Mécanismes de détection du CO chez les mycobactéries

L’hème et le fer

   Le fer est essentiel pour un grand nombre de processus biologiques vitaux. Il est un cofacteur indispensable dans des réactions redox, comme p. ex. dans les clusters Fe-S chez différentes métalloprotéines, et en tant que partie intégrante de beaucoup de systèmes enzymatiques. En tant que fer hémique, il sert de transporteur d’oxygène dans l’hémoglobine des globules rouges, au stockage de l’oxygène dans la myoglobine, au transfert d’électrons par les cytochromes et à l’activation catalytique dans des monooxygénases P450, ainsi que comme site de détection des gaz diatomiques dans des protéines senseurs à base d’hème. L’hème est également une source de fer essentielle pour les bactéries pathogènes dans l’environnement de l’hôte. Dans des conditions physiologiques, presque la totalité du fer des mammifères est liée à des protéines et se trouve dans le compartiment intracellulaire. Les bactéries pathogènes ont développé des mécanismes de compétition pour le fer de l’hôte lors de l’infection [3]. Elles utilisent des protéines capables de saisir l’hème des hémoprotéines. L’hème est ensuite transféré à l’intérieur de la cellule bactérienne, où il est incorporé directement dans les protéines ou dégradé pour libérer le fer [4]. L’hème est un cofacteur ou groupement prosthétique qui contient un atome de fer au centre d’un noyau porphyrine. L’hème ne se trouve pas à l’état libre, mais est toujours associé aux protéines par des acides aminés. L’état de coordination du fer (5- ou 6-coordonné) ou la liaison des ligands diatomiques (CO, NO, et O2) vont permettre à la protéine de réaliser sa fonction. La forme la plus fréquente de l’hème est l’hème b (figure 1.1), présente entre autre dans la myoglobine et l’hémoglobine. Les deux autres formes principales de l’hème sont l’hème a, présent surtout dans l’enzyme cytochrome c oxydase aa3 et l’hème c que l’on trouve dans la protéine de transfert d’électrons cytochrome c.

