Soutenance mémoire
IDENTIFICATION DE LA NATURE DES SUCRES PRESENTS DANS LES DIFFERENTS ORGANES DU BLEUET
En se basant sur la littérature du bleuet nain, des sucres tels que le glucose, le fructose, le saccharose, le raffinose, le galactose, le xylose et le ribose ont été sélectionnés, car ils sont souvent retrouvés dans les tissus végétaux. Premièrement, des tests CCM (Chromatographie sur Couche Mince) ont été réalisés avec l’extrait de la plante et des sucres témoins afin de faire une première identification. Une quantité de poudre de tige de bleuet de 0.88 mg a été diluée dans 200 μL d’éthanol 95%, ce solvant a été choisi afin de solubiliser les sucres présents dans la tige, et pouvoir par la suite les identifier. 15 μL de cet extrait, a été déposé au bas de la plaque CCM (5 cm × 20 cm) sur une bande de 1 cm située à 1.5 cm du bord de la plaque. La plaque a ensuite été éluée dans un système de solvant CH2Cl2/CH3OH/H20 dans un rapport 50 :25 : 5 jusqu’à ce que le front de solvant soit à 2 cm du haut de la plaque CCM. La plaque a ensuite été révélée avec une solution de Naphtoresorcinol préparé en milieu acide puis chauffée à 100°C.
Pour l’identification des polyols, la plaque CCM a été migrée dans un mélange de solvant C4H10O/H2O/C2H4O2 dans un rapport 45 : 4.5 : 0.5. La plaque a été révélée avec une solution d’acide molybdate d’ammonium cérique (CAM). Les témoins de polyols choisis étaient le myo-inositol, le sorbitol, le xylitol et le mannitol. Ces premiers tests ont été effectués sur des échantillons mélangés de tiges provenant des échantillonnages effectués aux mois de septembre et de novembre 2017 (parcelles A, C et F). Les échantillons ont été extraits dans de l’éthanol à 95%.
L’extrait a été par la suite, injecté sur l’appareil LC-MS unité 1100 LC et instrument G1946 VL MS (Agilent Technologies) avec une source d’ionisation multimode ESI et APCI. La colonne utilisée pour les séparations analytiques est une Hypersil GOLD HILIC (250mm × 4.6mm). Les solvants qui ont été utilisés, sont de l’acétonitrile (solvant A) et de l’eau (solvant B). Au départ, l’éluant est composé de 10% de solvant B. Pendant 30 minutes, le pourcentage de B est augmenté à 55%. Le volume d’injection était de 10 μL, le débit de 1ml/min et la détection a été effectuée à l’aide d’un spectromètre de masse.
La méthode utilisée par la suite pour le dosage des sucres a servi pour différencier les isomères. Pour cela, les échantillons et les témoins ont été injectés sur l’appareil HPLC unité 1200 et instrument G1362A RID (Agilent Technologies) avec une pré colonne Shodex SC-LG (50 × 6mm 10μm) et une colonne Shodex SC 1011 sugar series (300 × 8mm 6μm). Cette analyse a une durée de 20 minutes en isocratique 100% H20, la température de la colonne est à 80°C et celle du RID est de 35°C. Pour cette méthode, les échantillons ont été extraits avec 20% EtOH puis l’alcool a été évaporé, à l’aide d’une chambre à vide, pour qu’il ne reste que de l’eau. Par la suite, les échantillons ont subi une extraction sur phase solide (SPE), plus particulièrement sur résine CH, non polaire, dense en électron et très sélective et N+ Quaterny amino, qui a permis d’extraire les anions forts. Une fois injecté sur HPLC-RID, les sucres et les polyols ont été identifiés avec leurs temps de rétention (voir Annexe 1). Cette méthode et celle sur LC-MS ont permis l’identification d’un sucre important pour la résistance au froid, soit le stachyose.
ANALYSE DE LA COMPOSITION EN SUCRE DANS LES TIGES ET LES BOURGEONS DU BLEUET
Pour cette partie, une vingtaine de tiges échantillonnées dans chaque parcelle et à chaque date d’échantillonnage ont été regroupées afin d’obtenir suffisamment de matériel pour l’extraction des sucres solubles et le dosage de l’amidon. Une fois récolté, les échantillons ont été plongés dans l’azote liquide, puis placés dans un lyophilisateur pendant une semaine pour une dessiccation à froid. Une fois les plants bien secs, les bourgeons floraux ou végétaux ont été séparés de la tige, pour ensuite être broyés à l’aide d’un broyeur à billes (broyeur vibrant MM 200, Retsch).
