Maladie d’Alzheimer : Neuropathologie, diagnostic et enjeux thérapeutiques

NEUROPATHOLOGIE DE LA MALADIE D’ALZHEIMER 

Lésions amyloïdes (consulter [Teplow 1998, Clippingdale 2001] pour revues) Le terme amyloïde a été introduit en 1854 par Rudolph Virchow pour décrire une anomalie macroscopique du tissu cérébral présentant une coloration positive à l’iode [Sipe 2000].

Le peptide amyloïde dérive de l’”Amyloid Precursor Protein”

Le constituant principal des plaques séniles amyloïdes est un peptide de 4 kDa, le peptide amyloïde (Aβ), produit au cours du métabolisme normal [Haass 1992b, Shoji 1992], par clivage protéolytique de l’APP (“amyloid precursor protein”). L’APP est une glycoprotéine trans-membranaire multifonctionnelle [Mattson 1997, Sambamurti 2002], qui comporte un grand domaine extracellulaire, un domaine trans-membranaire hydrophobe et un court domaine cytoplasmique. Son expression, codée par un gène situé sur le chromosome 21, est ubiquitaire. Un épissage différentiel de l’ARN messager conduit à différentes isoformes, dont trois sont majoritaires dans le cerveau : APP695, APP751, et APP770 (Figure I.1) (le nombre en indice indique le nombre d’acides aminés dans chaque protéine). La numérotation des acides aminés adoptée dans ce manuscrit se réfère à l’isoforme la plus longue, APP770. Les neurones humains expriment principalement l’isoforme APP695 et produisent la majorité de l’APP présente dans le cerveau, tandis que les isoformes APP751 et APP770 sont rencontrées principalement dans les cellules gliales. Au cours de sa maturation, l’APP subit différentes modifications post-traductionnelles : N- et O-glycosylations, sulfatations et phosphorylations. Elle peut être sécrétée ou rester ancrée à la membrane. La forme ancrée à la membrane, largement majoritaire (de l’ordre de 90 % de l’APP totale), peut subir plusieurs clivages protéolytiques. Il existe trois sites principaux de clivage de l’APP, qui impliquent chacun un système enzymatique particulier [Mattson 1997, Nunan 2002], associé au terme sécrétase pour rendre compte du fait que la plupart des fragments de l’APP issus de ce clivage sont sécrétés. La β-sécrétase clive entre les résidus 671 et 672 (terminaison N terminale d’Aβ), l’α-sécrétase, entre les résidus 687 et 688 (résidus 16 et 17 d’Aβ) et la γ-sécrétase, après les résidus 710 à 714 (terminaison C-terminale d’Aβ). Deux principales voies de clivage distinctes de l’APP en résultent :

− Le clivage par l’α-sécrétase, entre les résidus K16 et L17 d’Aβ [Anderson 1992], représente le chemin métabolique principal. Il conduit à la sécrétion d’un grand fragment N-terminal, sAPPα, et à la formation d’un fragment C-terminal, C83, constitué du fragment tronqué d’Aβ et de la queue cytoplasmique de l’APP. Le clivage par la γ-sécrétase sépare le fragment p3, qui est sécrété par la cellule, de la queue cytoplasmique (CTF).
− La β-sécrétase clive l’APP avant le premier résidu d’Aβ. Ce clivage conduit à la sécrétion du fragment N-terminal sAPPβ et à la formation du fragment C-terminal C99, constitué de la séquence d’Aβ et de la queue cytoplasmique. Le clivage par la γ-sécrétase libère le peptide Aβ, qui est sécrété par la cellule.

Notons que le clivage par la γ-sécrétase, qui a lieu au sein de la membrane cellulaire, s’effectue en différents sites adjacents et conduit ainsi à une hétérogénéité C-terminale des peptides p3 et Aβ, respectivement en Aβ(17-X) et Aβ(1-X) avec X = 39 à 43. Pour Aβ, les peptide majoritaires issus du clivage sont chez les sujets sains Aβ(1-40) (90 % des peptides sécrétés) et Aβ(1-42) (majorité des 10 % restants) [Seubert 1992]. Ainsi, la queue cytoplasmique libérée, CTF, comporte majoritairement 57 ou 59 résidus et est notée C57 ou C59. Le site de clivage de la β sécrétase apparaît ne pas être unique. Si ce clivage a lieu principalement avant le résidu D1 d’Aβ, des formes minoritaires tronquées de ce peptide, commençant à E3 ou à E11 ont également été décrites [Haass 1992b, Gouras 1998].

