L’hétérochromatine péricentromérique dans l’embryon précoce de souris

L’ovocyte

    Chez la souris, l’ovogenèse démarre avant la naissance par la prolifération des ovogonies, qui par la suite entrent en prophase de première division méiotique. Au stade diplotène de cette prophase, les chromosomes vont se décondenser et former un noyau appelé « vésicule germinale » (germinal vesicle en anglais, ou GV). Cet ovocyte au stade GV bloque sa progression méiotique et est entouré d’une couche de cellules de la granulosa pour former un follicule primordial (Figure I-1). Les souris femelles naissent avec un stock défini de follicules primordiaux contenant des ovocytes au stade GV. Ces follicules et ovocytes vont ensuite évoluer de façon synchrone : le follicule primordial croît en taille suite à la multiplication des cellules de la granulosa et à leur organisation en bicouche, formant ainsi un follicule préantral (Figure I-1). Parallèlement, l’ovocyte au stade GV grandit, passant de 15µm à 50~80 µm de diamètre. Au bout de 14 jours, un antrum se forme dans le follicule qui atteint alors une taille de 0,2 mm (Monniaux et al. 1997). L’observation en microscopie de fluorescence de ces ovocytes, après marquage de l’ADN, a permis de les classer en 2 grands groupes selon l’état de condensation et l’organisation de la chromatine dans la GV (Mattson and Albertini 1990; Wickramasinghe et al. 1991; Debey et al. 1993; Zuccotti et al. 1995). Le premier groupe correspond aux ovocytes de type NSN (non-surrounded nucleolus) dans lesquels la chromatine a une configuration décondensée en périphérie d’une structure ressemblant au nucléole (nucleolus-like body en anglais, ou NLB) (figure I-1). Le deuxième regroupe les ovocytes de type SN (surrounded nucleolus) dont le NLB est entouré d’un anneau de chromatine condensée. Dans le nucléoplasme des ovocytes SN, on retrouve aussi des zones de chromatine condensée en périphérie nucléaire (figure I-2).La capacité de l’ovocyte à poursuivre sa maturation méiotique ne s’acquiert qu’à la puberté, à partir du 22ème jour après la naissance (Eppig and Schroeder 1989). Les femelles connaissent alors périodiquement des cycles ovulatoires au cours desquels un lot d’ovocytes répond favorablement aux stimuli des gonadotropines hypophysaires, la FSH (follicle stimulating hormone) et la LH (luteinizing hormone), qui réinitient la maturation méiotique. La FSH stimule la croissance de certains follicules secondaires qui se transforment en follicules à antrum plus larges appelés follicules de De Graff ou follicules préovulatoires. C’est le pic préovulatoire de LH qui va entraîner une cascade d’évènements conduisant à la reprise de la méiose et à l’ovulation. Dans les ovocytes au stade GV, la reprise de la méiose va se manifester d’abord par la rupture de la vésicule germinale (germinal vesicle break down en anglais, ou GVBD) et la condensation des chromosomes sous contrôle du MPF (maturating promoting factor) (Rime et al. 1989). L’ovocyte progresse ensuite vers le stade métaphase II (MII), étape de la deuxième division méiotique où il reste bloqué jusqu’à l’ovulation (Figure I-1). Environ 12h après le pic préovulatoire de LH, le follicule se déchire et l’ovocyte en MII est expulsé dans l’oviducte (au niveau de l’ampullae). Parmi les ovocytes de type SN et NSN, la configuration SN est présentée comme étant le dernier stade de l’ovocyte GV précédant l’ovulation. En effet, les ovocytes de type SN, plus grands que les ovocytes NSN, n’apparaissent qu’à partir du 17ème ou 18ème jour après la naissance (Wickramasinghe et al. 1991; Zuccotti et al. 1995). Par ailleurs, selon les Figure I-2: Images en immunofluorescence de différents ovocytes vivants, fraîchement isolés par ponction folliculaire, après marquage de l’ADN au Hoechst 33342. a: configuration SN avec un anneau périnucléolaire fluorescent (flèche) et des fibres de chromatine condensée (tête de flèche). b: configuration NSN; le nucléole ne se distingue pas en fluorescence ; présence de petites (pointes de flèches) et grandes (flèches) granulosités fluorescentes. Barre d’échelle: 5µm. Modifiée à partir de Debey et al. 1993. observations sur coupe ovarienne de souris juvéniles (Mattson and Albertini 1990), les ovocytes de type NSN sont présents essentiellement dans les follicules préantraux alors que les grands follicules à antrum contiennent 100 % d’ovocytes de type SN. Enfin, au cours de la croissance ovocytaire in vitro, les ovocytes NSN adoptent parfois la configuration SN par réorganisation et condensation de la chromatine autour du NLB (Mattson and Albertini 1990; Debey et al. 1993; Zuccotti et al. 1995). La différence d’organisation de la chromatine observée entre ovocyte NSN et SN s’accompagne également d’une différence d’activité transcriptionnelle : les ovocytes NSN présentent une activité transcriptionnelle qui est progressivement réprimée parallèlement à l’acquisition de la configuration SN (Worrad et al. 1994; Bouniol-baly et al. 1999). C’est donc dans l’ovocyte NSN que se déroule une phase de transcription intense avec stockage massif des transcrits essentiels pour la croissance ovocytaire et les premiers stades du développement embryonnaire. Ce stockage participe à la contribution maternelle dans la formation du futur embryon. L’ovulation est donc précédée par une période de maturation nucléaire et cytoplasmique conduisant à l’obtention d’un œuf fécondable, notamment capable de s’activer, de former des pronoyaux et de poursuivre le développement (Eppig et al. 1994). Cependant, la maturation nucléaire qui s’accompagne d’un arrêt de la transcription dans l’ovocyte est inachevée à l’inverse de la maturation cytoplasmique. En effet, au moment de l’ovulation, les ovocytes sont bloqués en Métaphase II et ne réinitient leur méiose qu’au moment de la fécondation par le spermatozoïde. Parallèlement à ce blocage de la maturation nucléaire, aucune activité transcriptionnelle n’est détectée.