L’étape de l’extraction des sucres solubles a été séparée en deux parties : la solubilisation des glucides à l’éthanol et la filtration de l’échantillon à l’eau. Après plusieurs tests de solubilités, il a été conclu que l’éthanol à 20% était le solvant qui permettait de solubiliser le plus de sucres. Pour l’extraction, 10 mg de poudre d’échantillon de bourgeons floraux, de bourgeons végétatifs ou de tiges, ont donc été placés dans une éprouvette de 15 ml et mélangés avec 5 ml d’éthanol 20% et 100 μL d’une solution à 1% de sorbitol représentant un étalon interne. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10 minutes, et seul les surnageants ont été récupérés. Ces étapes ont été répétées trois fois en tout, mais l’étalon interne n’a été ajouté que lors de la première extraction. Le mélange des surnageants a été évaporé pour enlever l’alcool. Ensuite, les échantillons ont été passés à travers une résine échangeuse d’ions : CH et N+ Quaternary amino, afin de séparer les sucres et les polyols des composés indésirables, tels que les résines, les pigments ou encore les flavonoïdes. La solution filtrée a été évaporée, puis, purifiée de nouveau à l’aide d’un filtre à seringue en nylon (taille des pores 0,45 μm) et injectée au HPLC-RID (Agilent 1200 series) sur une colonne Shodex SC 1011 sugar series (Rossi et al. 2007). La concentration en sucre des échantillons est ensuite déterminée à l’aide de courbes standards effectuées pour chacun des sucres identifiés en amont, c’est-à-dire le saccharose, le glucose, le fructose, le raffinose et le stachyose, (Beaulieu 2011).
ANALYSE DE LA COMPOSITION EN AMIDON
Le culot récupéré suite à l’analyse des sucres, a été utilisé pour mesurer la concentration en amidon (Bellasio et al. 2014). Un ajout de l’enzyme α-amylase (Megazyme – 3000 U/L), a permis de décomposer l’amidon en oligosaccharides et en dextrines. Cette amylase accélère la digestion de la deuxième enzyme, l’amyloglucosidase (Megazyme – 3260 U/L). Dans un premier temps, la solution α-amylase – buffer (composé de 850 ml d’eau distillée, de 5.8 ml d’acide acétique glacial, du NaOH 1M, 0.74 g de CaCl2 déshydraté) a été mélangée et incubée 12 minutes à 90- 100°C. Puis, un volume de 0.15 ml de la deuxième enzyme, l’amyloglucosidase, a été ajouté et les échantillons ont été incubés pendant 45 minutes à 50°C. Le volume des tubes a été par la suite ajusté à 10 ml avec de l’eau distillée et après avoir été centrifugé pendant 6 minutes, le surnageant est récupéré pour ensuite effectuer l’analyse.
Par la suite 2 ml de la solution Reagent 3 (réalisé à partir de 100 ml d’eau distillée, 1 capsule de peroxydase (PGO) et 1.6 mL de ortho-dianisidine) ont été ajoutés dans chacun des tubes. La péroxydase (PGO) a permis d’oxyder le glucose en acide gluconique avec une production quantitative de peroxyde d’hydrogène qui a oxydé à son tour le colorant (ortho-dianisidine).
Après avoir reposé pendant 45 minutes dans le noir, 400 μL de H2SO4 à 75% ont été ajoutés, en effet l’amidon est hydrolysé en condition acide. Afin que la coloration apparaisse, il est important de laisser reposer dans le noir pendant 20 minutes les échantillons. L’absorbance a été mesurée à 530 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
ANALYSES STATISTIQUES
Afin de pouvoir interpréter les résultats obtenus, différentes analyses statistiques ont été effectuées. Dans un premier temps, une analyse en composante principale (Principal Component Analysis, PCA), a permis d’explorer les liens entre les différents types de sucres. Cette analyse a été effectuée avec le logiciel Primer 6. Seules, les trois premières composantes (PC1 à PC3) qui expliquaient la majorité de la variabilité dans les résultats ont été retenues.
Par la suite, des modèles mixtes ont été utilisés pour caractériser les différences entre les organes et les années, dans la concentration en sucre et en amidon (Proc Mixed, SAS). Un modèle par type de sucre a été utilisé. Le type d’organe (tige, bourgeons floraux et bourgeons végétatifs) et l’année ont été considérées comme des variables fixes alors que les parcelles et la date de récolte ont été considérés comme des variables aléatoires. La normalité de la distribution des données a été vérifiée à l’aide de la procédure Univariate (SAS). De plus, la distribution des résidus des modèles mixtes a été vérifiée à l’aide de l’option VCIR (Proc Mixed, SAS). Les différences entre les traitements et la température ont été générées grâce à l’option LSMEANS (Proc Mixed, SAS) utilisant les tests de comparaisons multiples de Bonferroni.
