Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Bacilles à Gram négatif non fermentaires [1,7,9,10,11,13,14,15]
Appartenant à différentes familles, ces bactéries ne fermentent pas le glucose, d’où la notion de bacilles non fermentaires. Certaines sont mobiles polaires et d’autres sont immobiles. A la culture, certaines espèces donnent des colonies pigmentées en bleu ou en vert ou en jaune etc.
Habituellement aérobies stricts, ces pathogènes opportunistes, ayant pour habitat naturel l’environnement, sont répartis en 11 genres : Pseudomonas, Acinetobacter, Shewanella, Burkholderia, Ralstonia, Comamonas, Brevundimonas, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Chryseomonas, Flavimonas, Chryseobacterium, Flavobacterium, Weeksella, Alcaligenes, Sphingobacterium et Agrobacterium. Les isolats retrouvés en pathologie humaine appartiennent dans 75 % des cas, aux genres Pseudomonas et Acinetobacter. Quant à la production de carbapénèmases, elle est le fait essentiellement d’isolats appartenant aux genres ci-après :
Pseudomonas
Ici sont classées des bacilles oxydase (+), mobiles péritriches, nitrate réductase variable, appartenant aux espèces P. aeruginosa, P. stutzeri, P. fluorescens et P. putida.
P. aeruginosa est le type même des bactéries opportunistes pathogènes chez l’immunodéprimé. Les souches isolées dans ces situations produisent des toxines diverses (cytotoxine nécrosante, exotoxines protéiques).
Acinetobacter
L’espèce type est A. baumannii ; elle est présente chez l’homme sur la peau et dans l’environnement dans le sol et l’eau.
Stenotrophomonas maltophilia
Bactérie ubiquiste, elle vient juste après P. aeruginosa en termes de fréquence d’isolement chez les immunodéprimés en milieu hospitalier.
Structure chimique
Les molécules utilisées aujourd’hui dérivent de la Thiénamycine isolée en 1976 à partir de Streptomyces cattleya. Leur cycle de base contient un atome de carbone au lieu d’un souffre en position 1 et une liaison insaturée en C2-C3. La stabilité vis-à-vis des aux Bêtalactamases est due à la trans-orientation des atomes d’hydrogène en C5 et C6, mais aussi à la présence d’une chaîne hydroxyethyl en C6 au lieu de la chaîne acylamino des pénicillines et des céphalosporines [17]. Des modifications du substituant en position 2 confèrent un gain d’activité in vitro au Méropénème et au Doripénème sur les BGN.
Mécanisme d’action des carbapénèmes
Comme les autres bêtalactamines, les carbapénèmes exercent leur activité bactéricide en se liant préférentiellement aux Protéines de Liaison des Pénicillines (PLP) de type PLP1a, PLP1b et PLP2, Ils induisent ainsi une inhibition de l’étape de transpeptidation nécessaire à la synthèse du peptidoglycane, constituant principal de la paroi bactérienne [20].
Spectre d’activité [19,21]
Il couvre les bactéries à Gram négatif et à Gram positif incluant les bactéries aérobies et anaérobies.
Cependant, ils sont inactifs sur Stenotrophomonas maltophilia (par production naturelle d’une métallo-bêta-lactamase), Staphylococcus aureus méti-R et Enterococcus faecium.
Mécanismes de résistance des bactéries aux carbapénèmes [22]
Il s’agit de ceux développés par toute bactérie pour échapper à l’action d’une bêtalactamine, à savoir :
Modification des sites de liaison aux PLP ;
Réduction de la perméabilité membranaire ;
Efflux actif ;
Inactivation enzymatique
Le mécanisme qui nous intéresse ici et qui fait l’objet du chapitre 3 du Rappel bibliographique, est l’inactivation enzymatique des Carbapénèmes par des enzymes dites carbapénèmases. Elles sont produites essentiellement par les entérobactéries telles E. coli, K. pneumoniae, Proteus, Providencia, Salmonella et les BGN comme A. baumannii, Pseudomonas, Stenotrophomonas.
