AMIN-90-OM
L’interférence ARN (ARNi)
L’interférence ARN est un processus d’inhibition de l’expression de gènes cibles spécifiques de la séquence, déclenché par des petits ARN double brin (Sharp, 1999 ; Gitlin et al., 2002 ; Hannon, 2002). Ce mécanisme, hautement conservé entre espèces (Elbashir et al., 2001a ; Kim et al., 2005), semble avoir un rôle naturel dans la régulation fine des gènes y compris ceux étrangers à la cellule comme les éléments transposables et les gènes viraux (Carmichael, 2002 ; Ding et al., 2004 ; Saksela, 2003). L’ARNi constitue actuellement la méthode de choix pour l’extinction spécifique de l’expression d’un gène dans le but d’étudier sa fonction ou de traiter une maladie liée à ce gène (Sharp, 1999 ; Hannon, 2002).
Historique
Le phénomène de l’interférence ARN a été découvert par l’équipe de Richard Jorgensen dès les années 1990 lors de ses recherches sur les mécanismes de coloration de pétunias (Napoli et al., 1990). Afin d’obtenir un renforcement de la coloration des fleurs, les botanistes ont introduit dans le génome de pétunias des copie du gène CHS (chalcone synthase) responsable de la pigmentation. Ils eurent la surprise de constater qu’au lieu d’obtenir la couleur pourpre attendue, la plupart des plantes exprimait des fleurs partiellement ou totalement blanches (Figure 14 ; Napoli et al., 1990). L’analyse des ARNs isolés à partir des fleurs blanches a montré que les ARNm correspondant au gène d’intérêt étaient présents en quantité beaucoup plus faible que dans les fleurs contrôles. Ainsi, non seulement l’expression du transgène était dérégulée, mais également celle de l’endogène homologue. À l’époque, ce phénomène fut qualifié de co-suppression. Quelques temps plus tard, des études similaires sur les champignons Neurospora crassa, aboutirent aux mêmes effets : ainsi, l’ajout de séquences géniques supplémentaires du gène albino-1 impliqué dans la biosynthèse du carotène, aboutissait à l’extinction de leur expression (Cogoni et al., 1996 ; Cogoni & Macino, 1997).
Le phénomène fut observé dans le règne animal lors d’études visant à inhiber la fonction d’un gène chez le nématode Caenorhabditis elegans à l’aide d’ARN antisens (Guo et Kemphues, 1995). Les ARN antisens se lient à des régions spécifiques (complémentaires) dans l’ARNm afin de bloquer la transcription. Les auteurs constatèrent que des ARN sens étaient aussi efficaces pour inhiber l’expression du gène cible que les ARN antisens. Cette observation fut élucidée par le groupe d’Andrew Fire et Craig Mello sur le nématode C. elegans (Fire et al., 1998). Ces auteurs démontrèrent que le mécanisme de l’extinction des gènes observés chez les végétaux et les nématodes est la conséquence de l’introduction dans les organismes d’ARN double brin complémentaire des gènes. Ce phénomène fut alors appelé interférence ARN (ARNi) et récompensé en 2006 par le prix Nobel de médecine.
A première vue, il semblait peu probable que ce mécanisme existe chez les mammifères. En effet, l’introduction d’ARN double brin dans les cellules provoque une forte réponse en interféron de type 1 (IF-1), non spécifique, induite par des mécanismes de protection cellulaire associés à l’activation des récepteurs TLR (toll like receptor). Ce n’est qu’en 2001 qu’Elbashir et al. montrèrent que la machinerie cellulaire impliquée dans le mécanisme de l’ARNi était possible chez les mammifères, car la production de l’IF-1 est dépendante de la taille de l’ARN double brin introduit (Elbashir et al., 2001a). De fait, l’introduction directe dans les cellules de mammifères d’oligonucléotides courts (de 21 à 23 bases), appelés siARN (small interfering RNA), pouvait bloquer spécifiquement l’expression du gène cible sans déclencher de réponse antivirale de type interféron. Depuis, d’autres études ont mis en évidence ce mécanisme dans d’autres espèces : les insectes (Kennerdell & Carthew, 1998), la grenouille (Oelgeschlager et al., 2000), la souris (Svoboda e al., 2000 ; Wianny & Zernicka-Goetz, 2000), entre autres.
Au-delà des siARNs, d’autres petits ARNs interférents appelés micro ARNs (miARN) ont été découverts. Ils sont fabriqués par la cellule elle-même à partir de son propre génome (Novina & Sharp, 2004). Ces miARNs proviennent de régions de l’ADN non codantes. Les miARNs utilisent le même système enzymatique que les siARNs et ont pour rôle d’inhiber la synthèse protéique en se liant à l’ARNm qui ne peut plus, dès lors, remplir son rôle. Un grand nombre de miARNs a été trouvé dans plusieurs organismes. On évalue leur nombre dans le génome humain à plusieurs centaines et leurs fonctions restent pour la plupart à élucider.