Le spermatozoïde

   Chez le mâle, les cellules germinales primordiales vont proliférer puis arrêter leur accroissement numérique avant la naissance. Ces cellules germinales primordiales se différentient alors en spermatogonies de type A à partir du 3ème au 7ème jour après la naissance. Les spermatogonies de type A, adjacentes à la membrane basale des tubes séminifères initient leur différenciation à la puberté. Ce processus biologique ou spermatogenèse, peut se diviser en trois grandes étapes : la première au cours de laquelle les spermatogonies prolifèrent, la deuxième caractérisée par deux divisions méiotiques pour donner des cellules haploïdes et la troisième (spermiogenèse) qui correspond à la maturation des cellules haploïdes en spermatozoïdes (Rathke et al. 2014). Ainsi au moment de la maturité sexuelle, les spermatogonies de type A subissent plusieurs divisions. Une des cellules filles assure l’auto- renouvellement du stock de spermatogonies tandis que l’autre spermatogonie se transforme progressivement en spermatogonie de type B. Les spermatogonies de type B vont à leur tour se multiplier, grandir, puis migrer vers le lumen des tubes séminifères où elles se transforment en spermatocytes I (primaire). Le spermatocyte I subit successivement deux divisions méiotiques conduisant à l’obtention de spermatides. Les spermatides se différencient en spermatozoïdes via la spermiogenèse qui s’accompagne d’un ensemble de modifications morphologiques; permettant d’obtenir un spermatozoïde capable d’interagir avec l’ovocyte en attente dans l’ampulla et de le féconder. La spermiogenèse est aussi la phase au cours de laquelle des remaniements s’opèrent au niveau nucléaire (Ward 2010). Les remodelages chromatiniens qui ont lieu au cours de la spermiogenèse sont nécessaires à la réduction du volume nucléaire au moment où la tête du spermatozoïde adopte sa forme allongée caractéristique (Balhorn 2007). Par ailleurs, les histones (unités fondamentales de la chromatine) seront remplacées par des protéines dites de transition puis par les protamines. Ces dernières rendant la chromatine du spermatozoïde très condensée (Rodman et al. 1984; Ward 2010; Miller et al. 2010; Rathke et al. 2014). On retrouve deux formes de protamines dans les spermatozoïdes matures : protamine 1 (PRM1) et protamine 2 (PRM2) (Kleene et al. 1985; Yelick et al. 1987; Braun 2001). Ces deux types de protamines sont cruciales aussi bien pour la fertilité que pour le succès du développement embryonnaire (Cho et al. 2001; Cho et al. 2003). Les protamines sont riches en résidus arginine (entre 46.8 et 61.2%) essentielles pour les fortes liaisons avec l’ADN et en résidus cystéines assurant les ponts disulfures inter- et intraprotamines (Carrell et al. 2007). L’association protamines/ ADN forme un toroïde (Figure I3), unité fonctionnelle de la chromatine du spermatozoïde à l’image du nucléosome mais induisant un niveau de compaction très élevé (Hud et al. 1993; Hud et al. 1995; Brewer et al. 2003). La protamination, quant à elle, est un mécanisme offrant protection, résistance et stabilité au génome paternel jusqu’à la fécondation (Kuretake et al. 1996; Brewer et al. 1999; Balhorn et al. 2000). Toutefois, sa mise en place nécessite l’arrêt préalable de la transcription dans le spermatozoïde (Ward 2010 ; Rathke et al. 2014). Par ailleurs, même si les protamines représentent les constituants majeurs du génome du spermatozoïde, des données suggèrent qu’une portion de la chromatine (1–2% chez la souris) reste associée aux histones. L’impact lors du développement embryonnaire de ces histones résiduelles au sein du spermatozoïde et des modifications épigénétiques associées est peu documenté.

