Soutenance mémoire
Mécanisme biologique de l’action du locus IDDM2
Anatomie et physiologie du pancréas
Le pancréas est un organe à sécrétion endocrine et exocrine c’est à dire qu’il fabrique des hormones déversées dans le sang et des enzymes digestives déversées dans le duodénum. Les îlots de Langerhans, amas de cellules dispersés dans tout le pancréas, sécrètent des hormones, l’insuline surtout, qui est produite par la cellule bêta, mais aussi le glucagon, la somatostatine et d’autres hormones produites par les cellules dites non bêta. Environ 80 % de la masse glandulaire du pancréas est responsable de la sécrétion exocrine c’est à dire des enzymes responsables de la digestion des protéines, des triglycérides et des glucides alimentaires. Les enzymes pancréatiques sont sécrétées en excès et la maldigestion ne survient que si plus de 90 % de la glande a été détruite (par exemple alcoolisme). Situé, dans la partie supérieure de l’abdomen, le pancréas est un organe profond expliquant les difficultés de diagnostic précoce en cas d’affection le concernant. Il comprend 4 parties : La tête et l’isthme qui s’insèrent dans le cadre du duodénum, le corps et la queue qui se prolongent jusqu’au bord de la rate [Heinz Feneis, Wolfgang Dauber 2000].
Anatomie pathologique :
L’insulite, infiltrat inflammation des ilots de langerhans, est la caractéristique histologique du diabète de type 1. L’étude de l’insulite chez l’homme se heurte à des limites évidentes les techniques d’imagerie, utilisant par ligand radiomarqués des lymphocytes T, sont balbutiantes et les rares études histologiques de biopsie pancréatique sous laparoscopie ont donné des informations partielles. Le pancréas endocrine de sujets décédés dans la semaine et suivant le diagnostic contient toujours des ilots qui comportent des cellules β ; leur pourcentage augmente parallèlement à l’âge de découverte du diabète. La masse résiduelle de cellules β au moment du diagnostic n’a pu être appréciée de façon fiable que dans de rares cas ; chez l’enfant elle serait de 20%. Les cellules β présentent des aspects de dégranulation et de vacuolisation ou au contraire d’hyperactivité. Il a longtemps été considéré que la capacité de régénération des cellules β est pratiquement nulle. Une insulite est observée chez tous les enfants, mais moins de 50% Chez des sujets adultes. L’insulite est spécifique des ilots qui contiennent encore des cellules β et respecte les autres qui prennent un aspect désorganisé et atrophique [Mohamed A. 2005].
Aspect génétique
Au début des années 80, le développement de nouveaux outils pour l’analyse de la liaison génétique et le clonage de position avait pour résultat l’identification des gènes à la base de plusieurs affections héréditaires ; cependant, concernant le diabète de type 1, l’identification des gènes de susceptibilité fondamentaux a été lente, du fait que le mode de transmission restait inconnu. Le seul grand facteur de risque pour le diabète de type 1 est d’avoir un jumeau monozygote possédant les troubles ; mais, la plupart des études placent le taux de concordance dans l’intervalle de 25% à 50% [Bell Gi, Horita S, Karam Jh 1984] ; ces taux reflètent la contribution familiale au risque, dont certains sont également environnementaux, diminuant le rôle des facteurs de risque génétique. Ceci signifie que les facteurs environnementaux, familiaux et non familiaux, expliquent probablement une fraction importante du risque de développement du diabète de type 1. Le risque pour le diabète de type 1 diminue quand la parenté génétique à un probant dans une famille diminue mais demeure élevé en fonction du risque de la population chez les parents consanguin de 1er, 2ème, et même 3ème degré. Le risque pour les enfants d’un probant n’est pas différent de celui de la progéniture, d’où la proposition que la variance génétique dans le diabète de type 1 soit additive. Sous un modèle strictement additif, le rapport entre la parenté génétique avec un probant et le risque de diabète de type 1 devrait être une fonction linéaire de la prévalence de la population. Cependant, un examen du risque de diabète de type 1 chez les parents du 2ème et 3ème degré suggère un rapport non linéaire. Ceci est incompatible avec la possibilité qu’un locus unique explique à lui seul le risque, et est compatible aux modèles dans lesquels des gènes multiples se combinent selon un mode additif pour conférer le risque [Rich, Surmin 1990].
