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Réponse des lymphocytes T suite à la reconnaissance d’un antigène
Signalisation suite à l’engagement des TCR
Lors de la détection d’un élément étranger par les cellules de l’immunité innée, celles-ci peuvent phagocyter le pathogène, le dégrader et produire des peptides antigéniques qui sont associés aux CMH et exprimés à la surface des cellules. Les CPA professionnelles migrent ensuite vers les organes lymphoïdes secondaires où elles rencontrent des LT « naïfs » susceptibles de reconnaitre spécifiquement les antigènes présentés par les CPA. La reconnaissance des antigènes par le TCR entraine d’importants réarrangements moléculaires au sein des LT. La signalisation des cellules conduit à l’expression de gènes spécifiques entraînant la prolifération et la différenciation des cellules.
Complexes de signalisation mis en jeu lors de la reconnaissance antigénique
La reconnaissance du complexe pCMH par le TCR conduit au recrutement du corécepteur CD4 ou CD8 au voisinage du TCR (50, 51). L’association du TCR avec le pCMH entraîne des changements conformationnels des chaines intracellulaires de CD3 qui aboutissent à l’exposition des tyrosines des ITAM alors accessibles au domaine kinase des protéines LCK (52-55). LCK phosphoryle les tyrosines des ITAM, entrainant le recrutement des kinases ZAP-70 (Zeta Chain Of T Cell Receptor Associated Protein Kinase 70) qui sont ensuite phosphorylées et activées par LCK (48, 56, 57). Les kinases ZAP-70 activées phosphorylent alors des tyrosines situées sur le domaine intracytoplasmique des adaptateurs LAT. Les phosphorylations de ces adaptateurs favorisent le recrutement de plusieurs complexes moléculaires à l’origine de voies de signalisation distinctes (58, 59) (Fig. 5).
L’engagement du TCR entraine le recrutement de la kinase LCK activée par déphosphorylation de la tyrosine inhibitrice Y505 par CD45. La trans-phosphorylation de LCK conduit à la phosphorylation de la tyrosine activatrice Y394 qui stabilise la conformation active de l’enzyme. LCK est recrutée avec le CD4 (ou CD8) au TCR et phosphoryle les tyrosines des ITAM des CD3 et des chaines conduisant au recrutement de ZAP-70 aux ITAM phosphorylés. Cette kinase est activée par transphosphorylation ou par LCK. Une fois activé, ZAP-70 phosphoryle l’adaptateur LAT. Adapté de « T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded » par Brownlie et Zamoyska 2013.
Activation de LCK : LCK est une protéine kinase de la famille des Src, implantée dans la membrane plasmique par la myristoylation et palmitoylation de son extrémité N-terminale (60, 61) . Elle contient un domaine SH2, capable d’interagir avec des tyrosines phosphorylées contenues dans des motifs précis, et un domaine SH3 important dans la transmission des signaux (62-64). Ces protéines peuvent naviguer seules sous la membrane plasmique, ou associées au domaine intracellulaire des CD8 et des CD4 avec lesquelles elles interagissent via des régions riches en cystéines (65, 66). En absence de signal, la majorité des LCK sont sous conformation inactive suite à la phosphorylation par CSK de la tyrosine inhibitrice Y505 (67, 68). Cette phosphorylation conduit à une auto-inhibition de LCK par interaction de son domaine SH2 avec la tyrosine phosphorylée entrainant une conformation inactive (69-71). Suite à l’engagement des TCR, la protéine phosphatase CD45 déphosphoryle la tyrosine inhibitrice de LCK entraînant l’ouverture de la protéine dans une conformation active. LCK autophosphoryle en trans la tyrosine Y394 de son site catalytique ce qui stabilise sa conformation active (60, 72). Un autre modèle plus récent suggère qu’une fraction de LCK préexiste sous forme activée dans les cellules au repos. Dans ce modèle, l’engagement des TCR n’entraîne pas d’augmentation de l’activité de LCK mais conduit à une redistribution des protéines à proximité du TCR permettant ainsi la phosphorylation des ITAM (73). Les mécanismes permettant cette redistribution sont encore mal compris.
Recrutement de ZAP-70 : Une fois activée, LCK phosphoryle les tyrosines des ITAM des CD3 (48). Cette phosphorylation conduit au recrutement de ZAP-70 qui interagit via ses domaines SH2 avec les tyrosines phosphorylées des ITAM (57, 74, 75). La fixation de ZAP- 70 sur les ITAMs phosphorylés entraine un changement conformationnel exposant les tyrosines Y315, Y319 et Y493 de ZAP-70 qui peuvent alors être phosphorylées par les protéines kinase LCK (76-81). Les tyrosines Y315 et Y319 se trouvent sur une région flexible en amont du domaine SH2 alors que la tyrosine Y493 est localisée sur le domaine SH2 (77, 82, 83). Ces phosphorylations entrainent l’exposition du site catalytique déclenchant alors l’activation de la fonction kinase de ZAP-70 (84). Phosphorylation de LAT : Une fois activée, la protéine kinase ZAP-70 phosphoryle les tyrosines Y132, Y171, Y191 et Y226 de LAT (58, 59). LAT est une protéine transmembranaire, avec une petite région extracellulaire et une grande région intracellulaire sur laquelle se trouve les tyrosines phosphorylées par ZAP-70. La pY132 est le site d’ancrage pour la PLC- 1 (Phospho Lipase C . Les pY226 et pY191 sont essentielles pour le recrutement du facteur d’échange de guanines Vav1 à LAT. Une fois phosphorylées, les Y171, Y191 et Y226 peuvent entrainer le recrutement de l’adapteur Grb2 (Growth factor receptor-bound protein 2). Les pY191 et pY171 peuvent également interagir avec l’adaptateur GADS (Grb2-related Adaptor Downstream of Shc). Le recrutement de GADS conduit au recrutement à LAT de l’adaptateur SLP-76 (SH2 Domain-Containing Leukocyte Protein Of 76 KDa). Par ailleurs, le recrutement à LAT de Grb2 entraîne celui de SOS (Son of Sevenless) ou de THEMIS1 (Thymocyte- Expressed Molecule Involved In Selection) qui interagissent constitutivement avec l’adaptateur (85-88).