Enfin, des modèles régressifs ont été réalisés, afin de lier la LT50 avec la concentration des différents sucres, ainsi que la hauteur de neige au sol avec les températures minimales, maximales et moyennes (Proc Mixed, SAS). Dans un premier temps, la colinéarité (ou corrélations) entre les variables de sucres a été vérifiée à l’aide de l’option VIF (Variation Inflection Factor) de la procédure de régression (Proc Reg, SAS). Étant donné qu’aucune variable représentant les sucres (incluant l’amidon), ne montrait un facteur d’inflation supérieure à 10, toutes ces variables ont été testées dans les modèles régressifs successifs. En revanche, la colinéarité des températures minimums, maximums et moyennes ayant des facteurs d’inflation > 10, seule la température minimum a été retenue. En effet, cette dernière a été retenue car c’est la température qui risque d’infliger le plus de dommage aux plants de bleuets (limite minimum du gel). Deux modèles régressifs ont, par la suite, été réalisés en tenant compte des types de sucre : un premier incluant seulement l’amidon et le glucose, et un second incluant tous les types de sucre, excluant l’amidon. Dans les deux cas, la température minimum moyenne des 5 jours précédents, la date d’échantillonnage et la hauteur moyenne de la neige étaient aussi insérées dans le modèle régressif. Les modèles ont ensuite été réduits en enlevant les variables non-significatives (P > 0.05), en débutant par les interactions entre les sucres et les années. Les modèles finaux étaient donc constitués des variables de sucres et climatiques expliquant, de plus, la variabilité du LT50 (P<0.05). Dans les modèles, les variables aléatoires étaient constituées de la date d’échantillonnage (i.e. le jour julien, JJ), de la parcelle et de l’année selon le schéma suivant : JJ (année), parcelle (année*JJ). La distribution des résidus des modèles mixtes a été vérifiée à l’aide de l’option VCIR (Proc Mixed, SAS) et à l’aide de graphique.
RESULTATS
ACCLIMATATION AU FROID AU COURS DE L’HIVER
Durant la première année d’analyse (s’échelonnant de septembre 2017 à mai 2018), le LT50 des tiges a diminué avec les températures de l’air (Figure 7). En effet, de septembre à décembre, la résistance au froid est passée de – 15°C à – 40°C, avec des températures de l’air qui ont chutées de 20°C à – 10°C. Par la suite, les valeurs du LT50 sont restés stables à environ – 40°C de décembre à mars : pendant cette période d’acclimatation au froid, les températures de l’air ont varié entre – 10°C et – 20°C. La température d’acclimatation la plus froide au cours de l’hiver 2017-2018, a été observée au mois de février avec un LT50 avoisinant le – 45°C. Durant cette période, les températures moyennes de l’air oscillaient autour de – 20°C avec un niveau de neige de 120 cm. Malgré une hausse des températures au printemps 2018 avec des valeurs oscillant autour du zéro, le niveau d’acclimatation des plants n’a pas beaucoup varié comparativement aux valeurs observées en février-mars 2018. En effet, des valeurs de LT50 autour de -30°C ont été observées au mois d’avril et mai, et ce, même après la disparation du couvert de neige au sol à la fin du mois d’avril 2018.
Tout comme en 2017-2018, les valeurs calculées de LT50 pour l’année 2018-2019 ont diminué de septembre à décembre, pour ensuite remonter de janvier à avril (Figure 7). En effet, les valeurs de LT50 ont chuté de – 25°C à – 65°C de septembre à décembre lorsque les températures moyennes de l’air passaient d’environ de 20°C à – 10°C. La température d’acclimatation la plus froide au cours de l’hiver 2018-2019 (LT50 de – 65°C) a été observée en décembre 2018 lorsque les températures de l’air approchaient les – 10°C, mais avec un niveau de neige de seulement 20 cm. Par la suite, les valeurs de LT50 ont graduellement augmenté, de -50 à -30 °C environ, de janvier à avril. Cependant, lors de l’échantillonnage effectué le 30 avril 2019, la résistance au froid a ré-augmenté avec un LT50 de – 40°C : à cette période, seule des traces de neige étaient observées au sol avec des températures de l’air oscillant autour – 5°C. À la mi-mai, une valeur de LT50 de – 5°C a été calculée lorsque les températures de l’air approchaient les 10°C.
RELATION ENTRE LES DIFFERENTS TYPES DE GLUCIDES NON-STRUCTURAUX
Une analyse en composante principale a été effectuée afin de comprendre la variation des différents types de glucides non-structuraux, incluant les sucres et l’amidon au cours des hivers 2017-2018 et 2018-2019. Les axes 1 et 2 contribuaient respectivement à 40.2% et 32.4% de l’explication de variance, tandis que l’axe 3 contribuait à seulement 14.5% de la variabilité des données (Figure 11). Cette analyse a permis de décortiquer les regroupements entre les différents types de glucides non-structuraux.
Les regroupements observés, en comparant les axes principaux 1 et 2 (Figure 11), montrent que les concentrations de glucose et d’amidon varient de façon inversement proportionnelle aux concentrations de fructose, saccharose, stachyose et raffinose. En effet, une nette séparation de ces groupes de sucres a été observée sur l’axe 1, qui compte pour près de 41% de la variabilité observée. Par la suite, une nette séparation a été observée entre l’amidon et le glucose ainsi que deux autres regroupements entre le fructose – saccharose et le stachyose – raffinose. L’amidon et le glucose ne sont pas corrélés et ont une variation inverse et différentes des autres sucres. L’axe 3, contribuant à seulement 14.5% de l’explication de la variation des sucres, sépare le glucose et le fructose des autres sucres. Les axes 2 et 3 montrent que la variation de l’amidon et du saccharose est similaire, comme celle du raffinose et du stachyose.