Les gaz diatomiques

a) Le dioxygène (O₂) Le dioxygène est un gaz indispensable dans de nombreux processus d’oxydoréduction, surtout dans la respiration cellulaire chez les organismes aérobies. Cette réaction consiste à absorber le dioxygène nécessaire au catabolisme oxydatif et apporte l’énergie pour les cellules afin de fonctionner et se développer.Le dioxygène peut également générer un stress oxydatif suite à une réduction enzymatique incomplète en produisant des espèces réactives oxygénées (ERO), qui provoquent des dommages à l’ADN, aux protéines et aux lipides, par ex. les ions superoxyde et peroxyde d’hydrogène qui grâce à leurs électrons non appariés possèdent une grande affinité pour l’hème. Ici nous remarquons l’importance de la détection et contrôle de la concentration d’oxygène dans les cellules chez tous les organismes.
b) Le monoxyde d’azote (NO) Le monoxyde d’azote (ou l’oxyde nitrique) est une molécule diatomique relativement instable qui possède un radical libre qui la rend très réactive. Bien qu’il s’agisse d’un gaz toxique à fortes concentrations, le monoxyde d’azote est une molécule de signalisation importante chez les animaux qui transmet des signaux aux cellules des systèmes cardiovasculaire, nerveux et immunitaire. Sa petite taille lui permet de diffuser à travers les membranes et les parois cellulaires. Le monoxyde d’azote est synthétisé biologiquement suite à l’oxydation de l’acide aminé L-arginine en N-hydroxyarginine, puis en NO grâce à l’enzyme oxyde nitrique synthase (NOS) [6, 7]. Le rôle de l’oxyde nitrique dans la dilatation des vaisseaux sanguins en fait un régulateur important de la pression artérielle. L’oxyde nitrique est également utilisé par le système nerveux comme neurotransmetteur. Dans le système immunitaire, l’oxyde nitrique est produit par les macrophages. L’oxyde nitrique libéré par les macrophages tue p.ex. des bactéries en perturbant leur métabolisme [6, 8]. L’excès de NO peut également contribuer à une inhibition de certaines enzymes comme la ribonucléotide réductase, réquise pour la synthèse de l’ADN [6].
c) Le monoxyde de carbone (CO) Le monoxyde de carbone est un gaz asphyxiant toxique, généré et libéré dans l’environnement par des activités humaines et des processus naturels (comme la combustion incomplète des composés organiques). Sa toxicité chez l’Homme est dû à sa fixation sur l’hémoglobine (Hb) avec une affinité d’environ 200 fois supérieure à celle de l’oxygène et la formation d’un complexe carboxyhémoglobine (HbCO) dont la libération est 10000 fois plus lente. Ce complexe n’est plus capable de transporter et libérer le dioxygène aux cellules et organes, conduisant à l’hypoxie (voir figure 1.2). Le CO peut être synthétisé également de manière endogène chez l’Homme, par l’hèmeoxygénase (HO-1). Cette enzyme catalyse le clivage oxydant de l’hème pour produire des quantités équimolaires de biliverdine, de Fe2+ et du CO et fait partie des stratégies antimicrobiennes chez l’hôte [10] (voir sous-chapitre 1.4.3.). Le CO est une molécule stable et difficile à convertir en d’autres espèces. Il est à noter que le CO n’interagit qu’avec les complexes métalliques, tels que les complexes de fer hémique ou non-hémique ou de fer-molybdène et non avec les résidus d’acides aminés des protéines. Ce comportement chimique du CO est différent de celui de l’O2 et de NO, qui forment des espèces réactives dérivées telles que l’H2O2 ou le peroxynitrite, respectivement. À faibles quantités, le CO peut agir comme molécule de signalisation, qui peut affecter la régulation de gènes [11, 12]. Cela nécessite sa détection rapide et des réponses cellulaires adaptées, ainsi que des mécanismes spécifiques pour concurrencer l’oxygène existant, qui sont peu compris à ce jour. Le monoxyde de carbone est également une molécule intermédiaire dans le métabolisme bactérien grâce à la métalloprotéine carbone monoxyde déshydrogénase (CODH), qui catalyse la réaction suivante : CO + H₂O  CO2 +2H⁺+2e-. Selon sa concentration, le CO peut inhiber la respiration aérobie chez E. coli en se fixant sur les cytochrome oxydases bd-I et bd-II et bo [13]. Le CO peut inhiber la croissance d’E. coli en altérant l’expression de certains gènes impliqués dans la glycolyse et le cycle de Krebs, incluant l’aconitase [12]. Une perturbation des gènes impliqués dans l’acquisition du fer par le CO, surtout le changement de l’activité du facteur de transcription Fur « ferric uptake regulator », a été observée, Fur contrôle l’expression des enzymes qui protègent contre les dommages dûes par des espèces réactives de l’oxygène. Le CO affecte également de façon significative les gènes codant pour des voies de transduction d’énergie par son action sur les régulateurs ArcA et FNR [12] et, contrairement au NO, qui protège les bactéries de certains antibiotiques [14], il n’y a pas de preuve que le CO possède cet effet [12].