Mécanisme d’interférence par les siARN
Le principe général du mécanisme de l’interférence ARN est relativement simple et comporte deux phases principales : la phase d’initiation se produit dans le cytoplasme des cellules et consiste en la production de petits ARNs interférents à partir d’un ARNdb exogène ou d’un microARN. Dans cette phase, l’ARN double brin est reconnu par DICER, une endonucléase membre de la famille des ARNases III, qui le clive en petits fragments d’ARN, de 21 à 25 nucléotides avec des extrémités 3’ symétriques comportant deux nucléotides flottants (Figure 15 ; Hamilton & Baulcombe, 1999 ; Hammond et al., 2000 ; Zamore et al., 2000 ; Bernstein et al., 2001 ; Hamilton et al., 2002). DICER n’agit pas sur une séquence spécifique, mais sur toute ARNdb. Les cations Mg2+ stabilisent la dimérisation du complexe DICER/ARNdb permettant que ce clivage s’effectue préférentiellement à l’extrémité la plus instable de l’ARNdb (Tuschl & Borkhardt, 2002).
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Table des matières
REMERCIEMENTS
ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
1 INTRODUCTION
2 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
2.1 LES MORBILLIVIRUS
2.1.1 Classification
2.1.2 Structure virale et organisation génomique
2.1.3 Les protéines virales
2.1.3.1 Les protéines structurales
2.1.3.1.1 La nucléoprotéine (N)
2.1.3.1.2 La phosphoprotéine (P)
2.1.3.1.3 La polymérase (L)
2.1.3.1.4 La protéine de matrice (M)
2.1.3.1.5 L’hémagglutinine (H)
2.1.3.1.6 La protéine de fusion (F)
2.1.3.2 Les protéines non structurales
2.1.3.2.1 La protéine C
2.1.3.2.2 La protéine V
2.1.4 Réplication virale
2.1.5 Propriétés physico-chimiques
2.1.6 Morbillivirus des humains
2.1.6.1 Virus de la rougeole (measles virus – MV)
2.1.7 Morbillivirus des ruminants
2.1.7.1 Virus de la peste bovine (PBV) ou rinderpest virus (RPV)
2.1.7.2 Virus de la peste des petits ruminants (PPRV)
2.1.7.2.1 Description de la maladie
2.1.7.2.2 Répartition géographique
2.1.7.2.3 Epidémiologie
2.1.7.2.4 Pathogénie
2.1.7.2.5 Diagnostic
2.1.7.2.6 Contrôle et traitements
2.2 L’INTERFERENCE ARN (ARNI)
2.2.1 Historique
2.2.2 Mécanisme d’interférence par les siARN
2.2.3 Le choix de la séquence cible des siARNs
2.2.4 Applications de l’interférence ARN
2.2.5 L’interférence ARN comme lutte antivirale
2.2.6 Les difficultés à surmonter dans l’utilisation de l’interférence ARN
2.2.6.1 Les réponses interféron
2.2.6.2 Effet hors-cible (off-targets) des siARNs
2.2.6.3 Suppresseurs viraux de l’ARNi
2.2.6.4 Saturation des composants de la voie endogène de l’ARNi
2.2.6.5 La délivrance in vivo
2.2.6.6 Emergence des virus d’échappement
3 PROBLEMATIQUE ET OBJETIF
4 MATERIELS ET METHODES
4.1 CELLULES, VIRUS, ET SIARNS
4.2 TRANSFECTION DES SIARNS ET INFECTION VIRALE
4.3 IMMUNOFLUORESCENCE (IF)
4.4 EVALUATION DE L’EFFICACITE DES SIARNS (SINPPRV1, SINPPRV6 ET SINPPRV7) FACE AUX SOUCHES SAUVAGES DE PPRV DISPONIBLES AU LABORATOIRE DE VIROLOGIE DU CIRAD
4.5 EXTRACTION DE L’ARN TOTAL, RT-PCR ET SEQUENÇAGE
4.6 HIGH RESOLUTION MELTING REAL-TIME PCR (PCR-HRM)
4.7 VERIFICATION DU ROLE DES MUTATIONS/DELETION DANS LA RESISTANCE A L’INTERFERENCE ARN
4.8 ALIGNEMENTS
4.9 ANALYSES DES SEQUENCES
4.10 ANALYSES STATISTIQUES
5 RESULTATS
5.1 EFFET DOSE DEPENDANT DES SIARNS CIBLANT DES REGIONS CONSERVEES DU GENE N
5.2 EVALUATION DE L’EFFICACITE DES SIARNS (SINPPRV1, SINPPRV6 ET SINPPRV7) FACE AUX SOUCHES SAUVAGES DE PPRV DISPONIBLES AU LABORATOIRE DE VIROLOGIE DU CIRAD
5.3 EMERGENCE DES MUTANTS D’ECHAPPEMENT
5.4 CINETIQUE D’APPARITION ET DE MULTIPLICATION DES MUTANTS
5.5 CONFIRMATION DU ROLE DES MUTATIONS ET DE LA DELETION DANS L’ECHAPPEMENT AU SINPPRV1
5.6 CONSERVATION DES ZONES CIBLES ET FLANQUANTES DES SIARNS
5.7 ANALYSE DE LA VARIABILITE GENOMIQUE INDUITE PAR LES SIARNS
5.7.1 Analyse dN/dS
5.7.2 Reconstruction phylogénétique (approche bayésienne) et horloge moléculaire
5.7.3 Analyse factorielle multiple (AFM)
5.7.4 Analyse de survie
6 DISCUSSION
7 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
PUBLICATIONS EN RAPPORT AVEC LA THESE
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