Évaluation fonctionnelle des gènes candidats de la susceptibilité au DT1 L’étude de gènes candidats a été longtemps la principale méthode pour l’identification des gènes de susceptibilité au diabète de type 1, ce qui a permis la découverte de HLA, INS, PTPN22, CTLA4 et IL2. Toutefois, bon nombre d’études qui reposaient sur cette stratégie ont été largement sous-estimés, en raison des limites de l’information génomique et du génotypique, ainsi que la taille limitée des cohortes disponibles. Depuis, cette situation a évolué, avec les grands progrès technologiques et méthodologiques survenus au cours des dernières années, et la disponibilité de plus grandes cohortes ont abouti à la faisabilité de balayage du génome en entier (genome-wide association scans ″GWAs″), qui disposent désormais de la puissance d’études d’associations sans hypothèse. Bien que ces études conduisent à l’identification d’un nombre croissant de SNP (single-nucleotide polymorphisms) associés au DT1, ceux-ci se trouvent souvent à une certaine distance du gène responsable de causalité; la variante comme une conséquence des régions prolongées de déséquilibre de liaison sur le génome. En revanche, les gènes candidats ont été choisis en fonction de leurs rôles connus ou putatifs dans la fonction immunitaire et auto-immunitaire où la fonction cellulaire des cellules β et les résultats d’association positive fourni une preuve directe du mécanisme de la maladie. Par conséquent, l’examen des gènes candidats, avec la charge d’explorations antérieures de ces gènes, est apparue comme une source prometteuse pour identifier et/ou confirmer les gènes associés au DT1 ou de nouveaux SNP associés à des gènes connus, en utilisant la meilleure technologie disponible et la meilleure information génomique, ainsi que la grande taille des cohortes.
Le progrès a été accompli en étudiant les facteurs génétiques impliqués dans le développement du diabète de type 1 (D T1) pendant les dernières années tandis que La cartographie de déséquilibre de liaison (DL) a été utile à la fois à la confirmation et la cartographie fine des intervalles de sensibilité, Ainsi que l’identification de mutations étiologiques et l’identification des gènes responsables de maladies spécifiques définies et limitées à des gènes candidats connus. Le risque global pour les diabétiques de type 1 de la molécule HLA DR et DQ (IDDM1) est déterminé par des combinaisons des allèles polymorphes. Des études fonctionnelles indiquent que cette susceptibilité, est liée au HLA DR-DQ protecteur et présente des peptides non –recouvrant. Bien que la preuve de liens constants ait été signalée pour l’intervalle de susceptibilité d’IDDM2, IDDM5 et IDDM12, la preuve pour la plupart des autres intervalles varie dans différents ensembles de données.
Le nombre variable des répétitions en tandem du VNTR à l’extrémité 5′ du gène de l’insuline règle l’expression de l’insuline au niveau du thymus, Un polymorphisme dans l’extrémité 5’ flanquant la région du gène de l’insuline (INS) sur le chromosome 11p15.5 a été considéré pendant deux décennies c’est le SNP -23 Hph1. Il se compose d’un nombre variable de répétitions en tandem (VNTR), également dénommé un polymorphisme de minisatellite, situé dans la 365ème pb en amont de l’INS, en dehors des séquences codantes [38] il ya répétition en tandem d’un oligonucléotide de 14 à 15 pb qui est lié à une séquence consensus ACAGGGGTGTGGGG. Le nombre de répétitions montre une distribution bimodale avec des allèles regroupant soit à 30-60 répétitions (classe I) ou 120-170 répètitions (classe III), avec des tailles intermédiaires (classe II) très rares. L’homozygotie pour l’allèle de la classe I confère un risque relatif de 2-3 contre la présence d’au moins un allèle de classe III. Inversement, les allèles de classe III, moins fréquents ont un effet protecteur dominant [Knerr I.; Wolf J. et al 2005]. Le polymorphisme des INS-VNTR n’affecte pas la séquence peptidique d’insuline. Par conséquent, et compte tenu de sa situation en amont du promoteur de l’INS, ses effets biologiques sont les plus susceptibles aux différences alléliques dans les niveaux de transcription d’INS.