VARIATION DES SUCRES ET DE L’AMIDON, DE L’AUTOMNE AU PRINTEMPS
Pendant les deux années d’analyses (s’échelonnant de septembre à mai) et dans les trois organes étudiés, la concentration générale des différents sucres augmente au cours de l’hiver, puis diminue au mois d’avril, lorsque les plants se désacclimatent. Cependant, cette augmentation de la concentration des sucres a été plus marquée lors de l’hiver 2017-2018 (Figure 12). En effet, au cours de l’hiver 2018-2019, la variation des concentrations en sucre entre les organes ne suit pas la même tendance. L’effet organe × année est significatif pour tous les sucres : pas pour le fructose, le stachyose et l’amidon, ce qui confirme que la variation des sucres solubles est différente d’une année à l’autre, avec des tendances qui divergent (Tableau 3).
Lors de la période s’échelonnant de septembre à mai 2017-2018, la concentration en glucose et en fructose a été supérieure dans les bourgeons végétatifs pour le mois de septembre (Figure 12). Pour le glucose, elle est passée de 60 mg.gdw-1 à 40 mg.gdw-1 de septembre à novembre, puis la concentration est restée autour des 40 mg.gdw-1 de novembre à mars. Pour les bourgeons floraux et les tiges, la concentration de glucose a fortement augmenté en passant de 20 mg.gdw-1 en septembre à 60 mg.gdw-1 en novembre, la concentration en glucose dans ces deux organes a rejoint celle des bourgeons végétatifs en restant autour de 40 mg.gdw-1 du mois de décembre au mois de mars. La concentration de glucose dans les trois organes a ensuite diminué au mois d’avril à environ 10 mg.gdw-1 puis a légèrement augmenté jusqu’à 20 mg.gdw-1 au mois de mai. En revanche, aucune différence significative n’a été trouvée entre les différents organes (P>0.05, Tableau 3)
La concentration de fructose dans les bourgeons végétatifs est restée constante, avec des valeur autour de 40 mg.gdw-1 du mois de septembre 2017 au mois de mars 2018. La concentration dans les bourgeons floraux et les tiges a augmenté de septembre à novembre, puis a varié comme celle des bourgeons végétatifs avec des valeurs autour de 40 mg.gdw-1. Par la suite la concentration a diminuée pour les trois organes à 35 mg.gdw-1 d’avril à mai (Figure 12). Cependant, une différence significative a été trouvée entre les différents organes (P< 0.001, tableau 3), avec des valeurs significativement plus élevées chez les bourgeons floraux comparativement aux tiges et au bourgeons végétatifs (Figure 12).
Comme pour le glucose et le fructose, la teneur en saccharose était supérieure dans les bourgeons végétatifs pour le mois de septembre 2017, puis elle a diminué dans tous les organes au mois de novembre 2017, puis a augmenté jusqu’à 30 mg.gdw-1 de décembre 2017 à avril 2018 (Figure 12). Au mois de mai 2018, la concentration de saccharose dans les différents organes a atteint une valeur minimum de 20 mg.gdw-1. La variation générale de ce sucre est inverse à la variation du glucose et du fructose. En effet, la concentration en glucose et en fructose a atteint son maximum en novembre 2017. Parallèlement la teneur en saccharose est à son minium en novembre 2017. Le modèle mixte a démontré une différence significative au niveau de l’année, des organes et de l’année × organe (Tableau 3). En effet, la concentration en saccharose est significativement plus élevée dans les bourgeons floraux comparativement aux bourgeons végétatifs (P<0.001) et les tiges (P<0.0006) qui ont des concentrations similaires (P>0.05, Tableau 3).
Les variations en raffinose et en stachyose ont été très similaires, bien que le stachyose ait été présent en plus faible quantité que le raffinose (Figure 12). En effet, les bourgeons floraux, ne contenaient pas de stachyose au mois de septembre et novembre 2017 et au mois de mai 2018. Leurs concentrations ont atteints leur maximum au mois de décembre 2017 et de janvier 2018 avec une concentration de 20 mg.gdw-1 et 15 mg.gdw- 1 pour, respectivement, le raffinose et le stachyose. Tous comme le fructose et le saccharose, les bourgeons floraux contenaient significativement plus de raffinose et de stachyose que les autres organes analysés (Tableau 3, Figure 12)
Lors de l’hiver 2018-2019, la variation dans les concentrations de glucose et de fructose ont été beaucoup plus variables entre les organes comparativement à 2017-2018. Pour le glucose, la concentration a augmenté de septembre à mars fluctuant autour de 40 mg.gdw-1 et diminuant par la suite de mars à avril pour atteindre une concentration de 10 mg.gdw- 1. Puis, au mois de mai 2019, la concentration a ré-augmentée légèrement jusqu’à 20 mg.gdw-1. La concentration de fructose augmente de 30 mg.gdw- 1 à 50 mg.gdw- 1 de septembre à novembre, puis diminue jusqu’à 20 mg.gdw- 1 pour le mois de janvier. Elle augmente au mois de février vers 40 mg.gdw- 1, diminue encore jusqu’au mois d’avril puis augmente à la mi-mai vers 25 mg.gdw- 1. La concentration en fructose au cours de cette deuxième année d’étude varie de façon irrégulière, elle n’a pas la même tendance que les autres sucres, c’est-à-dire, augmenter de l’automne à l’hiver puis de diminuer lorsque le printemps arrive.