Phosphorylation de SLP-76 : SLP-76 interagit constitutivement avec les protéines PLC- 1 et GADS (89). Une fois recrutée à LAT via GADS, ZAP-70 phosphoryle SLP-76 sur plusieurs tyrosines (90). La phosphorylation de SLP-76 sur la tyrosine Y112, Y128 et Y145 conduit au recrutement d’autres protéines de signalisation telles que la kinase ITK qui est responsable de la phosphorylation de la PLC- 1 (91, 92) Ces tyrosines phosphorylées peuvent aussi conduire au recrutement de ADAP, NCK, et Vav1 (93-96). Par conséquent, la phosphorylation de LAT entraîne le recrutement d’un ensemble de complexes moléculaires à l’origine de différentes voies de signalisation.
Principales voies de signalisation
L’ensemble de ces phosphorylations déclenchent le recrutement de complexes moléculaires entrainant l’activation ou la répression de voies de signalisation distinctes.
La phosphorylation de PLC- 1 active sa fonction phospholipase qui rompt la liaison phosphodiester reliant le groupement phospho-inositol au groupement diacylglycérol du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (Pi(4,5)P2) (97). Cette hydrolyse conduit à la formation de diacylglycérol (DAG) et d’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) (98) (Fig. 6).
Voies calciques : L’IP3 peut être capté par le récepteur à l’IP3 à la surface du réticulum endoplasmique entrainant le relargage calcique depuis le réticulum endoplasmique vers le cytoplasme. Le calcium relâché dans le cytoplasme peut être capté par les domaines EF- Hand de STIM conduisant à son oligomérisation. Le complexe STIM interagit avec le canal ionique Orai1 à la membrane plasmique entrainant son ouverture et une entrée massive de calcium depuis le milieu extracellulaire (99, 100). Le flux calcique entraine l’activation du complexe calcineurin/calmodulin qui déphosphoryle le facteur de transcription NFAT et favorise ainsi sa translocation nucléaire. Au sein du noyau, en collaboration avec AP-1 qui est activé par les voies des MAPK, le complexe NFAT/AP-1 favorise l’activation de gènes essentiels à l’activation cellulaire (101). Le calcium peut aussi permettre de lever des répressions dépendantes de facteurs de transcription. La protéine DREAM, sous forme tétramère, agit comme répresseur de l’expression de certains gènes. En présence de calcium, capté par les domaines EF-Hand des protéines DREAM, un changement conformationnel conduit à la dissociation du complexe et ainsi à la levée de l’inhibition des gènes réprimés par DREAM. L’expression d’une protéine DREAM constituée de domaines EF-Hand insensibles au calcium, entraine la diminution d’expression de cytokines. Cet événement s’accompagne de la diminution de la prolifération des LT (102).
Voies des MAP kinases : Le DAG peut être capté par la région C1 présente sur certaines kinases PKC permettant la phosphorylation de la protéine RasGRP, qui permet l’échange de GDP en GTP sur les protéines Ras (103). La protéine SOS, qui est recrutée à LAT via Grb2 a aussi une fonction d’échangeur de guanine sur Ras et fonctionne en collaboration avec RasGRP (104). L’activation de Ras conduit à une cascade d’activation de kinase en phosphorylant les protéines Raf (MAPKKK) qui activent les kinases Mek (MAPKK) qui enfin activent les kinases Erk (MAPK). Les kinases Erk phosphorylent et activent Elk1 qui une fois transloquée dans le noyau active AP-1 (105). La protéine adaptatrice KSR favorise la signalisation des MAPK en regroupant les différentes protéines de la voie (106). La déficience en KSR conduit à la diminution de la phosphorylation de Erk dans les LT. Cette diminution de stimulation s’accompagne d’une diminution de la prolifération des LT (107, 108). Il est connu que BRAP régule négativement la voie des MAP kinases en inactivant la protéine adaptatrice KSR (109-111). Cependant, aucune donnée n’existe concernant la fonction de BRAP au sein des LT.
Voies NF B : Tout comme la voie des MAP kinases, le DAG peut être capté par un domaine spécifique d’une isoforme de PKC appelé PKC . PKC phosphoryle CARMA1 ce qui entraine son oligomérisation et le recrutement de BCL-10 et enfin de MALT1. Ce complexe appelé CBM conduit à l’activation de TRAF6 qui active IKK par recrutement de TAK1. L’activation de IKK permet la phosphorylation d’I B entrainant sa dégradation et la libération des protéines NF B qui étaient retenues dans le cytoplasme par I B. Les protéines NF B peuvent alors être internalisées dans le noyau où elles vont contribuer à l’expression de gènes essentiels à l’activité des LT (112, 113).
Voies PI3K/AKT : Le recrutement de la PI3K à LAT, suite à l’engagement des TCR, conduit à la phosphorylation du PIP2 (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) formant alors du PIP3 (Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate) dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Le PIP3 recrute ensuite des molécules contenant des domaines homologues pleckstrines PH telles que PDK1 et AKT. PDK1 phosphoryle AKT sur sa thréonine T308 et sérine S473 activant son groupement catalytique (114, 115). La phosphorylation par pAKT de p27, un régulateur négatif du cycle cellulaire, conduit à sa rétention et sa dégradation au sein du cytoplasme. Cela permet l’entrée des cellules dans le cycle cellulaire (116). Par ailleurs, la phosphorylation des facteurs de transcription de la famille FoxO par Akt favorise la rétention du facteur de transcription dans le cytoplasme. Les gènes régulés par FoxO tels que le facteur pro-apoptotique Bad sont alors moins exprimés conduisant à la survie et à la prolifération des cellules (117, 118).
Les voies de signalisation décrites dans cette partie sont mises en jeu lors de l’engagement des TCR par les complexes pCMH. La signalisation des TCR est aussi modulée par des corécepteurs qui peuvent être engagés par des ligands exprimés sur les cellules présentatrices d’antigènes. Le corécepteur CD28, par exemple, interagit avec ses ligands CD80 et CD86 à la surface des CPA (119, 120). La déficience en CD28 entraine la diminution de la prolifération des LT suite à une immunisation (121). Par ailleurs, la stimulation des LT sans engagement du CD28 conduit à une signalisation moins efficace et une activation plus faible des LT (122). Ces corécepteurs sont, en effet, importants dans la signalisation et dans l’activité des LT (123, 124). D’autres corécepteurs existent et peuvent jouer un rôle stimulateur ou inhibiteur dans la signalisation, l’activation et les fonctions des LT.
