)
Les céphalosporinases inductibles
Elles agissent sur toutes les pénicillines à l’exception des amidinopénicillines (Mecillinam). Il en est de même des céphalosporines de 1ère et de 2ème génération y compris le céfoxitine.- les céphalosporinases constitutives.
Leur spectre d’action comprend celui des céphalosporinases inductibles auquel il faut ajouter les céphalosporines de 3ème génération et les monobactames.
Toutefois, leur action sur le Latamoxef est variable.
Elles ne sont pas sensibles à l’action des inhibiteurs des bêta-lactamases.
– les bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE)
Leur spectre d’action inclut toutes les bêta-lactamines à l’exception des céphamycines et des carbapénemes (Imipénème).
Elles sont sensibles à l’action des inhibiteurs des bêta-lactamases.
Mécanismes de résistance aux Aminosides
Trois mécanismes expliquent la résistance vis-à-vis des aminosides :
– l’altération des cibles des aminosides
– l’interférence avec le système de transport actif de l’antibiotique dans la cellule bactérienne
– l’inhibition enzymatique
Les deux premiers mécanismes se produisent à la suite de mutations génétiques de la bactérie et sont rares en clinique.
Par contre, l’inhibition enzymatique est de loin le mécanisme de résistance le plus fréquemment rencontré avec les aminosides.
L’inactivation enzymatique des Aminosides
Les enzymes incriminés sont d’origine plasmidique et de trois types :
– les Phospho-transférases (APH)
Elles catalysent la phosphorylation des groupements hydroxyls.
– les Nucleotides-transférases (ANT)
Elles catalysent l’adénylation des groupements hydroxyls.
– les Acétyl-transférases (ACC)
Elles catalysent l’acétylation des groupements aminés
Mécanisme de résistance bactérienne aux Fluoroquinolones
Les Fluoroquinolones sont des molécules entièrement synthétiques, de ce fait, la résistance bactérienne par destruction enzymatique est peu vraisemblable.
Toutefois, les bactéries acquièrent une résistance aux Fluoroquinolones exclusivement par mutation génétique affectant soit le transport de l’antibiotique dans la cellule soit sa cible.
MATERIEL
Type d’étude et durée
Il s’agit d’une étude transversale qui s’est déroulée de 14 janvier au 14 novembre 2004. Elle a porté d’une part sur l’isolement des bactéries responsables d’infection urinaire chez les patients ambulatoires et d’autre part à la réalisation de leur antibiogramme en vue de déterminer leur profil antibiotypique.
Population d’étude
Les échantillons d’urine ont été prélevés, d’une part, chez des patients ambulatoires adressés à l’ IPCI par les dispensaires de la ville d’Abidjan après consultation, et d’autre part chez des malades hospitalisés de moins de 48 h.
Lieu
Les prélèvements ont été effectués au Département de Bactériologie Virologie, Unité de Bactériologie Clinique (UBC) de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire.
Critères d’inclusion
Seuls les patients ambulatoires et les malades hospitalisés de moins de 48h étaient éligibles à notre étude.
Milieu d’Isolement
– Gélose ordinaire : Il s’agit d’une gélose qui convient à la culture de bactéries peu exigeantes, il garde l’aspect macroscopique et microscopique des germes.
– Gélose EMB : Ce milieu est employé pour l’isolement des entérobactéries.
– Gélose Chapman : c’est un milieu inhibiteur pour isolement des staphylocoques et pour leur identification.
– Gélose BEA : Elle permet l’isolement et l’identification des streptocoques du groupe D.
Milieu d’identification
– Gélose au Tellurite de potassium, elle permet de mettre en évidence de la réduction du Tellurite de potassium.
– Gélose à l’ADN : Elle est utilisée pour la mise en évidence d’une DNAse.
– Gélose cetrimide
– Portoir réduit de Leminor, composé de :
* Milieu Urée Indole (BBL Cat. No 1), il permet de rechercher la présence d’une uréase, d’une Tryptophane désaminase (TDA), la production d’indole.
