L’immunité innée lors d’infections par le virus Influenza
UCP2 influe sur la réponse immunitaire
Létude de Rousset et al. (2006) a démontré que des souris déficientes en UCP2 ont une réponse immunitaire innée plus efficace que les souris sauvages et sont plus résistantes aux infections par Listeria monocytogenes. En effet, labsence dUCP2 lors dinfection par cette bactérie permettrait un meilleur recrutement de cellules effectrices de limmunité innée par une augmentation de synthèse de CCL2. Une autre étude (Blanc 2003) montre que les lésions dathérosclérose (lésions dues à laccumulation de macrophages) sont plus importantes chez des souris homozygotes UCP2(-/-) car les lésions contiennent un nombre plus important de macrophages du fait du meilleur recrutement de ces cellules. UCP2 peut aussi moduler directement lactivité des cellules immunitaires et notamment des macrophages : les macrophages nexprimant pas UCP2 éliminent plus facilement Toxoplasma gondii et Salmonella typhimurium que les macrophages des souris sauvages (Emre, Nübel 2010). Ces mêmes auteurs ont montré que la reconnaissance des LPS par TLR4 au niveau du macrophage active les voies de signalisation de ERK (extracellular signal-regulated kinases), JNK et p38. Ces deux dernières voies vont aboutir à une réponse inflammatoire mais aussi à une
diminution de lexpression dUCP2 qui va augmenter la production de ROS qui à leur tour vont activer les voies dERK et p38 pour une réponse inflammatoire augmentée.
Ainsi, UCP2 contribue à la régulation de la réponse inflammatoire macrophagique (Fig.17) (Emre et al. 2007).
Obtention de cellules A549 mutantes par la technique CRISPR/Cas9
Nous avons choisi de réaliser nos expériences dans les cellules A549, une lignée cellulaire issue dadénocarcinome humain. Ces cellules sont utilisées pour les infections sur les virus Influenza humains car elles permettent une bonne réplication des virus et possèdent un système immunitaire inné antiviral considéré comme complet. Afin dobtenir des cellules A549 dépourvue de la protéine UCP2, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) pour introduire des mutations dans la séquence codante du gène UCP2. Brièvement, les séquences permettant de cibler le premier exon du gène UCP2 dans le génome sont introduites dans le plasmide pSpCas9n(BB)-2A-Puro (don du Dr Feng Zhang, MIT, Boston, USA). Ce plasmide contient les éléments permettant de cibler lADN génomique et lenzyme permettant de couper cet ADN. Il est de plus équipé dun gène de résistance à la puromycine qui permet de sélectionner les cellules transfectées (car elles deviennent résistantes à cet antibiotique toxique pour les cellules eucaryotes). Trois séquences ciblant lADN cellulaire ont été choisies et nous avons donc utilisé trois plasmides pSpCas9n(BB)-
2A-Puro ciblant le premier exon du gène UCP2. La sélection à la puromycine permet dobtenir des clones cellulaires qui sont amplifiés pour obtenir assez de cellules pour réaliser les tests fonctionnels permettant dévaluer si ces clones sont dépourvus du gène UCP2 fonctionnel.
Les étapes de sélection des séquences génétiques, de clonage et de transfection ont été réalisées avant mon arrivée au laboratoire. Jai pris en charge lobtention des cellules mutantes à létape damplification des clones. Jai donc étudié le caractère mutant des clones cellulaires sélectionnés par Western Blot et par séquençage de lADN (cf protocole en Annexe 1 p.71).
Analyse de lexpression dUCP2 par Western Blot
Les Western Blots que nous avons faits ne nous ont pas permis danalyser lexpression dUCP2. En effet, malgré les nombreuses tentatives et les nombreuses mises au point, les deux anticorps vendus comme capable de détecter UCP2 dans les cellules humaines ne nous ont pas permis dobtenir un signal spécifique satisfaisant. Nous pensions que le premier anticorps primaire anti-UCP2 que nous avons utilisé nétait pas de bonne qualité car le marquage de la protéine nétait pas présent même sur des cellules contrôles UCP2(+/+). Ainsi, nous avons acheté un autre anticorps qui na pas permis davoir de meilleurs résultats. Lutilisation avec succès danticorps dirigés contre la tubuline, une protéine cellulaire abondante, nous a permis de vérifier que le problème de détection était bien dû à la mauvaise qualité des anticorps UCP2 ou au niveau dexpression trop faible de la protéine UCP2 dans les cellules A549. b. Séquençage du gène UCP2 dans lADN des clones de cellules
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Introduction
PREMIERE PARTIE : PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Limmunité innée lors dinfections par le virus Influenza
II. Les réactifs oxygénés dans les cellules eucaryotes
1. Présentation générale des réactifs oxygénés
2. Les ROS dans la mitochondrie
3. Régulation de la production des ROS
4. ROS et régulation de la physiologie cellulaire
III. Liens entre les ROS et la réponse immunitaire innée
1. ROS et agents pathogènes
2. Les ROS et la modulation de la signalisation lors de la réponse immunitaire
innée
3. Limmunité innée entraîne la production de ROS mitochondriaux
4. ROS et pathogénicité
DEUXIEME PARTIE : PARTIE EXPERIMENTALE
I. Etude 1 : Influence dUCP2 sur limmunité antivirale
1. UCP2 : une protéine qui influe sur la production de ROS
2. Protocole expérimental
3. Résultats et interprétation
4. Discussion
II. Etude 2 : évaluation des conséquences du traitement à la metformine chez des
souris infectées par le virus Influenza
1. Utilisation thérapeutique de la metformine
2. Etude de leffet de la metformine sur linfection de souris par le virus Influenza
Conclusion
Bibliographie
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