Synapse immunologique
Les LT « scannent » les CPA à la recherche d’un éventuel antigène auquel ils sont spécifiques (125). L’engagement du TCR, provoque l’arrêt des mouvements cellulaires et à l’élaboration d’une zone de contact cellulaire étroite entre les LT et les CPA appelée synapse immunologique (126-129). Cette structure est importante dans l’activation des LT. En plus de cette activation, elle permet la polarisation des molécules effectrices en direction des cellules cibles dont elles régulent l’activation ou l’apoptose (130-132). La synapse immunologique se caractérise par trois régions : une région centrale cSMAC (central Supramolecular Activation Cluster) dans laquelle se concentrent les TCR, les corécepteurs CD4 et CD8, d’autres corécepteurs tels que CD28 et de nombreuses protéines de signalisation, une région proximale pSMAC contenant les intégrines responsables de l’adhérence cellulaire et enfin une région distale dSMAC au sein de laquelle se trouvent des corécepteurs régulant la signalisation tels que CD43 et CD45 (133, 134) (Fig. 7A). Lors de l’engagement du TCR, le recrutement et la phosphorylation de SLP-76 entrainent le recrutement de la protéine ADAP (95, 135). ADAP interagit constitutivement avec SKAP55. RAP1GTP, la forme activée de RAP1, est produite par une RAPGEF suite à la production de DAG qui recrute PKC (136, 137). RAP1GTP interagit avec SKAP55 et conduit à l’activation des intégrines LFA-1 probablement par recrutement de RapL (138). Cette voie de signalisation, augmente l’affinité de LFA-1 pour son ligand ICAM-1 et favorise l’adhérence cellulaire et la production d’actine corticale au niveau du dSMAC (96, 139-141). Le recrutement de Vav1 à SLP-76 phosphorylée, conduit à la nucléation des fibres d’actine par activation de CDC42 et Rac1 par échange de leur GDP en GTP (142, 143). Cette activation provoque l’activation de Arp2/3 par recrutement et activation de WASP par CDC42 et de WAVE par Rac1 (144-146). L’élaboration de la synapse immunologique est fortement dépendante du cytosquelette d’actine. L’utilisation d’agents chimiques affectant les fibres d’actine compromet la formation et l’activité de la synapse immunologique (147, 148). L’actine favorise le recrutement des microsclusters de TCR au cSMAC par contraction mécanique favorisée par la protéine motrice myosine. La perte de la myosine IIA par interférence à ARNm ou traitement par les inhibiteurs Blebbistatin et ML-7 dans des LT CD4+ humains ou murins entraine la diminution de la signalisation et de l’activation des LT. Ce moteur favorise donc le mouvement des TCR vers la synapse immunologique dans des cellules primaires de souris et humaines (149-152). La formation de la synapse immunologique nécessite des réarrangements moléculaires au niveau de l’actine afin de favoriser le déplacement des molécules à la surface de la membrane plasmique. L’activation de Vav1 est associée à la diminution de la phosphorylation des protéines ERM, un complexe reliant les fibres d’actine aux protéines de la membrane plasmique. Cette déphosphorylation conduit à la solubilisation du complexe ERM et donc à la flexibilité de la synapse immunologique pour favoriser les remaniements moléculaires à la surface cellulaire.(153, 154). Les fibres d’actine et les microtubules se coordonnent dans la stabilisation et la fonction de la synapse immunologique. Le recrutement du centrosome au niveau de la zone de contact entre la CPA et le LT, est une des caractéristiques de la formation de la synapse immunologique (155-157). L’interruption des microtubules par des agents chimiques conduit au défaut de recrutement du centrosome et à la formation de conjugués instables. Bien que la sécrétion des cytokines ne soit pas affectée par l’absence de microtubule, la polarisation de ces dernières vers la cellule cible est compromise (158). Les mécanismes mis en jeu dans le recrutement du centrosome sont encore à l’étude. Mais une publication proposait qu’ADAP puisse interagir avec la dynéine et favoriser le recrutement du centrosome par « coulissement » au cours de la signalisation des intégrines (159). Les moteurs moléculaires dynéines et kinésines, se déplaçant sur les microtubules, sont impliqués dans la formation de la synapse immunologique et sa fonction. Le traitement des LT CD4+ primaires de souris par EHNA, un inhibiteur de la dynéine, ou par ARNm interférents n’entraine pas de défaut de formation des microclusters de TCR. En revanche, la relocalisation de ces clusters au cSMAC est fortement altérée. Cette inhibition de la dynéine, démontre une augmentation de la signalisation par analyse de la phosphorylation de LAT et de Erk. Cet effet est accompagné de l’augmentation de la sécrétion d’IL-2. Ces résultats démontrent l’intérêt de la dynéine dans la régulation de la signalisation probablement par le recyclage des TCR (160). Cependant, une autre publication expliquant un travail réalisé dans la lignée cellulaire Jurkat, démontre que l’interférence à ARNm de la dynéine ou l’inhibition de son interaction avec la dynactine, entraine la diminution de la signalisation. Les auteurs ont démontré la diminution de recrutement du MTOC en absence de dynéine (161, 162). L’extinction du gène kif-5, codant une kinésine dans des LT CD8+ primaires humains, démontre que KIF-5 est importante pour véhiculer les granules lytiques à la synapse immunologique (163). Par ailleurs, l’interférence
à ARNm dans la lignée cellulaire Jurkat et dans des LT CD4+ primaires humains démontre l’importance de GAKIN, une protéine de la famille des kinésines, dans la redistribution de régulateurs négatifs de la signalisation (164).