La concentration de saccharose de l’année 2018-2019 est différente de la première année d’étude. Elle augmente légèrement au mois de novembre jusqu’à 20 mg.gdw- 1, puis diminue au mois de mars et atteint son minimum à la fin avril où la concentration était à 5 mg.gdw- 1 et a ré-augmentée légèrement à la mi-mai pour atteindre les 15 mg.gdw- 1. Le raffinose et le stachyose sont présents en faible quantité pour la deuxième année de l’étude et le stachyose est toujours présent en plus faible quantité. La concentration du raffinose augmente du mois d’octobre jusqu’au mois de février avec des légères variations entre 15 et 20 mg.gdw- 1 puis elle diminue à partir du mois de mars et devient nulle. La concentration de stachyose a approché les 10 mg.gdw- 1, mise à part pour les bourgeons végétatifs pour le mois d’avril, elle a augmenté jusqu’à 15 mg.gdw- 1. Puis comme le raffinose, sa concentration devient nulle à la mi-mai.
Pour le fructose, le saccharose et le raffinose, l’effet organe est significatif : les bourgeons floraux contiennent plus de ces sucres que les autres organes (Tableau 3). En effet, la variation de ces trois sucres est similaire dans les tiges et dans les bourgeons végétatifs, mais elle est très différente dans les bourgeons floraux. L’effet année est significatif pour le fructose, le saccharose, le raffinose et le stachyose. En effet, les températures et le niveau de neige sont différents d’une année à l’autre, ce qui induit inévitablement une variation différente de ces sucres.
La variation de l’amidon des deux années étudiées (s’échelonnant de septembre à mai 2017-2018 et 2018-2019) est très similaire. En effet, l’année n’est pas significative dans le modèle (P>0.05, Tableau 3). Pour les deux années d’études, la concentration d’amidon diminue et devient nulle lorsque les plantes sont acclimatées (Figure 13). Au mois de septembre et de novembre, la tige est fortement concentrée en amidon. Pendant la période de décembre à mars, au même moment où elles ont atteint leur résistance maximale au froid (Figure 7), les réserves sont dégradées et les plantes ne contiennent plus que des sucres solubles (Figure 12). Le facteur organe n’étant pas significatif (P < 0.05, Tableau 3) confirmant que la variation d’amidon entre les organes est très similaire. En effet, les tiges contenaient pour le mois de septembre lors de la première année 40 mg.gdw- 1 et pour la deuxième année 25 mg.gdw- 1 d’amidon. Au mois de novembre, la concentration diminue à 10 mg.gdw- 1 pour la première année et à 20 mg.gdw- 1 pour la deuxième année. Par la suite, la concentration en amidon est nulle pendant tout l’hiver. À la mi-mai, la concentration en amidon augmente dans les tiges, alors qu’elle est restée presque nulle pour les deux types de bourgeons au printemps.
MODELES REGRESSIFS DE PREDICTION DU LT50
Deux modèles prédictifs ont été retenus pour expliquer les variations du LT50 en fonction de différentes variables de sucres et climatiques (Tableau 4, Figures 14 et 15). Les différents modèles ont été sélectionnées en fonction des probabilités obtenues par les différentes variables explicatives (P < 0.05) et les statistiques d’ajustements (Tableau 4). Pour cette raison, toutes les autres combinaisons de variables testées n’ont pas été retenues. Selon les statistiques d’ajustement des deux modèles, le modèle 1 est légèrement plus robuste que le modèle 2 étant donné des valeurs plus basses de AIC, AICC et BIC.
Le premier modèle obtenu (modèle 1) met en relation le LT50 avec le raffinose, la température minimum et l’année (Tableau 4, Figure 14). Les valeurs de LT50 diminuent significativement en fonction de la température minimum moyenne des 5 jours précédant le test de résistance au froid (P < 0.05) et en fonction d’une augmentation de la concentration en raffinose (P < 0.01). Ce sont ces deux facteurs qui expliquent le plus la variation des LT50 : Plus la concentration de raffinose augmente, plus la prédiction du LT50 est faible ; Plus la température minimale est basse, plus la prédiction du LT50 est basse, la résistance de la plante est donc élevée. Pour le raffinose comme pour la température minimale, les valeurs de la première année s’approchent le plus des valeurs prédites. Cependant, un effet de l’année est aussi présent (P < 0.001), créant deux relations bien distinctes pour chacune des années (Figure 14). Même si les deux droites de régression des années ne sont pas parallèles, les effets combinés raffinose × année et température minimum × année n’étaient pas significatifs (P > 0.05) et n’ont pas été retenus dans ce modèle.