Carbapénèmases
Types de carbapénèmases
L’émergence de ces enzymes a entrainé des difficultés dans le traitement des BMR car les Carbapénèmes constituent les molécules les plus actives de l’arsenal thérapeutique contre la multirésistance bactérienne [16].
Les carbapénèmases sont codées par des gènes situés sur des éléments génétiques mobiles comme les plasmides, les transposons ; cela facilite leur diffusion à large échelle et rend leur maitrise plus complexe [29].
Différentes classifications ont été proposées dont celle d’Ambler dans laquelle l’ensemble des Bêtalactamases (y compris les Carbapénèmases) sont regroupées en quatre catégories ou classes:
Classe A
Ce sont des Pénicillinases de type sérine protéases ; elles sont inhibées par l’acide clavulanique et le tazobactam ;
Classe B
Elle renferme les Métalloenzymes ; leur site actif contient un ion zinc. Elles sont résistantes à l’acide clavulanique mais sont inhibées par l’Acide Ethylène Diamine Tétra acétique (EDTA) ;
Classe C
Ici sont regroupées les Céphalosporinases insensibles à l’acide clavulanique mais inhibées par la Cloxacilline ;
Classe D
Les Oxacillinases hydrolysant la Cloxacilline sont logées ici ; elles sont peu inhibées à l’acide clavulanique.
On retrouve les Carbapénèmases au sein des Classes A, B et D d’Ambler. Elles sont définies par leur capacité à hydrolyser au moins une Carbapénème et non pas par leur structure de base [31]. Les principales carbapénèmases produites par les BGN et ayant diffusées partout dans le Monde sont répertoriées dans le Tableau I.
Méthodes de détection des carbapénèmases
En pratique courante, c’est après avoir remarqué une réduction du diamètre d’inhibition autour d’un disque de carbapénème, que l’on se sert de différentes méthodes pour identifier éventuellement une production de carbapénèmases [16]. Ces méthodes sont soit phénotypiques, soit génotypiques.
Méthodes phénotypiques
Celles couramment utilisés sont : le test de Hodge modifié, le E-test et les tests biochimiques.
Test de Hodge [29,37]
Il a été mis initialement au point pour détecter les pénicillinases. La version modifiée est utilisée pour la détection des carbapénèmases ; mais il ne fournit pas d’information sur le type de carbapénèmase détecté.
Le principe repose sur l’inactivation d’un carbapénème par une bactérie productrice de carbapénèmase. La production de carbapénèmase est objectivée par une déformation de la zone d’inhibition autour d’un disque d’ertapénème (ERT) de la souche de référence E. coli ATCC 25922 le long des stries correspondant au temoin positif et à la souche test (ici K. pneumoniae produisant OXA-48). La zone d’inhibition de la souche de référence E. coli ATCC 25922 reste inchangée au contact de la strie correspondant au témoin négatif (Figure 3).
Méthode du E-test ou disques combinés
Ce test, encore appelée disque combiné, est basé sur la synergie entre les inhibiteurs de MBL comme l’EDTA et les carbapénèmes ; en effet, l’EDTA a la capacité de complexer le zinc et par conséquent d’inhiber l’action de la carbapénèmase.
Il permet la détection spécifique des souches productrices de Métalloenzymes (MBL). On peut le réaliser à l’aide de disques (test de synergie sur double disques ou test de disque combiné) ou de bandelettes (E-test MBL, Bio Mérieux).
D’autres types de bandelettes sont disponibles ; ils combinent le Méropénème et l’acide boronique dont l’effet inhibiteur est connu bien que son mécanisme d’action ne soit pas élucidé. Les enzymes détectées sont de type KPC ou d’autres de la Classe A [37].
Tests biochimiques
Un répond bien aux besoins actuels : c’est la recherche d’une modification du spectre d’action d’un carbapénème sous l’effet d’une carbapénèmase. Il s’agit d’une application de la technique de spectrométrie de masse dite Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – Time of Flight (MALDI-TOF).
Elle consiste à mettre en contact pendant 2-3 heures, la souche à tester avec une solution de carbapénème ; le pic correspondant au carbapénème testé disparait alors qu’apparait celui correspondant au(x) produit(s) d’hydrolyse de ce même carbapénème [38].