Différenciation des lymphocytes T auxiliaires
Les LT auxiliaires peuvent se différencier en Th1, Th2, Th9, Th17, Tfh ou Treg en fonction des cytokines délivrées par les CPA. La présence d’IL-12 conduit à l’expression de T-bet, un facteur de transcription responsable de la différenciation des cellules en Th1. Cela entraine, entre autres, la sécrétion d’IFN qui facilite l’activation des macrophages et déclenche la commutation de classe des récepteurs des LB. Ces Th1 entraînent le développement d’une réponse immunitaire dirigée plus spécifiquement contre les pathogènes intracellulaires. L’IL- 4 conduit à l’expression du facteur de transcription GATA3 entrainant le programme de différenciation en sous population Th2. Ces cellules secrètent de l’IL-4 et de l’IL-13 déclenchant la production d’IgE par les LB et l’activation des éosinophiles, des basophiles et des mastocytes qui facilitent l’élimination des parasites et dégradent les protéines toxiques contenues dans les venins. La présence de TGF en plus d’IL-4, peut conduire à la différenciation en une autre sous population sécrétant de l’IL-9 appelée Th9. En présence d’IL-1, d’IL-6, d’IL-23 et de TGF , les cellules expriment ROR T et IL-17. Ces cellules, appelées Th17, entraînent le développement d’une réponse spécifique dirigée contre les bactéries extracellulaires. La différenciation des cellules en Tfh est induite par la présence d’IL-6 et d’IL-21 dans le milieu extracellulaire. Dans ces cellules, le facteur de transcription BCL-6 conduit à l’expression de PD-1, CXCR4 et CXCR5 qui jouent un rôle important dans ces cellules qui sont nécessaires à la maturation des LB et à la production d’anticorps de haute affinité pour les antigènes étrangers (172).
Enfin, la population Treg est indispensable à la régulation de la réponse immunitaire. Bien qu’elle puisse provenir du thymus lors du développement des LT, elle peut aussi être induite par différenciation des LT auxiliaires en présence d’IL-2 et de TGF . Ces cytokines, conduisent à l’expression du facteur de transcription FoxP3 permettant l’expression de cytokines anti-inflammatoires IL-10, TGF et IL-35. Par ailleurs, l’expression de CTLA-4 et de PD-1 interagit avec les ligands CD80 et CD86 à la surface des CPA afin de limiter l’activation des LT. Enfin, l’expression du marqueur CD39 conduit à la conversion d’ATP en AMP qui est alors déphosphorylé par CD73 pour synthétiser de l’adénosine afin d’apaiser l’environnement inflammatoire dans lequel règne les LT (173).
Différenciation des lymphocytes T cytotoxiques
Les LT cytotoxiques se différencient majoritairement à partir des LT CD8+ naïfs une fois activés par des CPA professionnelles et en fonction des cytokines délivrées par les CPA et les LT auxiliaires. Cela se caractérise par l’expression des protéines granzymes et perforines qui ont pour fonction d’induire l’apoptose des cellules cibles (174). L’expression des cytokines TNF par les LT CD8+ activés favorise leur activité lytique (175-177). Cependant, une faible proportion des LT CD4+ peut aussi acquérir les caractéristiques cytotoxiques par expression de granzymes et de perforines (178-180).
Les mécanismes d’entrée au niveau de la jonction cortico-médullaire du thymus
Les cellules ayant acquis le profil TSP sortent de la moelle osseuse et rejoignent le thymus en quelques minutes, par la circulation sanguine, au niveau de la jonction cortico-médullaire. L’expression de CXCR4 conduit au maintien des cellules au sein de la moelle osseuse suggérant que CXCR4 doit être inactivée ou moins exprimée pour la sortie des cellules. Le blocage de CXCR4 par un antagoniste AMD3100 entraine l’enrichissement des progéniteurs lymphoïdes au sein de la circulation sanguine (194). Une fois dans les vaisseaux sanguins, les TSP expriment les récepteurs aux chimiokines CCR9, CCR7 et CXCR4. Les cellules stromales thymiques de la jonction cortico-médullaire, sécrètent des chimiokines CCL25, CCL21, CCL19 et CXCL12 spécifiques de ces récepteurs (195). Les intégrines VCAM1 et ICAM1, à la surface des cellules stromales thymiques, sont importantes pour l’introduction des cellules au niveau la jonction cortico-médullaire. L’inactivation de ces intégrines à l’aide d’anticorps anti-VCAM1 ou anti-ICAM1 compromet fortement la colonisation du thymus par les TSP (196). L’entrée des cellules au sein du thymus se fait par vague en fonction de la disponibilité des niches au sein de l’organe. L‘expression de P-sélectine par les cellules endothéliales au niveau du parenchyme thymique, conduit à l’association des TSP exprimant PSGL1 aux cellules endothéliales thymiques et est fortement régulée par la disponibilité des niches (197, 198). CD44 est exprimée à la surface des TSP et est importante pour l’entrée des cellules au sein du thymus (199). Les cellules entrant ainsi dans le thymus se différencient en ETP/DN1 par la perte du marqueur FLT-3 et séjournent une dizaine de jours près de la jonction cortico-médullaire où elles réalisent de nombreux cycles de prolifération (200).
Les CSH se différencient à partir d’hémangioblastes au sein de la moelle osseuse. Les CSH se différencient en LMPP qui sont à l’origine des CMP et CLP. Les CMP se différencient en cellules de l’immunité innée alors que les CLP se différencient en LT, LB et NK. L’interaction d’une cellule stromale de la moelle osseuse exprimant le ligand DLL-4 conduit à la spécification des CLP en TSP. Les TSP peuvent provenir de la différenciation directe des LMPP. Les TSP entrent dans le thymus grâce à PSGL et se différencient en ETP/DN1 qui progressent au sein du thymus vers les stades DP et SP.
La signalisation NOTCH est essentielle dans l’établissement du lignage T
La signalisation des récepteurs NOTCH est particulièrement importante au cours des stades précoces du développement des LT. Comme vu précédemment, elle est essentielle au sein de la moelle osseuse afin de conduire à la formation de cellules progénitrices des LT. Mais la signalisation par NOTCH est aussi importante dans le maintien du lignage T au sein du thymus. La déficience en NOTCH1 chez la souris, entraine la diminution importante du nombre de thymocytes totaux accompagnée de l’augmentation de la proportion de DN. L’accumulation des cellules au stade DN1 révèle l’augmentation de la différenciation en cellules B220+ représentatives de LB au sein du thymus (201). Il en est de même de la déficience conditionnelle pour la protéine MAML, un coactivateur transcriptionnel de la voie NOTCH, dans le modèle Vav1Cre (202). Par ailleurs, des cellules DN1 et DN2 mises en culture sur des cellules stromales OP9 se différencient en cellules DP en présence du ligand du récepteur NOTCH : DLL-1. En absence de ce ligand, les cellules DN2 et DN1 sont incapables d’atteindre le stade DP et se différencient principalement en cellules NK (203). Ces données illustrent l’importance de la signalisation NOTCH dans l’établissement du lignage T.