Le deuxième modèle obtenu (modèle 2) met en relation le LT50 avec le glucose, l’amidon et l’année (Tableau 4, Figure 15). Les valeurs de LT50 diminuent significativement en fonction d’une augmentation de la concentration en glucose (P < 0.05) et en fonction d’une diminution de la concentration en amidon (P < 0.0001). Donc, plus la concentration en l’amidon est faible, plus la prédiction du LT50 sera faible, c’est-à-dire que les plantes sont fortement résistantes au froid. Inversement, plus la concentration du glucose est élevée, plus la plante sera résistante au froid. Comme dans le cas du modèle 1, un effet significatif de l’année est aussi présent (P < 0.01), créant deux relations bien distinctes pour chacune des années (Figure 14). Même si aucun effet combiné de l’année était significatif, les deux droites de régression formées chacune des années sont parallèles, alors qu’elles se croisent dans le cas du glucose. Pour la prédiction du LT50 en fonction de la concentration d’amidon, les valeurs des deux années étudiées sont proches des valeurs prédites. En revanche, sur le graphique qui met en relation la prédiction du LT50 avec la concentration de glucose, ce sont les valeurs de la deuxième année qui sont le plus proche des valeurs prédites. En 2017-2018, les valeurs ne suivent pas la courbe de prédiction.
DISCUSSION
CONDITIONS ENVIRONNEMENTALES ET RESISTANCE AU FROID
L’indice d’acclimatation au froid des plants de bleuet, nommé LT50, a bien suivi les patrons de diminution et d’augmentation de la température, soit de façon visuelle (voir figure 7 par exemple) ou inséré dans un modèle statistique (voir figure 15 par exemple). En revanche, des différences ont été observées entre les années d’étude. Les températures mesurées pendant l’hiver 2017-2018 ont été plus froides que celles de l’hiver 2018-2019, avec des températures minimums qui sont descendues jusqu’à – 35°C, alors qu’elles étaient de – 25°C pour l’année 2018-2019. Malgré des températures moins froides, les plants ont été plus résistants lors de la deuxième année d’étude, étant donné les valeurs de LT50 plus négatives, d’environ une dizaine de degré. En revanche, le niveau de neige au sol a été beaucoup plus important en 2017-2018, avec 140 cm de décembre à mars comparativement à 70 cm pour la même période en 2018-2019. Cela pourrait donc expliquer les valeurs plus basse de LT50 calculées en 2018-2019, car la neige est connue pour jouer un rôle de couche isolante et elle protège les plants des températures extrêmes de l’air (Wildung et Sargent 1988). Il est important de rappeler que deux méthodologies différentes ont été employées pour déterminer la résistance au gel au cours des deux années de suivi, l’effet année a donc aussi pu être influencé par ce paramètre.
En effet, plusieurs auteurs ont observé que la survie et la productivité des plants de bleuets du Minnesota étaient positivement liées aux hauteurs de neige en hiver (Wildung et Sargent 1988; Takeda et Phillips 2011). De plus, des hauteurs de neiges différentes mènent à des différences significatives dans la résistance au froid chez des arbustes alpins (Palacio et al. 2015). En effet, ces auteurs ont observé que les plantes récoltées dans des zones où la neige est peu profonde étaient plus endurcies sur le plan physiologique que des plantes récoltées dans des zones où la couverture de neige est plus épaisse, comme indiqué par les concentrations de sucres qui étaient plus élevées dans le premier cas (Palacio et al. 2015). D’ailleurs, ces résultats confirment ce qui a été obtenu au cours de notre étude sur le bleuet.
Les résultats de cette étude montrent que les LT50 peuvent atteindre des valeurs négatives jusqu’à – 60°C lorsque les températures de l’air descendent sous la barre des -30°C. Des études effectuées sur l’espèce Vaccinium corymbosum L. (Bleuet en corymbe) (FNA Ed. Comm 2009) en Corée au cours de l’année 2012-2013 ont montré que les valeurs de LT50 peuvent descendre jusqu’à -35°C voir – 40°C lorsque les températures extérieurs atteignent leur minimum, c’est-à-dire vers les -35°C (Lee et al. 2012; Lee 2013). Malgré des températures de l’air assez similaires entre notre étude et celle de Lee et al. (2012, 2013), les bleuets sauvages nains du Saguenay-Lac-Saint-Jean sont beaucoup plus résistants que les bleuets en corymbe situés en Corée. D’autres études portant sur des espèces boréales ont démontré que l’épinette noire et l’épinette blanche étaient des espèces très résistantes, même plus résistantes que le pin gris. En effet, les valeurs de LT50 mesurées chez l’épinette noire et blanche étaient de -60°C au mois de décembre, alors que celle du pin gris étaient de -50°C (Man et al. 2015; Man et al. 2017). Tout de même, ces valeurs se rapprochent beaucoup plus de celles obtenues dans cette étude pour les bleuets nains sauvages. En revanche, les températures de l’air observées dans les études sur la résistance au froid chez les épinettes et les pins étaient beaucoup plus chaudes que celles mesurées au cours de cette étude. Par exemple, au mois de décembre, les températures dans les études de Mans et al. (2015,2017) étaient autour de 0°C alors que celles entre janvier à mars atteignaient les -10°C, ce qui est bien au-dessus des températures mesurées au Saguenay-Lac-Saint-Jean, qui variaient entre -20°C et -30°C.