Les hémosenseurs à CO

   À ce jour très peu d’hémo-senseurs à CO sont connus. Chez les eucaryotes le senseur de CO le mieux étudié est la protéine neuronale NPAS2 [32]. Dans les bactéries, le régulateur de transcription CO-dépendant CooA, découvert dans la bactérie photosynthétique Rhodospirillum rubrum, est le mieux caractérisé et la structure tridimensionnelle de sa forme inactive a été déterminée [33]. Récemment, dans la bactérie aérobie Burkholderia xenovorans un nouveau hémo-senseur à CO, RcoM, a été identifié, mais de nombreux aspects mécanistiques de détection du CO par RcoM restent encore peu compris.
a) Les senseurs à CO chez les eucaryotes : Le CO est également une molécule de signalisation importante chez les eucaryotes. Autrement que par synthèse exogène (voir 1.2.c), le CO est synthétisé par l’enzyme hème oxygénase à l’aide du NADPH cytochrome P450 réductase [34–36]. Un rôle de neurotransmetteur gazeux a été également attribué au CO [37]. La protéine neuronale NPAS2 est un récepteur du CO [37]. NPAS2 appartient à la famille des facteurs de transcription hélice-boucle-hélice (bHLH)-PAS. Le monomère de NPAS2 contient deux domaines (PAS-A et PAS-B) avec deux hèmes comme sites de fixation de CO [32]. La fixation de CO agit sur la liaison de NPAS2 à l’ADN à condition de la présence de son partenaire hétérodimère BMAL1 [32]. NPAS2 peut se dimériser avec la protéine BMAL1 et activer la transcription des gènes du rythme circadien per et cry chez les mammifères [37]. Il est important de noter que l’activité de régulation de la transcription du dimère NPAS2-BMAL1 est inhibée par la liaison du CO à l’hème Fe (II). NPAS2 et le facteur de transcription Clock possèdent des séquences primaires très similaires et partagent le même partenaire dimérique, BMAL1. La figure 1.9 montre un schéma de l’interaction du régulateur Clock avec son partenaire BMAL1 et leurs régulations des gènes per et cry.
b) Les senseurs à CO chez les bactéries Très peu de senseurs à base d’hème bactériens qui détectent du CO sont connus à ce jour. Les plus étudiés sont le senseur de CO anaérobie CooA et le senseur aérobie RcoM. Ces deux protéines senseurs présentent deux mécanismes non homologues de régulation transcriptionnelle CO-dépendante chez les procaryotes avec une similarité des propriétés fonctionnelles.
b.1) CooA, senseur à CO anaérobie L’hémo-senseur CooA (« CO oxidation activator ») chez la bactérie photosynthétique Rhodospirillum rubrum est le senseur de CO procaryote le plus étudié actuellement. CooA appartient à la famille de régulateurs de transcription CAP (« catabolite activator protein »), qui activent l’expression de certains gènes en réponse aux signaux externes. CooA a une similarité de 51% avec les protéines de cette famille (28% des séquences identiques), et 45% de similarité avec la famille des protéines fumarate nitrate réductase FNR chez E. coli (18% des séquences identiques) [18]. CooA possède une affinité micromolaire pour le CO [39], en accord avec son action sous des conditions d’anaérobie. CooA régule l’expression de l’opéron coo [18], qui code pour les CO déshydrogénase et hydrogénase, responsables de l’oxydation du CO, permettant ainsi à R. rubrum d’utiliser du CO comme seule source d’énergie et de carbone [40]. CO est l’activateur physiologique de CooA, aboutissant à sa liaison à sa cible d’ADN avec une affinité nanomolaire [41].  Domaine senseur avec l’hème de chaque monomère (en vert), domaines de liaison à l’ADN (en bleu) et régions de commutation (en orange). La fixation du CO aboutit à la liaison de CooA à l’ADN afin d’activer la transcription des gènes coo (adapté de [42]). Différent du système à deux composants FixL/FixJ (voir fig. 1.6), CooA est un système àun composant. Ce senseur à CO est un homodimère dont chaque monomère possède en Nterminal un hémo-domaine senseur et en C-terminal un domaine de liaison à l’ADN [33] .L’homodimère CooA a un mécanisme de régulation allostérique, typique de la famille des protéines CAP [42]. L’hème se trouve en proximité de l’interface du dimère et est 6- coordonné dans la forme inactive. L’hème dans l’état réduit (Fe²⁺) est lié à la protéine par une histidine proximale, His77. Dans la forme oxydée, ce ligand de l’hème est remplacé par la cystéine Cys75. Le ligand distal est le proline Pro2 de l’autre sous-unité [33], qui sera remplacé par le CO. La structure 3D de CooA dans sa forme inactive a été déterminée [33]. La structure active n’est pas encore connue, mais plusieurs modèles suggèrent des changements structuraux importants au sein de la protéine, ainsi permettant la fixation à l’ADN.