Les peptides Aβ et p3 sont retrouvés sous forme soluble dans le plasma, le liquide céphalorachidien (LCR) et des extraits de tissus cérébraux [Seubert 1992, Vigo-Pelfrey 1993]. Toutefois, ces deux peptides sont observés au sein de lésions asssociées à la maladie d’Alzheimer : Aβ(17-42) est le constituant principal de dépôts diffus non amyloïdogènes [Gowing 1994, Higgins 1996, Lalowski 1996] et Aβ(1-42) est le constituant principal des plaques séniles amyloïdes [Iwatsubo 1994].

Enzymes impliquées dans le clivage de l’APP

Les protéines et les mécanismes impliqués dans le clivage protéolytique de l’APP commencent à être bien caractérisés [Nunan 2000, Checler 2002]. Les différentes étapes du clivage de l’APP s’opèrent dans des compartiments cellulaires distincts, qui seront abordés rapidement ci-dessous pour chaque sécrétase.

Les protéines et les mécanismes impliqués dans le clivage protéolytique de l’APP commencent à être bien caractérisés [Nunan 2000, Checler 2002]. Les différentes étapes du clivage de l’APP s’opèrent dans des compartiments cellulaires distincts, qui seront abordés rapidement ci-dessous pour chaque sécrétase.

α-sécrétase [Haass 1992a]
Le clivage par l’α-sécrétase a lieu dans le réseau trans-golgien et à la surface cellulaire. Le clivage à la surface cellulaire, majoritaire, constitue un “ectodomain shedding”, clivage protéolytique conduisant à la libération du domaine extra-cellulaire, souvent observé pour d’autres protéines transmembranaires.

Différentes protéines possédant une activité α-sécrétase ont été décrites, et en particulier plusieurs protéines de la famille ADAM [Asai 2003]. Les protéines de la famille ADAM sont des métalloprotéases transmembranaires qui contiennent un domaine de type disintégrine* et un domaine de type métalloprotéase liant le zinc [Schlondorff 1999]. Elles peuvent jouer un rôle de protéine d’adhésion et/ou d’endopeptidase. ADAM 17, aussi appelée TACE (pour Tumor Necrosis α Converting Enzyme) [Buxbaum 1998], ADAM 10 [Lammich 1999] et ADAM 9, aussi appelée MDC9 ou meltrine γ [Koike 1999] présentent une activité de type α-sécrétase : leur surexpression dans des cultures de cellules conduit à une augmentation significative de la production des fragments sAPPα, tandis que l’activité α-sécrétase est inhibée par inactivation de ces protéines ou par “gene-silencing”. Ces protéines ADAM seraient responsable du clivage de type α-sécrétase au niveau de la membrane cellulaire. Cette activité α-secrétase au sein de la membrane cellulaire est en outre augmentée par la surexpression de la cavéoline, une protéine qui s’accumule dans la face cytoplasmique des cavéoles* [Ikezu 1998]. L’α-sécrétase intracellulaire, qui agit au niveau de l’appareil de Golgi, n’a pas été clairement identifiée [Checler 2002].

β-sécrétase
Le clivage par la β-sécrétase a lieu principalement dans les compartiments de la voie de sécrétion : appareil de Golgi, vésicules de sécrétion et endosomes [Vassar 1999].