Pour la première année d’étude (2017-2018), les plants n’étaient pas encore désacclimatés à la dernière date d’échantillonnage au printemps 2018. En effet, la LT50 était encore à des valeurs très négatives, – 30°C le 15 mai 2018 alors que pour la deuxième année d’étude, cette valeur était de l’ordre de – 5°C le 14 mai 2019. Le niveau de neige au sol pourrait aussi expliquer ces résultats divergents entre les deux années d’étude : lors du printemps 2019, les plants ont été exposés de façon plus précoce aux variations externes des températures de l’air, étant donné que le niveau de neige était inférieur à 10 cm à partir du 27 avril 2019. Les plants se sont donc désacclimatés plus rapidement que, lors de la première année où la couche de neige est passée de 60 cm en avril à un niveau quasiment nul au 1er mai 2018.
IDENTIFICATION ET REGROUPEMENT DES DIFFERENTS GLUCIDES PENDANT L’HIVER
Cinq sucres principaux ont été identifiés au cours de la période s’échelonnant de l’automne au printemps avec des concentrations qui augmentent au cours de l’hiver selon le degré de résistance au froid. En plus des sucres solubles, la concentration en amidon a aussi été mesurée. Les différentes concentrations mesurées au cours des deux années ont permis de comprendre les interrelations existant entre les types de sucre et l’amidon. Un premier groupement identifié est celui formé par la variation du glucose et de l’amidon. Deux autres regroupements de sucres ont aussi été identifiés dont celui formé par le fructose – saccharose et celui formé par le stachyose – raffinose.
Une nette séparation a été observée entre l’amidon et le glucose, ces deux variables contiennent tous les deux une information distincte et peuvent ainsi être utilisées pour modéliser la résistance au gel. L’amidon étant formé de plusieurs unités de glucose, leurs variations sont inverses, moins il y a d’amidon, plus il y a de glucose, surtout en l’absence de photosynthèse comme durant la période hivernale (Sulpice et al. 2009). Les plantes soumises à un stress abiotique tel que le froid, réagissent en mobilisant des réserves d’amidon pour fournir de l’énergie pour la croissance lorsque la photosynthèse est limitée, voire impossible, ces réserves d’amidon fournissent aussi des osmoprotecteurs et des solutés compatibles tel que le glucose (MacNeill et al. 2017).
Les résultats de l’analyse en composante principale, ont aussi démontré que la variation de la concentration du saccharose est similaire à celle du fructose. En effet, ces deux sucres sont produits de la même façon : la dégradation de l’amidon va produire du maltose, dans le cytosol, le maltose est converti en glucose, ce qui forme par la suite du fructose et du saccharose (Krasensky et Jonak 2012). De plus, ils ont un rôle important dans la période d’acclimatation au froid, car leur accumulation est adaptative. Plus les plantes sont soumises à des stress abiotiques comme le froid, plus la quantité de saccharose et de fructose augmente et vice versa (Guy et al. 1992). Pour sa part, le fructose, est un sucre qui a des capacités d’antioxydant car il répond au stress oxydatif qui est induit par le froid (Bogdanović et al. 2008). Le saccharose joue un rôle de cryoprotecteur étant donné qu’il est transporté vers les tissus non photosynthétiques afin d’y être métabolisé et d’assurer une protection complète à la plante (Hopkins 2003b).
Le dernier groupement est formé par le raffinose et le stachyose qui sont les oligosaccharides de la famille du raffinose (RFO) les plus connus et les plus fréquents chez les plantes. Ces oligosaccharides sont formés à l’aide du galactinol, qui lui-même est synthétisé à partir du polyol myo-inositol est de l’UDP-galactose. De plus, l’activité de la galactinol-synthase est accrue à basse température, ce qui justifie l’accumulation d’oligosaccharides pendant l’hiver (Sprenger et Keller 2000). Le raffinose et le stachyose sont connus pour ne pas être présents en très grande quantité dans les plantes. Ils interviennent lorsque la plante est soumise à un stress environnemental, comme le froid. C’est pour cette raison, que la concentration de ces deux sucres augmente au cours de l’hiver, de façon synchrone. Ces sucres sont ensuite consommés pour fournir l’énergie nécessaire à la plante pour continuer sa croissance, par exemple pour le développement de nouvelles fibres dans les tissus des fleurs (Tarpley et Sassenrath 2006).
VARIATION ENTRE LES DIFFERENTS ORGANES DANS LA CONCENTRATION EN SUCRES
De tous les organes, les bourgeons floraux sont plus concentrés en fructose, raffinose et stachyose, que les bourgeons végétatifs et les tiges, expliquant l’effet significatif de l’organe dans la majorité des tests de comparaison de la concentration en sucre. Pour leur part, les tiges contiennent beaucoup de tissus ligneux morts à maturité, ce qui pourrait expliquer une concentration plus faible en sucre par rapport aux bourgeons floraux (Deslauriers et al. 2014).