b.2) RcoM, senseur à CO aérobie Le senseur à base d’hème RcoM (« regulator of CO metabolism ») est un facteur de transcription CO-dépendant qui a été identifié chez la bactérie aérobie Burkholderia xenovorans [45]. La bactérie Burkholderia xenovorans (souche LB 400) est une bactérie aérobie qui se trouve dans le sol, possède la capacité à cataboliser des composés aromatiques (PCB) dans le sol et présente un grand potentiel pour les applications biotechnologiques environnementales, telles que la bio-remédiation des sols contaminés par des PCB. Récement un nouveau hémo-senseur à CO a été identifié chez cette bactérie ; le RcoM. Le RcoM régule l’expression des gènes cox, impliqués dans l’oxydation aérobie du CO [45]. Ce régulateur est capable de lier le CO avec une très forte affinité, mais ne fixe pas d’O₂. Chez la bactérie aérobie Burkholderia xenovorans deux homologues sont présents : RcoM-1 et RcoM-2, codéssur différents chromosomes et avec 93% d’identité au niveau protéique [45]. RcoM est un senseur à un composant qui possède un module de repliement PAS portant l’hème en N-terminal et un domaine de liaison à l’ADN du type LytTR en C-terminal [45, 46]. Comme dans le senseur CooA, l’hème est 6-coordonné et le ligand CO externe déplace un ligand interne (acide aminé) de l’hème. L’alignement de séquences de RcoM-1 et RcoM-2 montre la conservation de His74 dans le domaine PAS et de His218 dans le domaine LytTR [45]. En l’absence d’une structure 3D pour RcoM, la figure 1.12 est une représentation visuelle de l’architecture des domaines PAS et LytTR [47]. Dans RcoM-1, les résidus His74 et Met104 ont été identifiés comme des ligands de l’hème (état Fe(II)) [45]. Dans RcoM-2, l’His 74 est aussi un ligand de l’hème et un résidu cystéine (Cys94) a été identifié comme l’autre ligand de l’hème dans l’état Fe(III). Lors de la réduction de l’hème (état Fe(II)), Cys94 est remplacé par un acide aminé méthionine (Met104), qui sera remplacé par le CO externe ; situation qui a été également observée pour le senseur Dos d’E. coli . Les senseurs RcoM possèdent une affinité très élevée, de l’ordre nanomolaire, pour le CO [45, 48], en accord avec leur fonction de détecter des faibles concentrations de CO en présence d’oxygène. L’hémo-domaine senseur de RcoM-2 (RcoMH-2) possède la propriété unique d’être purifiée dans la forme ferreuse (Fe2+) complexée au CO après expression aérobie chez E. coli. Ce complexe RcoMH-2-CO est très stable et le ligand CO se libère seulement après illumination forte pour une longue durée sous conditions aérobies [45, 48, 49]. L’observation qu’après photodissociation RcoMH-2 ne forme pas d’intermédiaire oxydé indique une très faible affinité pour le O2, essentiel pour un fonctionnement en tant que senseur spécifique de CO sous des conditions aérobies. Dans toutes les protéines senseurs à hème, la liaison ou dissociation du ligand physiologique gazeux induit une perturbation dans l’environnement de l’hème. L’étude de ces processus primaires permet de déterminer la dynamique du ligand en temps réel et ainsi à mieux comprendre les étapes initiales de détection et de signalisation par ces senseurs et le rôle de l’environnement protéique dans ces processus. Notre équipe a caractérisé la cinétique de l’interaction hème-CO dans l’hémo-domaine RcoMH-2 et trouvé qu’après photodissociation, le CO se lie sur l’hème très rapidement et de façon quasi complète et irréversible (voir figure 1.14) [49]. Cette observation pose la question comment RcoM-2 peut fonctionner physiologiquement comme senseur de CO et nous a conduit à étudier la protéine entière, incluant le domaine de fixation à l’ADN. Comme indiqué, les protéines RcoM sont des régulateurs de transcription CO dépendants avec un domaine de liaison à l’ADN du type LytTR . Dans le cas de CooA, il a été trouvé que la liaison du complexe CooA-CO à son ADN cible accélère larecombinaison géminée du CO au sein du domaine senseur [50]. Afin de tester si un effet de la liaison d’ADN sur la cinétique de recombinaison du CO peut être observée chez RcoMH-2, nous avons étudié ces propriétés pour la protéine entière de RcoM-2 dans ce travail de thèse et nous les avons comparées avec celles pour le domaine hémique RcoMH-2. Comme décrit ci-dessus, à faibles quantités, le CO peut agir comme molécule de signalisation et peut affecter la régulation de gènes. Certaines bactéries, anaérobies ou aérobies, peuvent utiliser le CO comme source de carbone et énergie. Pour un grand nombre de bactéries aérobies, le CO en fortes concentrations exerce un effet toxique, p. ex. par l’inhibition de la chaine respiratoire. Il est intéressant à noter que les mycobactéries, bactéries aérobies obligatoires, sont capables de supporter des concentrations très élevées de CO (supérieures à 100 µM) suggérant des mécanismes de détection du CO et des réponses uniques pour combattre la toxicité du CO.