La β-sécrétase a été identifiée par différents groupes, et dénommée BACE (pour β-site APP cleaving enzyme) ou Asp2 [Hussain 1999, Sinha 1999, Vassar 1999, Yan 1999, Lin 2000]. Il s’agit d’une protéase à aspartate de la famille des pepsines, comportant un domaine N-terminal catalytique contenant deux résidus aspartate impliqués dans son activité, d’un domaine transmembranaire de 17 résidus et d’une queue cytoplasmique. BACE subit plusieurs modifications post-traductionnelles : clivage d’un propeptide, glycosylations de résidus asparagine et formation de trois ponts disulfures [Haniu 2000]. Ce motif de ponts disulfure différencie considérablement BACE des autres protéases à aspartate et semble impliqué dans la spécificité de cette enzyme vis à vis de l’APP. Dans la cellule, BACE est exprimée sous forme mature dans l’appareil de Golgi, et sa distribution subcellulaire est similaire à celle de la β-sécrétase [Vassar 1999]. Par ailleurs, une protéase à aspartate homologue, appelée BACE2 ou Asp1 [Yan 1999], présente une activité enzymatique similaire, mais est peu exprimée dans le cerveau. Notons que BACE peut cliver l’APP au niveau du résidu D1 d’Aβ, mais également en E11, décrit comme un site de clivage alternatif de l’APP et dénommé clivage β’-sécrétase [Vassar 1999, Liu 2002].