La signalisation NOTCH entre en compétition avec le facteur de transcription PU.1 qui favorise le développement des lignées myéloïdes (204). Par conséquent, la signalisation NOTCH est essentielle au maintien des caractères lymphoïdes en prévenant l’action du facteur de transcription PU.1 (205, 206). L’expression de PU.1 est détectable au cours du stade DN1 et DN2a, une sous population DN2 exprimant un niveau élevé de c-kit. En revanche, l’expression de PU.1 diminue au cours du stade DN2b, une sous population DN2 dont le niveau de c-kit est intermédiaire. Au cours du stade DN3, PU.1 n’est plus exprimé (193). La surexpression de PU.1 chez la souris, conduit au blocage du développement précoce au cours du stade DN2. L’analyse des cellules DN1 et DN2 démontre qu’il s’agit de cellules différenciées en cellules CD11c+ caractéristiques des cellules dendritiques (207, 208). La répression de l’expression de PU.1 est donc indispensable dans l’acquisition du lignage T. L’expression de PU.1 pourrait être réprimée par le facteur de transcription BCL11b (209). De manière intéressante, la déficience en BCL11b entraîne l’augmentation d’expression de PU.1. Le gène bcl11b est régulé positivement par TCF-1 lui-même induit par la signalisation NOTCH (210). La déficience en BCL11b conduit à un phénotype similaire à celui observé dans le cas de surexpression de PU.1 (211). Par ailleurs, la signalisation NOTCH conduit à la mise en jeu d’autres facteurs de transcription essentiels à l’établissement du lignage T comme GATA-3. GATA-3 est important lors du développement précoce des LT car il réprime la différenciation en LB et en NK (212, 213) (Fig. 10).
La -sélection : l’étape initiale dans l’élaboration d’un répertoire T
Une fois dans la zone subcapsullaire du thymus, les cellules perdent l’expression de CD44 et constituent la population DN3 (CD44- CD25+). Les cellules DN3a caractérisent la population DN3 pré- -sélection. Celles-ci arrêtent de proliférer puis réarrangent les gènes codant pour la chaine du TCR qui s’associe à une chaine invariante pT . Le bon arrangement de la chaine du TCR ainsi que son association avec le pT , déclenche des signaux intracellulaires entrainant l’expression de protéines, favorisant la survie cellulaire et induisant la prolifération des cellules DN3b, post- -sélection. La prolifération des cellules conduit à l’expansion des cellules exprimant une chaine du TCR fonctionnelle, c’est-à-dire capable d’adopter une conformation favorable à la signalisation. La prolifération s’accompagne de la perte d’expression de CD25 caractéristique de la population DN4 (CD44- CD25-).
Expression du pre-TCR
Déclenchement de la recombinaison du TCR
Les cellules DN1 et DN2 réalisent de nombreux cycles de prolifération dans le thymus mais cette prolifération cesse au début du stade DN3 avant le réarrangement de la chaine du TCR. Les facteurs de transcription E2A et HEB sont nécessaires à l’arrêt des cycles prolifératifs. En effet, la déficience en E2A et HEB dans un modèle LCKCre conduit à un blocage majeur du développement des LT entre les stades DN et DP. De manière intéressante, la déficience pour ces protéines n’entraîne pas l’accumulation d’une sous population particulière de cellules doubles négatives. La prolifération des cellules DN3 est néanmoins augmentée en absence de ces protéines lors de l’analyse de la dilution du BrdU. E2A et HEB favorise l’expression de la protéine p18 et la répression de la protéine p27. La déficience en p18, conduit à l’augmentation de la prolifération des cellules DN. Contrairement à la déficience en E2A et HEB (214), la déficience en p18 ne bloque pas le développement des LT (215). La surexpression de p27, en revanche, entraîne un blocage de la transition DN-DP (216). Ces données suggèrent que l’expression de E2A et HEB, induit par la signalisation NOTCH, conduit à la répression de p27 et à l’expression de p18. Ces deux protéines régulent l’entrée des cellules dans le cycle cellulaire avant le réarrangement de la chaine du TCR. L’expression des sous unités du complexe RAG au cours des stades précoces du développement des LT est indispensable pour déclencher le réarrangement de la chaine du TCR. La déficience en RAG compromet fortement le développement des LT qui sont bloqués au stade DN3 par défaut d’expression du pre-TCR (217, 218). L’expression de RAG débute au cours du stade DN2 (28) et pourrait être une des conséquences de la diminution d’expression de PU.1. La surexpression de PU.1 conduit à la diminution d’expression de RAG1. L’effet de PU.1 sur RAG est atténué suite à la stimulation des cellules par un ligand DLL. Ces résultats suggèrent que la signalisation NOTCH peut favoriser l’expression des sous unités de RAG en diminuant l’expression ou en dominant l’activité de PU.1 (204, 219). Chez la souris la déficience en BCL11b ne s’accompagne pas de la diminution d’expression de RAG1 (211) au contraire de chez l’homme (220). La diminution d’expression de PU.1 favorise l’expression du facteur de transcription c-myb qui se fixe sur le promoteur du gène codant RAG et régule positivement son expression.
L’expression des autres protéines impliquées dans la recombinaison est aussi finement régulée. Par exemple, les expressions de l’ADN ligase XRCC4, Artemis et KU70/80 sont régulées par le facteur de transcription GABP (221). La déficience en GABP conduit à un blocage au cours des stades précoces du développement des LT similaire à la déficience en Artemis, XRCC4, KU80 et KU70 (222-224).