Mécanismes de défense de l’hôte

  Après infection et début de phagocytose, les bacilles tuberculeux se localisent typiquement dans les macrophages alvéolaires, qui activent des mécanismes de défense afin de détruire ces bactéries. Parmi ces stratégies antimicrobiennes de l’hôte on connait la production des espèces réactives oxygénées (ERO), l’acidification du milieu, des changements gazeux dont la libération du NO et la production du CO par l’enzyme hème oxygénase (HO). Chez l’Homme et la souris, il existe trois isoformes de l’hème oxygénase, HO-1, HO-2, HO-3 (codées par les gènes hmox1, hmox2 et hmox3, respectivement). Les trois isoformes catalysent l’oxydation de l’hème en biliverdine, qui est ensuite réduite en bilirubine, qui peut être excrétée. L’autre produit de la réaction est le CO. Enfin, le fer libéré est recyclé et représente la source principale de ce métal dans l’homéostasie de l’hème [10, 57]. HO-2 et HO-3 sont exprimés de manière constitutive, alors que la HO-1 est induite par du stress oxydatif, en cas d’inflammation, et également par infection avec Mtb [58]. HO-1 est induit par le facteur de transcription Nrf2 [59–62], et réprimé par le facteur Bach1 [6]. Une induction de l’expression de l’hème oxygénase-1 peut créer des concentrations locales élevées en CO, bénéfiques pour les cellules hôtes car le CO et la biliverdine / bilirubine peuvent agir en tant que molécules de signalisation et constituer une cytoprotection.

Système de régulation DosRS-DosT

  Mtb réagit aux changements en concentrations gazeuses grâce à un système de signalisation à deux composants qui détecte des changements dans la tension d’O2, NO et CO via les domaines de liaison à l’hème GAF de deux histidine kinases senseurs, DosS et DosT, et le régulateur de transcription DosR (voir figure 1.19). Le système DosRS-DosT s’autorégule et induit un régulon défini de 48 gènes chez M. tuberculosis (le régulon de dormance) suite à une exposition à l’hypoxie, à l’oxyde nitrique (NO) et au monoxyde de carbone (CO) [64–66, 68] ; (voir figure 1.19). Des profils de transcription après exposition de Mtb au CO ont montré que le CO induisait la transcription de nombreux gènes du régulon de dormance [65]. Chez Mtb, le régulon de dormance est bien caractérisé et contient le gène dosR luimême, ainsi que les gènes dosS et dosT, codant pour des kinases senseurs, le gène rv0081, des nitroréductases, la diacylglycérol acyltransférase (DGAT) et de nombreuses protéines de stress universelles [69].