Méthode du milieu gélosé avec inhibiteurs
Elle permet une détection simple et rapide des EPC, notamment dans le cadre de prélèvements de dépistage [39]. Leur spécificité et leur sensibilité ne sont pas excellentes.
Les milieux de culture comme le ChromID ESBL® (Bio Mérieux), contenant une céphalosporine de 3ème génération (C3G), mis au point pour détecter les bactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu (BLSE), peuvent se révéler utiles pour détecter les carbapénèmases de classe A et B ; mais en aucun cas les carbapénèmases de classe D dont la sensibilité aux C3G est conservée (sauf en cas d’association à une BLSE ou à une céphalosporinase).
D’autres milieux contenant des carbapénèmes ont été commercialisés : Chromagar KPC® [35].
Méthodes génotypiques ou moléculaires
Seuls les tests recourant à la Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) suivie du séquençage et/ou de l’hybridation sur puces à ADN permettent, à l’heure actuelle, de caractériser de façon précise, les carbapénèmases.
Elles sont réalisées en routine dans les Laboratoires cliniques spécialisés ou non, afin de pallier les insuffisances de la détection phénotypique. Les kits commerciaux disponibles sont par exemple : GeneXpert Carba-R, Cepheid, Check-Direct, Check-points.
Signalons que les carbapénèmases de classe D ne sont pas détectées par les méthodes phénotypiques ; donc, tout résultat négatif pour les enzymes des classes A ou B doit être exploré par les méthodes génotypiques [41].
Matériel – Méthodes de l’étude
Il s’agit des échantillons de l’environnement, des souches bactériennes isolées à partir de ces échantillons et du matériel d’utilisation courante dans les laboratoires hospitaliers de Bactériologie. Les méthodes de travail ont varié selon les étapes du travail.
Méthodes de l’étude
Collecte et culture des échantillons de l’environnement
la méthode d’écouvillonnage : Un écouvillon stérile est préalablement humidifié avec de l’eau physiologique stérile puis frotté sur une surface en stries parallèles et rapprochées.
Ont été aussi prélevés tous les solutés trouvés sur place, les médicaments et les aliments (exemple : lait en poudre) en cours d’utilisation.
Prélèvement microbiologique de l’air : des boites de Pétri (MH et EMB) sont ouvertes à température ambiante au niveau des différentes zones concernées, puis refermées 1H après.
Les échantillons ont été transportés au laboratoire, un bouillon nutritif (BCC) a été ajouté dans les écouvillons, solutés et aliments, puis incubé à 37°C pendant 24h.
A partir des bouillons troubles, nous avons ensemencé à l’aide d’une anse de platine une gélose MH et une gélose EMB qui ont été incubées à 37°C pendant 24H à l’étuve.
Identification des isolats – Antibiogramme standard
Technique d’Identification :
L’identification des souches de bacilles à Gram négatif a été réalisée selon les critères classiques d’identification : caractères macroscopiques, microscopiques, culturaux et biochimiques.
Pour les BGN non fermentaires, seules les souches de Pseudomonas aeruginosa ont pu être identifiées.
Test de sensibilité aux antibiotiques :
Nous avons pratiqué la technique de diffusion de l’antibiotique en gélose ou Antibiogramme standard. L’inoculum bactérien est préparé en eau physiologique stérile puis diluer au 1/10ème et ajusté à 0,5 Mac Farland selon les recommandations du Comité d’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM 2012). Il est ensemencé à la surface de la gélose Mueller-Hinton (MH) coulée en boîte de Petri de 90mm de diamètre. Après séchage, les disques des antibiotiques choisis sont déposés à l’aide d’un distributeur. Les boîtes sont incubées à +37°C, en atmosphère aérobie, pendant 24H.
Critères d’inclusion des isolats pour la détection des carbapénèmases
Vingt-neuf (29) souches bactériennes isolées et identifiées ont été choisies pour la réalisation du Test de Hodge modifié afin de savoir si elles produisaient oui ou non une carbapénèmase. Les critères de ce choix étaient, d’après les données de l’ABG standard :
Une diminution du diamètre d’inhibition autour du disque d’ERT : diamètre inférieur à 25mm ;
Sensibilité « intermédiaire » à l’IMP et/ou à l’ERT ;
Résistance à l’IMP et/ou à l’ERT.