La signalisation NOTCH conduit à l’expression de BCL11b qui active l’expression du gène ets-1 (211, 225-227). ETS-1 s’associe à Runx et se fixe sur le promoteur E entrainant son activation (228-230). Le recrutement de ETS-1 et Runx sur la séquence E favorise la recombinaison de la chaine du TCR. La recombinaison ordonnée de la chaine du TCR peut être régulée par le complexe c-fos permettant le recrutement des protéines RAG aux séquences RSS. Le domaine d’interaction de la sous-unité AP-1 de c-fos se trouve dans la région 3’RSS de D favorisant la recombinaison D J et bloquant la recombinaison V - D et V -J (231) (Fig. 10)
Signalisations issues du pre-TCR
Les chaines pT et TCR sont associées aux dimères de CD3 au sein du réticulum endoplasmique. Les chaines CD3 sont cruciales comme le montre le blocage de la transition DN-DP chez des souris déficientes pour certains CD3 (237). La signalisation issue des pré- TCR est similaire à la signalisation des TCR. Elle implique la protéine LCK qui déclenche la signalisation. La déficience en LCK entraîne un blocage du développement des LT au stade DN3 (238-240). La déficience en LAT conduit au même phénotype (241, 242). La déficience en ZAP-70 n’affecte pas dramatiquement le développement T sauf lorsqu’elle est associée à la délétion en SYK une protéine kinase appartenant à la même famille moléculaire que ZAP-70. Ces résultats démontrent que les cibles de LCK : ZAP-70 et SYK sont essentielles à la signalisation du pre-TCR (243). La déficience en Grb2 ne bloque pas les cellules au stade DN (244). Il est fortement possible que la perte de Grb2 soit compensée par d’autres protéines de signalisation comme Vav1 ou SLP-76. D’ailleurs, la déficience en Vav1 conduit à l’augmentation de la proportion de cellules DN et particulièrement DN3. Cette augmentation est plus importante lors des délétions concomitantes de Vav1, Vav2 et Vav3 (245). Des résultats similaires ont été observés dans le cas de la déficience en SLP-76 (246). La signalisation du pre-TCR est donc essentielle dans la progression des cellules DN en DP (247, 248).
Déclenchement de la signalisation du pre-TCR
La signalisation des pre-TCR, contrairement à celle des TCR, ne nécessite pas la fixation d’un ligand. En effet, la délétion de l’ensemble des régions extracellulaires du pre-TCR n’empêche pas le progression des cellules vers le stade tardif du développement des LT (249). De façon surprenante, la délétion seule de la région extracellulaire de pT , de la chaine ou de résidus impliqués dans l’oligomérisation des deux chaines affectent le développement des thymocytes précoces (249, 250). Il est donc possible que la région extracellulaire du pT permette de stabiliser la chaine du TCR dans une conformation favorable à la signalisation. C’est la bonne association de la chaine avec le pT qui conduit à la signalisation des pre-TCR. Cependant, de récentes études suggèrent que le CMH, exprimé par les cellules stromales thymiques, pourrait être impliqué dans la signalisation des pre-TCR. Des expériences de spectroscopie RMN révèlent que le pre-TCR est capable d’interagir avec le CMH qui induit des réarrangements structuraux du pre-TCR. Par ailleurs, la culture de DN3 sur une lignée de cellules stromales OP9 déficientes en 2m, une sous unité du CMH-I, conduit à une diminution non négligeable de la prolifération des cellules (251, 252).
Fonctions de la chaine pT dans la signalisation
La délétion de la région riche en proline située sur le domaine intracytoplasmique de la chaîne pT entraîne un phénotype similaire à celui obtenu dans les souris déficientes en pT avec une accumulation des cellules au stade DN. Ceci s’accompagne d’une diminution de la prolifération des cellules exprimant le chaine du TCR et une augmentation de l’apoptose (248). Dans une lignée de LT humain, la délétion de cette région riche en proline entraine l’effondrement de flux calcique. Cette région permettrait le recrutement des adaptateurs moléculaires CMS et CIN85. Ces résultats suggèrent que la région riche en proline de la chaine pT est impliquée dans la signalisation de la -sélection (253). Le pre-TCR est constamment internalisé par endocytose et s’accumule dans les lysosomes comme le démontrent des analyses d’imagerie (254). La transfection de constructions conduisant à l’expression de CD25 ou CD4 fusionnés à la chaine intracellulaire de pT entraine l’augmentation de CD4 et CD25 intracytoplasmiques démontrant la fonction de la chaine intracellulaire de pT dans l’endocytose du pre-TCR (255). L’adaptateur CMS colocalise avec le cytosquelette d’actine au cours de l’endocytose du pT (253) La signalisation induite par le pT est responsable de l’endocytose permanente du pre-TCR. L’utilisation d’inhibiteurs de Src kinase comme LCK dans des cellules Jurkats transfectées par le pre- TCR restaure partiellement l’expression à la surface du pre-TCR. Le même résultat est obtenu lorsque les Jurkats exprimant un TCR chimère pour lequel la chaine est fusionnée à la région cytoplasmique du pT (256). Bien que le pre-TCR soit internalisé et soit localisé majoritairement dans les lysosomes, l’inhibition du protéasome conduit à une augmentation non négligeable de l’expression du pre-TCR. L’activation des Src déclenche l’ubiquitination du pre-TCR par c-Cbl pour favoriser sa dégradation (254).
La chaine pT semble avoir une fonction unique dans la signalisation du pre-TCR. En effet, son remplacement par une chaine du TCR entraine un défaut de la -sélection (257, 258).