Cette différence de concentration peut s’expliquer par le fait que les bourgeons floraux sont les organes les plus protégés, car ce sont eux qui vont permettre la floraison et la production des fruits. Cela pourrait expliquer le fait que les bourgeons floraux contiennent plus de sucres comparativement aux bourgeons végétatifs. Les bourgeons ont un fonctionnement discontinu, lorsque les conditions environnementales deviennent néfastes pour la survie des tissus vivants, c’est-à-dire lorsque les températures chutent et la durée des journées raccourcies, ils entrent en dormance (Bilavcik et al. 2012). L’activité des bourgeons re- commence au printemps suivant, et c’est à ce moment que la concentration des sucres transportés dans les bourgeons floraux au cours de l’hiver, diminue, autrement dit ces sucres sont consommés. Pendant la floraison, la demande en glucide est permanente, de l’évocation florale jusqu’à la maturation des organes floraux et des fruits (Gourieroux et al. 2016). Les réserves glucidiques ont un rôle majeur lors de la floraison, influençant fortement le succès reproducteur et la croissance des fleurs chez les ligneux (Oliveira et Priestley 1988). Les sucres impliqués dans l’évocation florale et dans le développement de la fleur peuvent être des sucres solubles comme le saccharose ou des sucres insolubles comme l’amidon (Bernier et al. 1993).
VARIATION DE LA CONCENTRATION DES SUCRES PENDANT L’HIVER ET RELATION AVEC LE LT50
La concentration en raffinose et en stachyose a augmenté dans les tiges comme dans les bourgeons, au cours de l’hiver avec des concentrations significativement supérieures dans les bourgeons. Les concentrations de raffinose retrouvées dans les plants de bleuets étaient d’environ 15 mg.gdw-1, dans les tiges et elles ont atteint plus de 20 mg.gdw-1 à partir du mois de janvier dans les bourgeons. Pour le stachyose, les concentrations mesurées au cours de l’hiver étaient respectivement d’environ 10 mg.gdw-1 et 5 mg.gdw-1, pour les tiges et les bourgeons. Par conséquent, malgré leurs faibles concentrations relatives, le raffinose et le stachyose peuvent jouer un rôle décisif dans la tolérance au gel (Palonen 1999). Chez de nombreuses espèces de plantes, la quantité d’oligosaccharides accroit au cours du processus d’acclimatation au froid, ils s’accumulent en même temps, que la teneur en eau diminue dans les tissus végétaux (Zuther et al. 2004b). En effet, l’étude effectuée en Corée sur les bleuets en corymbe, confirme le fait que le raffinose et le stachyose soient présents en petite quantité (Lee et al. 2012): au cours de l’hiver, la concentration en raffinose a augmenté, elle est passée de 1 mg.gdw-1 en septembre à 4 mg.gdw-1 au mois de janvier, pour retomber aux alentours de 1 mg.gdw-1 au mois de mars. Pour le stachyose, la concentration était nulle au mois de septembre et octobre, comme dans les bourgeons floraux tel qu’observé, lors de notre première année d’étude (Lee et al. 2012).
Les oligosaccharides de la famille du raffinose (RFO) sont les carbohydrates les plus impliqués lors de l’exposition à un stress abiotique (Nishizawa-Yokoi et al. 2008; dos Santos et al. 2011). Ces sucres peuvent avoir une fonction particulière dans la résistance au froid car ils facilitent la vitrification, c’est-à-dire la formation de verre intracellulaire au lieu de la cristallisation. Ils empêchent alors le saccharose de cristalliser pendant le stress de déshydratation hivernale et préserver ainsi son effet cryoprotecteur (Charrier 2011b). En effet, s’il cristallise, les groupes hydroxyles du saccharose ne sont pas disponibles pour remplacer l’eau dans les groupes phospholipides de la membrane (ElSayed et al. 2014).
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Table des matières
Introduction
L’eau sous toute ses formes
Condition hivernale
Perturbations métaboliques
Le gel sur les plantes
Mécanismes mis en place pour résister au froid
Les sucres dans l’acclimatation au froid
La désacclimatation
Les problèmes dans les cultures
Objectifs et hypothèses de l’étude
Matériel et méthode
Méthode d’échantillonnage, année 1 (2017-2018)
Traitement au froid à l’aide de la méthode de fuite d’électrolyte
Méthode d’échantillonnage, année 2 (2018-2019)
Détermination de la température létale à 50% de fuite d’électrolytes (LT50)
Identification de la nature des sucres présents dans les différents organes du bleuets
Analyse de la composition en sucre dans les tiges et les bourgeons du bleuet
Analyse de la composition en amidon
Analyses statistiques
Résultats
Acclimatation au froid au cours de l’hiver
Identification des sucres
Relation entre les différents types de glucides non-structuraux
Variation des sucres et de l’amidon, de l’automne au printemps
Modèles régressifs de prédiction du LT50
Discussion
Conditions environnementales et résistance au froid
Identification et regroupement des différents glucides pendant l’hiver
Variation entre les différents organes dans la concentration en sucres
Variation de la concentration des sucres pendant l’hiver et relation avec le LT50
Variation de la concentration en amidon pendant l’hiver et relation avec le LT50
Conclusion
Références