Critères de non inclusion
Un diamètre d’inhibition autour du disque d’ERT supérieur à 25mm ;
Une Sensibilité à l’IMP et/ou à l’ERT ;
Détection des carbapénèmases : Test de Hodge modifié
Nous avons préparé un inoculum à partir de la souche d’E. coli ATCC 25922 ; il a été dilué au 1/10ème afin d’obtenir une Densité Optique (DO) égale à 0.5 Mc Farland. Puis, à l’aide d’un écouvillon, l’inoculum a été ensemencé sur une gélose MH coulée en boîte de Pétri de 90mm. Ensuite, un disque d’ERT chargé à 10 μg était déposé au centre de la gélose. Les souches à tester étaient ensemencées chacune de manière radiale à partir du disque d’ERT jusqu’au bord de la boîte de Pétri. Deux souches témoins par rapport à la production de carbapénèmase (Témoin négatif et Témoin positif) ont aussi été ensemencées de manière radiale sur la même boite pour faciliter l’interprétation.
Après 18-24H d’incubation à +37°C, la présence d’une distorsion de la zone d’inhibition autour du disque d’Ertapénème au contact de la souche testée est interprétée comme un résultat positif.
Ce test détecte simplement la production de carbapénèmases, sans possibilité d’en identifier formellement le type.
Souches productrices de carbapénèmase
Profils des 2 isolats producteurs de carbapénèmase
Seule deux isolats (6,89%) sur les 29 testés produisaient une carbapénèmase. Toutes deux appartenaient au groupe des BGN non fermentaires ; il s’agissait d’une souche de P. aeruginosa et une souche de BGN non fermentaire qui n’a pu être complètement identifiée.
Elles provenaient d’échantillons de l’environnement, respectivement les surfaces des couveuses (P. aeruginosa) et l’eau utilisée pour tremper certains matériels de soins (BGN non fermentaire).
Profil de sensibilité des 2 isolats producteurs de carbapénèmase
Les données de l’ABG standard étaient relativement homogènes pour les deux souches productrices de carbapénèmase. Elles étaient les seuls isolats ayant montré une résistance de contact vis-à-vis du disque d’Ertapénème ; en sus, le BGN non fermentaire résistait à l’Imipénème.
P. aeruginosa
Il était sensible à l’Imipenème et à l’Amikacine ; il n’était pas inhibé par : AMX, AMC, TIC, TCC, PIP, CF, CFX, CTX, CAZ, ATM, NA, NOR, CIP, TM, GM, C, TE, SSS et SXT.
BGN non fermentaire
Cet isolat n’était sensible qu’à l’Amikacine ; il n’était inhibé par aucun autre antibiotique testé.
Commentaires – Discussion
Dans notre étude, nous avons trouvé une prévalence globale de près de 49, 36% de détection de BMR dans l’environnement. Les souches BMR isolées au cours de notre étude, sont issues majoritairement du service de réanimation pédiatrique avec un pourcentage de 61,29%. En effet, les patients hospitalisés au sein des unités de soins intensifs présentent plus de risques, vu la durée d’hospitalisation (qui est généralement longue), la sévérité de la maladie, l’usage d’un certain nombre de dispositifs invasifs (sondes, cathéters, intubation…), et les traitements antibiotiques multiples notamment avec les céphalosporines à large spectre [42, 43].
Sur les 39 BMR isolées, 28 étaient des entérobactéries, ce qui correspond à une prévalence de 71,80%. Klebsiella pneumoniae est le principal BMR retrouvé dans notre étude avec une prévalence de 38,46%, suivi d’Enterobacter spp avec une prévalence de 30,16 %.
Face à l’apparition de nouvelles résistances aux antibiotiques chez les BGN, l’évaluation de la sensibilité vis à vis de ces antibiotiques est devenue indispensable. Comme annoncé dans la littérature, l’Imipénème, active dans 90% des BMR, reste l’antibiotique de choix dans le traitement des infections hospitalières. Elle était active sur plus de 90% de nos souches [43].