* Milieu Kligler Hajna (BBL Cat. No 11317), on l’utilise pour rechercher la fermentation simultanée du glucose et du lactose, la production d’hydrogène sulfuré, la production du gaz.
* Milieu Lysine fer (BBL Cat. No 11363)
Examen cytologique
Aspect quantitatif
A l’aide d’un dispositif de type lamelle sur lame observé à l’objectif × 40, on dénombre les différents éléments figurés contenus dans un volume donné de l’urine.
En cas d’infection urinaire, le processus inflammatoire se traduit le plus souvent par la présence de :
– > 50 000 leucocytes / ml, parfois en amas
– > 10 000 hématies / ml témoins de micro-hemorragies ;
– Cellules de revêtement urothelial
Ensemencement : choix des géloses
Selon les résultats de l’observation microscopique, On ensemence par stries une gélose ordinaire de type gélose Columbia, une gélose EMB pour les entérobactéries, une gélose au sang voire une gélose chocolat sous 10% de CO2.
Apres 24 h d’incubation, la poursuite de l’analyse microbiologique dépend de l’interprétation cytobactériologique, des renseignements cliniques.
Identification des Bactéries
Le nombre limité d’espèces microbiennes impliquées simplifie le choix de la technique.
→ Etude morphologique (Coloration de Gram)
A l’aide d’une anse de platine nous réalisons un frottis à partir d’urine totale sur une lame porte objet. Le frottis ainsi obtenu est séché, fixé et coloré à l’aide des colorants de Gram.
L’observation du frottis coloré au microscope optique à l’objectif × 100 nous a permis de distinguer les bactéries selon leur morphologie c’est à dire bacille ou Cocci, mais de diviser les bactéries en deux grands groupes : les Gram positif et les Gram négatif.
Bacilles à Gram négatif non exigeants
Rechercher le type de mobilité entre lames et lamelles à partir d’un bouillon coeur cervelle.
Rechercher la présence de cytochrome oxydase C à partir de la gélose Columbia.
Rechercher la fermentation ou non des sucres en ensemençant le portoir réduit de Le Minor.
Entérobactéries
Les entérobactéries appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae.
Cette famille est composée de bactéries, rassemblées en raison de leurs caractères communs :
• Ce sont des bacilles Gram négatif,
• Mobiles par une ciliature péritriche ou immobile,
• Cultivant sur les milieux ordinaires,
• Fermentant le glucose avec ou sans production de gaz,
• Ne possédant pas de cytochrome oxydase C,
• Produisant une catalase,
• Réduisant les nitrates en nitrites
Leur identification est basée sur des caractères biochimiques
observés du portoir réduit de Le Minor et le portoir de Falcov.
Antibiogramme
Définition et principe
Principe
La méthode de diffusion ou antibiogramme standard.
Des disques de papier buvard imprégnés d’antibiotiques à tester sont disposés à la surface d’une gélose MUELLER HINTON préalablement ensemencée avec une culture pure de la souche à étudier. Dans l’application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque.
Réalisation pratique de l’antibiogramme
Préparation de la gélose
La gélose MUELLER HINTON a été préparée en respectant une épaisseur de 4 mm.
Contrôle de qualité du milieu et des disques
Pour vérifier la validité des disques et la conformité du milieu MUELLER HINTON des souches de référence ont été utilisées (E coli / ATCC 25922).
L’antibiogramme de ces souches a été réalisé en même temps que celui des souches à étudier.
A chaque changement de lot de disques ou de milieu gélose, ce contrôle de qualité est réalisé.
Ensemencement
L’ensemencement se fait par inondation de la surface entière de la gélose avec 3 – 5 ml de la suspension bactérienne. A l’aide de la pipette Pasteur on effectue une rotation complète en s’assurant d’une bonne répartition de la solution. On rejette le surplus en aspirant à l’aide d’une pipette Pasteur munie d’une poire et enfin on incube les boites de pétri à l’étuve à 37° C pendant 15 minutes.