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Table des matières

Introduction
I. Détection des gaz diatomiques par les protéines senseurs à base d’hème
1.1. L’hème et le fer
1.2. Les gaz diatomiques
a) Le dioxygène (O₂)
b) Le monoxyde d’azote (NO)
c) Le monoxyde de carbone (CO)
1.3. Les senseurs à gaz à base d’hème 
1.3.1. Les hémo-senseurs d’O₂
1.3.2. Les hémo-senseurs de NO
1.3.3. Les hémo-senseurs à CO
a) Les senseurs à CO chez les eucaryotes
b) Les senseurs à CO chez les bactéries
b.1) CooA, senseur à CO anaérobie
b.2) RcoM, senseur à CO aérobie
1.4. Les mycobactéries
1.4.1. Généralités et caractéristiques
1.4.2. Mycobacterium tuberculosis (Mtb)
1.4.3. Mécanismes de défense de l’hôte
1.4.4. Mécanismes de détection des gaz chez Mycobacterium tuberculosis
a) Système de régulation DosRS-DosT
b) Senseurs kinases DosS/DosT
c) Le système MprA/B
d) Le régulateur de transcription Rv0081
e) Détection et réponse au CO dans Mtb ; autres mécanismes
e.1) Le gène cor (carbone monoxide resistance)
e.2) Cluster de gènes impliquant cor (rv1829)
e.3) Le régulateur de transcription Rv1828
1.5. Problématique et objectifs de la thèse
II-Mécanismes de détection et signalisation du CO : l’hémo-senseur RcoM-2
2.1. Introduction 
2.2. Caractérisation de RcoM-2
2.2.1. Clonage, expression et purification de RcoM-2
2.2.2. Analyses de RcoM-2 par spectroscopie d’absorption à l’équilibre
2.2.3. Cinétique de liaison du ligand CO
2.2.4. Dissociation du ligand CO
2.2.5. Dynamique de l’interaction hème-CO : recombinaison géminée du CO
2.2.6. Liaison de RcoM-2 à l’ADN
III-Mécanismes de détection du CO chez les mycobactéries
3.1 Introduction
3.2. Caractérisation de la protéine Cor
3.2.1. Caractérisation biochimique de Cor
a) Surexpression inductible de Cor
b) Cor est un dimère très stable
c) Modélisation de la protéine Cor
3.2.2. Caractérisation spectroscopique de Cor
a) Liaison Cor-hème
b) Cor fixe du CO et lie de l’hème de façon spécifique
c) La présence du CO accélère la liaison de l’hème à Cor
d) Dynamique du ligand diatomique CO
e) Recombinaison du ligand hémique
3.2.3. Études des mutants Cor-H58A et Cor-H70A
a) Expression et purification de Cor-H58A et Cor-H70A
b) Caractérisation spectroscopique des mutants
b.1) Liaison d’hème dans les mutants en absence du CO
b.2) Liaison d’hème en présence du CO
3.3. Le cluster de gènes « cor »
3.3.1. Alignements et analyses in silico
3.3.2. Expression et purification des régulateurs de transcription
a) Le régulateur de transcription Rv0081
b) Le régulateur de transcription Rv1828
3.3.3. Interaction protéines-ADN
3.3.3.1) Spectroscopie d’anisotropie de fluorescence
a) Principe de l’anisotropie de fluorescence
b) Fixation de Rv0081 et Rv1828 à la région régulatrice prédite de cor
c) Mesures de fixation de Rv1828 avec la région promotrice rv0081
d) Cor lie de l’ADN en présence d’hème et du CO
d.1) Etude de la liaison de Cor à la région ADN rv1831/rv1832
d.2) Etude des mutant de Cor-H58A et Cor-H70A
3.3.3.2) Electrophoretic mobility shift assay : EMSA
a) Principe de l’EMSA (« retard sur gel »)
b) EMSA avec Rv0081, Rv1828 et Cor
3.4. Cristallogenèse des protéines
3.5. Rôle physiologique de Cor
3.5.1. Croissance mycobactérienne en présence du CO
a) Souche sauvage de M. smegmatis
b) Création d’une souche de délétion de cor
IV-Conclusions et perspectives
V-Matériels et méthodes
5.1. Techniques de biologie moléculaire
5.1.1. Milieux de culture et croissance bactérienne
5.1.2. Cartes des plasmides et gènes utilisés
5.1.3. Souches des bactéries utilisées
5.1.4. Extraction de l’ADN génomique de M. smegmatis
5.1.5. Amplification et clonage du gène cor (rv1829)
5.1.6. Transformation bactérienne
5.1.7. Extraction, purification de l’ADN plasmidique et digestion enzymatique
5.1.8. Vérification des génotypages (constructions plasmidiques)
5.1.9. Mutagenèse dirigée
5.1.10. Listes des amorces utilisées
5.2. Manipulation des protéines et études biochimiques
5.2.1. Expression des protéines dans Escherichia coli
5.2.2. Purification des protéines et détermination de la concentration
5.2.3. Analyses des protéines purifiées par SDS-PAGE
5.2.4. Technique d’EMSA
5.3. Approches spectroscopiques
5.3.1. Spectroscopie d’absorption
5.3.2. Anisotropie de fluorescence
5.3.3. Absorption résolue en temps
5.4. Microscopie confocale
5.5. Ultracentrifugation analytique de la protéine Cor
5.6. Cristallisation des protéines
5.7. Modélisation moléculaire de Cor
VI-Références bibliographiques
VII-Annexes

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