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Table des matières
INTRODUCTION
Objectif
Chapitre I –Synthèse Bibliographique
1.1- Aspect clinique
1.1.1-Anatomie et physiologie du pancréas
1.1.2- Anatomie pathologique : l’insulite
1.1.3- Classification étiologique du diabète de type 1 (DT1)
a) diabète de type 1 auto-immun
b) diabète de type 1 idiopathique
1.1.4- Symptômes
1.1.5- Diagnostic et évolution
1.1.6- Traitement
1.1.6.1-Traitement par insuline
1.1.6. 2- Thérapie cellulaire
1.1.6.3- Immunothérapie
1.1.6.4- Greffe du pancréas
1.1.7- Complications
1.1.8- Prévention et conseils
1.2-Aspect génétique
1.2.1-Évaluation fonctionnelle des gènes candidats de la susceptibilité au DT1
1.2.2- Locus de susceptibilité héritée pour le DT1
1.2.3- Gène de l’insuline : le locus IDDM2 INS-VNTR
1.2.3.1- Mécanisme biologique de l’action du locus IDDM2
1.2.4- Gène CTLA4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4)
1.2.4.1- Rôle de la molécule CTLA4
Processus de présentation de l’antigène aux cellules T par les molécules HLA classe II
1.2.4.2-les polymorphismes du CTLA-4 dans le DT1
Résumé de la signification génétique et fonctionnelle des SNP dans le gène CTLA4
1.3- Aspects immunologiques du DT1
1.3.1-Mécanisme de la réaction auto-immune dans le DT1 Pathogénie de la destruction des îlots de Langerhans
1.3.2 – les auto-anticorps dans la prédiction du DT1
1.3.3 -Marqueurs immunologiques du DT1
1.3.3.1- Anticorps anti-Cytoplasme des Ilôts (ICA)
1.3.3.2- Auto-anticorps anti-insuline (IAA)
1.3.3.3- Auto-anticorps anti-acide-glutamique decarboxylase (GADA)
1.4-Facteurs de risques environnementaux du DT1 32
1.4.1-L’environnement prénatal
1.4.2- Le facteur de risque alimentaire
1.4.2.1- L’allaitement maternel
1.4.2.2- Le lait de vache
1.4.2.3- La vitamine D
1.4.3- Les infections
1.4.3.1- Les infections virales
1.4.4 – Les toxines
1.4.5-Les variations saisonnières du DT1
1.4.6-Les autres causes
Chapitre 2 -MATERIEL ET METHODES
2.1 -Echantillonnage
2.2 – Analyses des échantillons
2.3- Prélèvement du sang
2.4- Mesure de l’indice de masse corporelle (IMC)
2.5- Extraction de l’ADN à partir du sang total
2.5.1- Méthode d’extraction au NaCl
2.5.2- Méthode d’extraction au phénol-chloroforme
2.6- Contrôle de la qualité de l’ADN
2.6.1- Pureté de l’ADN
2.7- La PCR (Polymérase Chain Reaction)
2.7.1- Principe
2.7.2- Échantillon
2.7.3- Matériels nécessaires pour la PCR
a.Biologique
b.Non biologique
2.7.4- Protocole de l’amplification
2.7.5- Procédure de la PCR
2.7.5- Avant la réalisation
Programme PCR pour le SNP +49 du gène CTLA4
Programme PCR pour le SNP -23 Hph1 du gène INS-VNTR
Programme PCR pour le gène HLA-DMB
2.8- Electrophorèses sur gel d’agarose
2.8.1- Principe
2.8.2- Procédure de l’électrophorèse sur gel d’agarose
2.8.2.1-Préparation du gel d’agarose 46
2.8.2.2-Dépôt des produits d’amplification. Observation du gel sous UV
2.8.4-Avertissement
Chapitre 3 -RESULTATS ET DISCUSSION
1-Analyses statistiques
3.1.1- Effet du sexe dans le déclenchement du DT1
Distribution des diabétiques de type 1 et des témoins en fonction du sexe
Nombre et fréquences de nos échantillons
3.1.2- Effet de la consanguinité sur le déclenchement du DT1
Distribution des individus selon la consanguinité chez les DT1 et les témoins Fréquence de la consanguinité
3.1.3 Effet de l’IMC sur l’apparition du DT1
Distribution de l’IMC dans notre échantillon
Moyenne générale de la distribution de l’IMC
3.2-Analyse moléculaire
3.2.1 – Extraction de l’ADN
Electrophorèse après extraction au phénol
3.2.2- Concentration et pureté de l’ADN
3.2.3- La PCR
Les données génotypiques
Electrophorèse après amplification du SNP -23Hph1 du gène INS-VNTR à Tm 55°C
Electrophorèse après amplification des différents gènes à Tm 54°C
Electrophorèse après amplification des différents gènes à Tm 54,5°C
Electrophorèse après amplification du gène INS-VNTR à Tm 53°C
Electrophorèse après amplification du gène HLA-DMB à Tm 62°C
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Références bibliographiques
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