Il est à noter que l’augmentation du nombre d’Entérobactéries productrices de BLSE a entraîné l’utilisation abusive des carbapénèmes dans de nombreux pays, avec pour conséquence l’émergence de la résistance à ces antibiotiques [43].
Parmi les 29 souches susceptibles de produire une carbapénèmase, seules 2 en produisaient soit 6,89%, donc un faible taux de souche secrétrice de carbapénèmase. C’est la première fois à notre connaissance que la prévalence de bactéries productrices de carbapénèmases est documentée dans l’environnement d’une unité de Néonatologie au Sénégal, bien qu’il y’ ait déjà des recherches effectuées dans des échantillons cliniques aussi bien dans ce pays que dans d’autres [44, 45].De nombreuses études réalisées en Europe se sont intéressées sur la prévalence des Bactéries productrices de carbapénémases. Selon le centre européen de la prévention et de contrôle des maladies (ECDC), la prévalence moyenne des Bactéries productrices de carbapénémases rapportées en Europe en 2012, était d’environ de 6,2%. Une grande variabilité entre les pays a été observée et les pourcentages ont varié de <1% (tels qu’en Finlande, Islande, Irlande, Suède, Lituanie, Luxembourg, l’Allemagne, Croatie,
Danemark, Espagne, Portugal), à >15% Italie et Chypre et jusqu’à 60,5% en Grèce [45]. Notre étude ne nous a pas permis de donner le type de carbapénèmases circulant dans l’environnement de l’unité de Néonatologie du CHNEAR par manque de moyens (réactifs et appareillage, nous n’avons pas pu préciser la nature (type) de carbapénèmases produite par nos deux isolats..
Les souches carbapénèmases positives isolées dans notre étude étaient toutes des Bacilles Gram négatif non fermentaires dont une Pseudomonas aeruginosa.
Nous n’avons pas retrouvé, comme rapporté dans la littérature, des souches de Klebsiella pneumoniae productrices de carbapénèmases [45], alors qu’elle était la bactérie suspecte de produire une carbapénèmase la plus fréquemment rencontrée.
Notre étude a confirmé une résistance de 100% à l’ertapénème chez les bactéries productrices de carbapénèmases. Cette molécule est l’indicateur le plus fiable pour la détection de cette résistance.
|
Table des matières
1. Bacilles à Gram négatif
1.1 Entérobactéries
1.2 Bacilles à Gram négatif non fermentaire
2. Carbapénèmes
2.1. Définition
2.2. Structure chimique
2.3. Propriétés Pharmacologiques
2.4. Mécanismes d’Action des Carbapénèmes
2.5. Spectre d’Activité
2.6. Mécanismes de résistance des bactéries aux carbapénèmases
3. Carbapénèmases
3.1. Types de carbapénèmases
3.2. Méthodes de détection des carbapénèmases
3.2.1. Méthodes phénotypiques
3.2.1.1. Test de Hodge
3.2.1.2. Méthodes du E-Test ou disques combinées
3.2.1.3. Tests biochimiques
3.2.1.4. Méthode du milieu gélosé avec inhibiteurs
3.2.2. Méthodes génotypiques ou moléculaires
Deuxième Partie
1. Cadre – période de l’étude
1.1. Cadre de l’étude
1.2. Période de l’étude
2. Matériel – Méthodes
2.1. Matériel
2.2. Méthodes de l’étude
3. Résultats
3.1. Prévalence des BMR isolés selon les zones de prélèvements
3.2. Répartition des BMR selon les espèces
3.3. Répartition des BMR par site d’isolement
3.4. Etude de la sensibilité des BMR aux antibiotiques
3.4.1. Etude de la sensibilité aux antibiotiques des BGN non fermentaires
3.4.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques des entérobactéries
3.5. Souches suspectes de production de carbapénèmases
3.6. Répartition annuelle des souches suspectes de produire une carbapénèmase
3.7. Souches productrices de carbapénèmases
4. Commentaire-Discussion
CONCLUSION
REFERENCES
Télécharger le rapport complet