Pose des disques et Pré diffusion des antibiotiques
Après le séchage, les disques sont déposés sur la gélose à 30 mm l’un de l’autre à l’aide d’un applicateur automatique ou à la pince flambée.
Les boîtes sont ensuite laissées à la température ambiante pendant 30 minutes sur la paillasse pour permettre la diffusion de l’antibiotique dans la gélose.
Incubation
On incube les boites de Pétri à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures.
Lecture interprétative
Les diamètres d’inhibition autour des disques sont mesurés à l’aide d’un pied à coulisse ; puis ils sont comparés aux diamètres critiques rassemblés dans les abaques de lecture conformément aux normes CA-SFM (Comité de l’Antibiogramme de la Société française de Microbiologie. [10] (Tableau II cf. page 52 et 53).
Il convient de noter toutefois, qu’une souche dont la sensibilité aux antibiotiques est ainsi évaluée peut être déclarée » sensible, intermédiaire ou résistante » après consultation des abaques de lecture.
Méthode (Tableau III cf. page 55)
Le tableau rassemble les caractéristiques utilisées pour le typage des bêta-lactamases.
Pour notre part, les pénicillinases chromosomiques et les pénicillinases plasmidiques n’ont pas été distinguées du fait de la non utilisation dans la pratique courante de l’antibiogramme de disque de Céfopérazone, antibiotique qui permet de les distinguer.
Toutefois, cela ne saurait constituer en ce qui nous concerne un désavantage puisque ces enzymes (pénicillinases chromosomiques et céphalosporinases inductibles), naturellement sécrétées par les germes étudiés [12], ne sont pas impliquées dans leur résistance acquise aux Bêta-lactamines.
Typage des Bêta-lactamases et détection de bêta-lactamase à spectre élargi (BLSE) chez les Entérobactéries
Les résultats du typage des bêta-lactamases et la détection des BLSE exprimés en pourcentage de souches sécrétant un type donné de bêta-lactamase et rassemblés dans le tableau XVII (cf. page 68) et la figure 9 (cf. page 69) font apparaître que :
– les souches de Escherichia coli sécrètent des pénicillinases de haut niveau 13,73 % soit 12 souches, 19 souches sécrétaient des pénicillinases résistant aux inhibiteurs soit 21,84 %, 01 souche sécrétait une cephalosporinase inductible. Particulièrement 05 souches sécrétaient une BLSE soit 5,75%
– 20 % des souches de Klebsiella sécrétaient des pénicillinases de haut niveau, 40 % de pénicillinases résistant aux inhibiteurs.
– Concernant les souches d’Enterobacter, elles sécrétaient de pénicillinases de haut niveau soit 12,50 % , de même 12,50 % de pénicillinases résistant aux inhibiteurs, particulièrement 01 souche d’Enterobacter cloacae sécrétait une BLSE.
– Aucune souche de Proteus mirabilis ne présentait de phénotypes de résistance.
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Table des matières
INTRODUCTION
PARTIE I : GÉNÉRALITÉS
I- DEFINITION DE L’INFECTION URINAIRE
II- ETIOLOGIES
III- PHYSIOPATHOLOGIE
IV- DIAGNOSTIC
V- TRAITEMENT
VI- MECANISMES MOLECULAIRES DE LA RESISTANCE BACTERIENNE VIS A VIS DES ANTIBIOTIQUES UTILISES DANS LE TRAITEMENT DES INFECTIONS URINAIRES A ENTEROBACTERIES
PARTIE II : MATERIEL ET METHODE
I- MATERIEL
II- METHODE
PARTIE III : RESULTATS
I- RESULTATS ANALYTIQUES
DISCUSSIONS
CONCLUSION
RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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