Signaux de survie
La signalisation du pre-TCR déclenche aussi l’expression du récepteur à l’IL-7 (IL7-R). La déficience pour ce récepteur entraine l’apoptose des cellules après la -sélection (259). L’interaction de l’IL-7 avec son récepteur entraine l’activation des kinases Jak3 puis des facteurs de transcription STAT5. L’association de STAT5 et de NFAT déclenche l’expression du facteur anti-apoptotique BCL-2 important dans la survie des thymocytes doubles négatifs (260). La déficience en NFAT entraine la diminution d’expression de BCL-2 et compromet fortement la survie cellulaire suite à la -sélection (261). L’expression ectopique de BCL-2 dans des souris déficientes pour IL7-R restaure partiellement le développement précoce de LT. L’activation de STAT5, en plus d’induire l’expression de BCL-2, conduit à la répression de BCL-6. L’absence de BCL-6 dans des souris déficientes pour l’IL7-R favorise la prolifération et la survie des DN4 (262). La signalisation des pre-TCR entraîne aussi l’activation de la voie de NF- b et l’expression de BCL-2A1. BCL-2A1 favorise la survie des cellules en inhibant la caspase-3. La transduction du gène bcl2a1 dans des cellules déficientes pour RAG restaure la survie des cellules (263). Des études démontrent que l’absence de signalisation par les pre-TCR conduit à l’expression de Bid et Bim suite à l’action de p53 et Foxo3. L’activation du pre-TCR entraine l’activation des kinases Akt qui phosphoryle Foxo3 et prévient ainsi la transactivation du gène bim. La déficience en Bid ou Bim dans des souris n’exprimant pas de pre-TCR conduit à une augmentation de la survie des cellules DN (264). Par ailleurs, la déficience concomitante de Akt1, Akt2 et Akt3 entraine le blocage de la transition DN à DP avec l’accumulation des cellules au stade DN3 et DN4 (265). La survie des cellules est aussi étroitement liée à la signalisation NOTCH induite entre les thymocytes et les cellules stromales. La survie des cellules déficientes pour RAG est supérieure lorsque celles-ci sont en culture sur des cellules OP9 exprimant le ligand DLL-4. La signalisation NOTCH déclenche l’expression de facteurs importants dans le remaniement métabolique essentiel à la survie et la prolifération (266) (Fig. 12).
Induction de la prolifération cellulaire
La signalisation du pre-TCR conduit à l’expression du récepteur à la transferrine CD71. Ce récepteur est important car il contribue aux évènements métaboliques essentiels à la prolifération cellulaire. Le traitement de cellules en culture par un anticorps anti-CD71 réduit fortement la capacité des cellules à atteindre le stade DP (267). De plus, la signalisation du pre-TCR conduit à la phosphorylation de ShcA qui entraîne l’expression du facteur de transcription Egr, un activateur du facteur de transcription Id3. L’activation de ce dernier inhibe les fonctions répressives de E2A et HEB sur la prolifération des cellules (268) (Fig. 10). L’activation de ShcA favorise aussi l’expression de c-myc, un oncogène se fixant à de nombreux promoteurs, régulant l’expression de gènes essentiels à la duplication de l’ADN. c-myc est donc une protéine essentielle à l’entrée des cellules en phase S, la phase de réplication de l’ADN (269, 270) (Fig. 12). L’expression de c-myc dans des cellules déficientes en RAG restaure la prolifération des DN3 mais n’entraîne pas la différenciation des cellules en DP. L’expression de c-myc est régulée positivement par la signalisation NOTCH, qui induit de cette façon la prolifération des cellules après la -sélection (271). Une publication récente démontre que la prolifération des DN3 n’est pas symétrique. La division asymétrique des DN3 conduirait à la formation de DN3b (DN3 ayant passé la -sélection) tout en conservant des cellules ayant les caractéristiques DN3a. Le défaut de Scribble, une protéine impliquée dans la polarisation cellulaire, conduit à l’augmentation de la proportion de cellules DN4 suite à la diminution de l’asymétrie des divisions. Les auteurs proposent que les divisions asymétriques permettent aux cellules d’acquérir des caractéristiques différentes leur permettant de progresser vers le stade DN4 ou de persister au sein du stade DN3. Certaines cellules recevraient une quantité importante de BCL-2A1 leur permettant de survivre et de progresser vers le stade DN4, d’autres auraient une quantité importante de BCL-2 permettant la survie au stade DN3 (272).
Transition vers le stade double positif
Le passage au stade double positif se caractérise par l’expression coordonnée des corécepteurs CD4 et CD8 et par l’expression de la chaine du TCR qui fait suite à la dégradation de la chaine pT .
Expression des corécepteurs CD4 et CD8
Chez la souris, la -sélection conduit à l’expression du corécepteur CD8 à un stade intermédiaire entre DN et DP appelé ISP (274). Chez l’homme, c’est le corécepteur CD4 qui est exprimé au stade ISP (275). Chez la souris, l’analyse de l’accessibilité des gènes révèle que les gènes cd8 deviennent accessibles à partir du stade DN3, après la -sélection (276). L’expression de CD8 est maintenue sous silence par le facteur de transcription MAZR au cours des stades DN mais Ikaros favorise l’expression de CD8 en induisant l’accessibilité aux gènes (276-278). Ce n’est qu’après le stade ISP que se fait la co-expression de CD4 et CD8. Tout comme les cellules doubles négatives, les cellules ISP réalisent de nombreux cycles de prolifération. La signalisation NOTCH est importante dans la prolifération des ISP mais n’est pas plus mise en jeu au cours des stades ultérieurs du développement (274). Chez la souris, Mi-2 est recrutée à la région enhancer du gène cd4 et conduit au recrutement d’une histone acétyltransférase catalysant l’hyperacétylation du gène cd4. Cette hyperacétylation favorise l’expression de CD4. La déficience en Mi-2 conduit au blocage du développement au stade ISP (279).
Déclenchement de la recombinaison de la chaine du TCR
Comme pour les réarrangements de la chaine du TCR, les réarrangements de la chaine nécessitent la mise en jeu des RAG et de la machinerie de réparation de l’ADN. La signalisation du pre-TCR déclenche la recombinaison de la chaine du TCR en activant la région enhancer E . En effet, le traitement avec la ionomycine, un inducteur de flux calcique, entraine l’augmentation de la transcription de tcra dans des lignées cellulaires correspondant à DN3a. Par ailleurs, le traitement des cellules avec un inhibiteur de la voie des MAPK bloque l’expression du tcra après stimulation (280). L’expression du pre-TCR conduit à l’expression des facteurs de transcription Erg1, Erg2 et Erg3 qui se fixent avec NFAT et AP-1 sur la région enhancer E pour déclencher la recombinaison V -J (280). Ikaros est aussi important dans le réarrangement de la chaine du TCR. La lignée de thymome murine JE131 déficiente pour ikaros présente un phénotype DN3 qui exprime le pre-TCR mais qui est incapable de réarranger les gènes codant pour la chaine . L’expression d’Ikaros dans cette lignée restaure l’expression normale de la chaine . La fixation d’Ikaros au complexe SWI/SNF au niveau de la séquence E favorise la recombinaison V -J en inhibant l’action répressive de Mi-2 (281). La signalisation du pre-TCR entraine la diminution d’expression des RAG. Or le réarrangement de la chaine nécessite l’expression du complexe RAG et est dépendant de la signalisation du pre-TCR. Des mécanismes complexes de régulation sont probablement mis en place dans la transition entre le réarrangement de la chaine et de la chaine (30). Comme pour le pre-TCR, la signalisation déclenchée par les TCR conduit à l’exclusion allélique de l’allèle non réarrangé. Elle entraîne aussi l’arrêt d’expression des RAG et des modifications épigénétiques qui empêchent la recombinaison d’avoir lieu (282).