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I .
LA MALADIE D’ALZHEIMER : NEUROPATHOLOGIE, DIAGNOSTIC ET
ENJEUX THERAPEUTIQUES
INTRODUCTION
A. NEUROPATHOLOGIE DE LA MALADIE D’ALZHEIMER
A.1. Lésions amyloïdes
a. Le peptide amyloïde dérive de l’”Amyloid Precursor Protein”
b. Enzymes impliquées dans le clivage de l’APP
c. Localisation et fonctions de l’APP et de ses fragments
d. Etudes structurales des formes solubles d’Aβ
e. Caractérisation structurale des fibrilles amyloïdes
f. Processus de fibrillogenèse
g. Facteurs et partenaires critiques pour la fibrillogenèse
h. Catabolisme du peptide amyloïde
i. Effets pathogènes d’Aβ
A.2. Dégénérescences neuro-fibrillaires
a. Isoformes, modifications post-traductionnelles et fonction de la protéine tau
b. Hyper-phosphorylation de la protéine tau et déposition filamenteuse associées
à la maladie d’Alzheimer
c. Caractérisation structurale des PHFs et régions critiques pour leur formation
d. Effets pathologiques de tau
B. AMYLOÏDOPATHIE OU TAUOPATHIE ?
B.1. Données génétiques
a. Formes familiales de maladie d’Alzheimer
b. Formes familiales de tauopathies
c. Un gène facteur de risque : le gène de l’apoE
d. Modèles animaux
B.2. La cascade amyloïde
C. DIAGNOSTIC, TRAITEMENTS ACTUELS ET PISTES THERAPEUTIQUES
C.1. Diagnostic
a. Examen clinique
b. Imagerie
c. Recherche de biomarqueurs
C.2. Traitement actuel : les anticholinestérasiques
C.3. Pistes thérapeutiques
a. Ciblage des différents stades de développement de la pathologie
b. Inhibition ou modulation de la production d’Aβ
c. Inhibition de la formation des fibrilles amyloïdes
d. Chélation des métaux
e. Vaccination
f. Inhibition de la toxicité d’Aβ
g. Inhibition des dégénérescences neurofibrillaires
h. Autres approches
D. REGION N-TERMINALE 1-16 DU PEPTIDE AMYLOÏDE
MATERIELS ET METHODES.
A. Méthodologies. Principes. Rappels
A.I. METHODES DE SEPARATION
A.II. METHODES BIOCHIMIQUES D’ANALYSE
A.II.1. Séquençage d’Edman
A.II.2. Dérivation des acides aminés avant analyse par CPG
A.III. DICHROÏSME CIRCULAIRE
A.IV. RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE
A.IV.1. Rappels théoriques
a. Déplacement chimique
b. Couplages
a. RMN à deux dimensions, RMN hétéronucléaire
b. Suppression du signal du solvant
A.IV.2. Application à l’étude structurale de peptides
a. Attribution séquentielle
b. Paramètres conformationnels
A.V. MODELISATION MOLECULAIRE SOUS CONTRAINTES RMN
A.V.1. Principe
a. Expression de l’énergie intramoléculaire
b. Terme des atomes liés
c. Terme des atomes non liés
A.V.2. Méthodes de minimisation d’énergie
a. Mécanique moléculaire
b. Dynamique moléculaire
c. Recuit simulé
A.V.3. Introduction des contraintes RMN
a. Contraintes de distances déduites des NOEs
b. Contraintes angulaires
A.V.4. Validation des structures
a. Données statistiques
b. Diagramme de Ramachandran
c. Convergence des structures
A.VI. SPECTROMETRIE DE MASSE EN MODE ELECTRONEBULISATION
A.VI.1. Introduction. Méthodes de désorption-ionisation
A.VI.2. Principe de la désorption-ionisation par électronébulisation
a. Processus de nébulisation : formation des gouttelettes chargées
b. Evaporation des gouttelettes et cascade d’explosions coulombiennes
c. Libération des ions en phase gazeuse
d. Désolvatation par collisions au niveau du cône
e. Spectre ESI-MS
A.VI.3. Analyseurs utilisés
a. Analyseurs quadripolaires
b. Piège ionique quadripolaire
c. Analyseurs à résonance cyclotronique ionique et transformée de Fourier
d. Analyseur de type quadripôle-temps de vol
A.VI.4. Applications
a. Analyse structurale de peptides/protéines
b. Echange H/D
A.VII. EXPERIENCES ELISA
A.VIII. METHODES D’OBSERVATION DES FIBRILLES AMYLOIDES
A.VIII.1. Fluorescence de la thioflavine T
A.VIII.2. Microscopie électronique
B. Matériels et protocoles expérimentaux
B.I. PEPTIDES
B.II. VIEILLISSEMENT IN VITRO D’Aβ(1-16) ET Aβ(1-16)hémi
a. Vieillissement in vitro d’Aβ(1-16) à 70 °C
b. Vieillissement in vitro d’Aβ(1-16) à 37 °C
c. Vieillissement in vitro d’Aβ(1-16) et Aβ(1-16)hemi à grande échelle
B.III. IDENTIFICATION DES ESPECES MODIFIEES
a. Analyse par HPLC et spectrométrie de masse
b. Méthylation enzymatique
c. Séquençages peptidiques N-terminaux
d. Détermination de la configuration absolue des acides aminés
B.IV. ETUDE CONFORMATIONNELLE PAR DICHROÏSME CIRCULAIRE
B.V. ETUDE STRUCTURALE PAR RMN
a. Protocole général
b. Paramètres conformationnels mesurés
B.VI. MODELISATION MOLECULAIRE SOUS CONTRAINTES RMN
a. Génération des structures
b. Optimisation des structures
c. Modélisation moléculaire en coordonnées internes
d. Validation des structures
B.VII. CARACTERISATION DE L’INTERACTION NON COVALENTE D’Aβ(1-
16) AVEC LES IONS METALLIQUES PAR ESI-MS
a. Analyse des interactions non covalentes Aβ(1-16) / cations métalliques par
ESI-TQ-MS et ESI-IT-MS
b. Echange H/D sur les espèces protonées et cationisées par Zn2+
B.VIII. ETUDE DE LA RECONNAISSANCE ANTIGENE-ANTICORPS
EN PRESENCE DE CATIONS METALLIQUES
B.IX. SUIVI DE LA FIBRILLOGENESE D’Aβ(1-40)
a. Fluorescence de la thioflavine T
b. Microscopie électronique
CHAPITRE II.
VIEILLISSEMENT IN VITRO D’Aβ(1-16) ET CARACTERISATION DES
FORMES MODIFIEES
INTRODUCTION
A. VIEILLISSEMENT IN VITRO D’Aβ(1-16) et Aβ(1-16)hémi
B. CARACTERISATION DES FORMES MODIFIEES D’Aβ(1-16) ET
Aβ(1-16)hémi
B.1. Identification des formes tronquées
B.2. Identification des résidus isomérisés
a. Méthylation enzymatique
b. Séquençage N-terminal
c. Détermination de la configuration absolue des résidus aspartate
d. Bilan et identification des isomères
e. Analyse des formes modifiées d’Aβ(1-16) par ESI-MS
C. INFLUENCE DE DIFFERENTS FACTEURS SUR LA CINETIQUE DE
VIEILLISSEMENT D’Aβ(1-16)
C.1. Incubation à pH 7,4 ; 70 °C, en absence et en présence d’ions Zn2+
C.1. Incubation à pH 7,4 ; 37 °C, en absence et en présence d’ions Zn2+
DISCUSSION ET CONCLUSION
CHAPITRE III.
Aβ(1-16), DOMAINE INDEPENDANT D’Aβ CAPABLE DE PLASTICITE
CONFORMATIONNELLE. EFFETS DU VIELLISSEMENT PROTEIQUE ET
INTERACTION SPECIFIQUE AVEC LES IONS Zn2+
INTRODUCTION
A. ROLE DES IONS METALLIQUES DANS L’ETIOLOGIE DE LA
MALADIE D’ALZHEIMER
A.1. Agrégation induite par les ions métalliques
A.2. Toxicité induite par les ions métalliques
A.3. Ambivalence du rôle des ions Cu2+ et Zn2+
A.4. Données récentes sur les sites d’interaction Aβ /Cu2+ et Zn2+
B. Aβ(1-16), DOMAINE INDEPENDANT D’Aβ CAPABLE DE PLASTICITE
CONFORMATIONNELLE ET D’INTERACTION AVEC LES IONS Zn2+
B.1. Conformation d’Aβ(1-16) dans des mélanges TFE/H2O
B.2. Article 1
C. CARACTERISATION DES COMPLEXES Aβ(1-16) / CATIONS
METALLIQUES PAR ESI-MS
C.1. Article 2
C.2. Données expérimentales complémentaires
a. Influence du solvant et des conditions opératoires de la source d’ionisation
sur les spectres de masse
b. Données complémentaires sur les spectres CID
C.3. Compétitions Aβ(1-16)/Aβ(1-16)rat
C.4. Echange H/D
D. ETUDE CONFORMATIONNELLE PAR RMN
D.1. Paramètres conformationnels dans TFE/H2O 8:2 (v/v)
D.2. Etude conformationnelle en milieu aqueux
a. Mesure du pKa des histidines
b. Paramètres conformationnels en tampon Na2HPO4/NaH2PO4 à pH 7,4 :
Effet des modifications du résidu Asp7
c. Etude conformationnelle des complexes solubles Aβ(1-16)/Zn2+ et
Aβ(1-16)-L-IsoAsp7
/Zn2+
E. STRUCTURES TRIDIMENSIONNELLES D’Aβ(1-16) EN MILIEU
MIMANT LES MEMBRANES, EN MILIEU AQUEUX A pH 6.5 ET EN
PRESENCE DE Zn2+ PAR RMN ET MODELISATION MOLECULAIRE
E.1. Structure tridimensionnelle d’Aβ(1-16)unp dans TFE/H2O 8:2
E.2. Structures tridimensionnelles d’Aβ(1-16) à pH 6,5 en absence et en
présence d’ions Zn2+
CONCLUSION
CHAPITRE IV.
RECONNAISSANCE DE L’EPITOPE F4
-Y10 EN PRESENCE D’IONS Zn2+
INTRODUCTION
A. ARTICLE 3
B. DONNEES EXPERIMENTALES COMPLEMENTAIRES : ETUDE DU
COMPLEXE Biot-G5-1-16/Zn2+ PAR ESI-MS
CONCLUSION
CHAPITRE V.
FIBRILLOGENESE D’Aβ(1-40). EFFET DES IONS Zn2+ ET D’ANTICORPS
CIBLANT L’EPITOPE F4-Y10
INTRODUCTION
A. RESULTATS
A.1. Suivi de la fibrillogenèse
A.2. Effet des ions Zn2+ et des anticorps ciblant d’épitope F4-Y10 d’Aβ
B. DISCUSSION
CONCLUSION

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