Du pré-TCR au TCR
Selon Trop et al, l’expression de la chaine du TCR ne nécessite pas la dégradation ou l’absence d’expression du pT En effet, la chaine du TCR entre en compétition avec le pT pour son expression à la membrane plasmique. La chaine pT n’est pas exprimée à la membrane plasmique lorsqu’elle est co-exprimée dans une lignée cellulaire avec la chaine . Son expression est cependant détectée dans le cytoplasme (283). Par ailleurs, il a été démontré que Ikaros interfère avec le domaine intracellulaire de NOTCH NICD et bloque ainsi l’expression de la chaine pT (284).
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
I. Le récepteur des lymphocytes T
1. Structure des récepteurs des lymphocytes T
1.1. La région transmembranaire
1.2. Les domaines extracellulaires
1.3. Les domaines intracellulaires
2. La recombinaison V(D)J
2.1. Mécanismes biochimiques de la recombinaison
2.2. Régulation de la recombinaison
II. Les corécepteurs CD4 et CD8
III. Réponse des lymphocytes T suite à la reconnaissance d’un antigène
1. Signalisation suite à l’engagement des TCR
1.1. Complexes de signalisation mis en jeu lors de la reconnaissance antigénique
1.2. Principales voies de signalisation
1.3. Synapse immunologique
2. Différenciation des lymphocytes T
2.1. Différenciation des lymphocytes T auxiliaires
2.2. Différenciation des lymphocytes T cytotoxiques
2.3. Différenciation en lymphocytes T mémoires
CHAPITRE I : LE DEVELOPPEMENT PRECOCE DES LYMPHOCYTES T
I. La différenciation des précurseurs des lymphocytes T dans la moelle osseuse
1. Origine des cellules souches hématopoïétiques
2. Différenciation des CSH vers le lignage lymphocytaire T
II. Acquisition du lignage T définitif au sein du thymus
1. Les mécanismes d’entrée au niveau de la jonction cortico-‐médullaire du thymus
2. La signalisation NOTCH est essentielle dans l’établissement du lignage T
III. La -‐sélection : l’étape initiale dans l’élaboration d’un répertoire T
1. Expression du pre-‐TCR
1.1. Déclenchement de la recombinaison du TCR
1.2. Expression de la chaine pT
2. Signalisations issues du pre-‐TCR
2.1. Déclenchement de la signalisation du pre-‐TCR
2.2. Fonctions de la chaine pT dans la signalisation
2.3. Signaux de survie
2.4. Induction de la prolifération cellulaire
2.5. Exclusion allélique
IV. Transition vers le stade double positif
1. Expression des corécepteurs CD4 et CD8
2. Déclenchement de la recombinaison de la chaine du TCR
3. Du pré-‐TCR au TCR
CHAPITRE II : LE DEVELOPPEMENT TARDIF DES LYMPHOCYTES T
I. Les sélections clonales au sein du cortex thymique
1. Présentation de peptides par les cTEC
2. Signaux de survie induits par la sélection positive
3. Transition des stades DP à SP
3.1. Choix du lignage CD4 et CD8
3.2. Acteurs mis en jeu dans la différenciation en CD4 ou CD8 SP
II. La sélection négative au sein de la médulla
1. Expression des TRA (tissue-‐restricted antigens)
2. Régulation de la survie cellulaire par la force du signal
III. THEMIS, une protéine importante dans les mécanismes de sélection
1. Rôles physiologiques de THEMIS dans les lymphocytes T
2. Fonctions de THEMIS dans la signalisation des TCR
2.1. THEMIS est un régulateur négatif de la signalisation
2.2. THEMIS est un régulateur positif de la signalisation
3. Régulation de THEMIS
3.1. Régulation de son expression
3.2. Régulation de son activité et de sa localisation
CHAPITRE III : LIS1, UNE MOLECULE INDISPENSABLE DANS LA VIE CELLULAIRE
I. Effets physiologiques associés à la perte ou au gain d’expression de Lis1
1. Conséquences neurologiques
2. Développement tumoral
3. Conséquences immunitaires de la perte d’expression de Lis1
II. Fonctions moléculaires
1. Régulation du complexe PAFAH-‐1B
1.1. Le complexe PAFAH-‐1B
1.2. Rôle de Lis1 dans la fonction enzymatique de PAFAH-‐1B
2. Régulation de la Dynéine
2.1. Généralités sur dynéine
2.2. Régulation de l’activité motrice
III. Fonctions cellulaires
1. Lis1 dans la migration cellulaire
1.1. Recrutement et polymérisation d’actine corticale
1.2. Adhérence des cellules et adhérence focale
1.3. Mouvement d’organites au cours de la migration
2. Régulation de la division cellulaire
2.1. Fonctions de Lis1 au cours de la phase G2 du cycle cellulaire
2.2. Fonctions de Lis1 dans le déroulement de la mitose
3. Transport d’organelles
4. Transport et recyclage des molécules
4.1. Transport d’ARNm
4.2. Transport de protéines
5. Lis1 au sein dans la signalisation cellulaire
IV. Régulation de Lis1
1. Régulation d’expression génique
2. Régulation post-‐transcriptionnelle
3. Modifications post-‐traductionnelles
3.1. Phosphorylation
3.2. Sumoylation et ubiquitination
4. Régulation spatiale et de sa stabilité
4.1. Stabilité fonctionnelle
4.2. Stabilité structurale
4.3. Régulation spatiale
V. Lis1 dans le système immunitaire
1. Fonctions de Lis1 dans les lignées hématopoïétiques
2. Rôles de Lis1 dans la fonction des lymphocytes B
3. Rôles de Lis1 dans la fonction des lymphocytes T
OBJECTIFS DE LA THESE
RESULTATS
DISCUSSION
CONCLUSION
ANNEXES
PORTFOLIO
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