Fécondation et premier cycle embryonnaire

   Au moment du coït, les spermatozoïdes sont libérés dans le tractus génital femelle où ils subissent la capacitation, les rendant aptes à féconder l’ovocyte. La fécondation, union de l’ovocyte et du spermatozoïde et notamment de leurs génomes aboutit à la formation d’un embryon unicellulaire (stade 1-cellule ou zygote). L’embryon évolue au cours des jours suivants et se développe sur plusieurs cycles cellulaires pour donner un blastocyste, dernier stade avant l’implantation. La fusion du spermatozoïde avec l’ovocyte déclenche une succession d’évènements déterminants pour la suite du développement. Il s’agit notamment de l’augmentation intra-cytoplasmique du calcium ovocytaire (Ajduk et al. 2008). Cela active l’ovocyte qui va réinitier et achever sa méiose par expulsion du deuxième globule polaire (Kubiak et al. 1993; Zernicka-Goetz et al. 1995). Il y a ensuite exocytose des granules corticaux dans l’espace périvitellin qui augmente la rigidité de la zone pellucide empêchant ainsi la polyspermie et enfin, la décondensation des génomes parentaux et la formation des pronoyaux. Une fois les deux gamètes fusionnés, la décondensation asynchrone des deux génomes s’effectue dans le cytoplasme ovocytaire. Le génome maternel se décondense en premier suivi du génome paternel environ 4h après l’entrée du spermatozoïde (Debey et al. 1989; Adenot et al. 1991) (figure I-4). La décondensation du génome paternel se manifeste par la rupture des ponts disulfures inter- et intra-protamines compactant l’ADN puis par le remplacement des protamines par les histones (Kopecný and Pavlok 1975; Rodman et al. 1981; Perreault et al. 1984; Perreault et al. 1987; Dieker et al. 2005; Ajduk 2006). La chromatine paternelle adopte ainsi une configuration moins compacte que celle conférée par les protamines. Le génome paternel va ensuite se recondenser suite au remplacement des protamines par les histones qui s’organisent en nucléosomes en association avec l’ADN. Les facteurs nécessaires à la décondensation, à savoir les enzymes et les histones remplaçant les protamines sont fournies par le cytoplasme ovocytaire (Yanagimachi 1978; Kunkle et al. 1978). Suite à cette décondensation, des membranes se forment autour de chaque génome permettant la formation des pronoyaux maternel et paternel (Adenot et al. 1991). Les pronoyaux initialement de petite taille et localisés en périphérie du cytoplasme zygotique commencent à migrer vers le centre du zygote environ 12h post-fécondation (Howlett and Bolton 1985; Debey et al. 1989). Progressivement, les deux pronoyaux se rapprochent et augmentent en volume. C’est sur la base de ces deux critères de position et de taille qu’Adenot et al. (1997) ont proposé une nomenclature pour décrire différents stades de pronoyaux (PN) dans l’embryon 1-cellule, allant de PN0 à PN5. A partir du stade PN3 une différence de taille a été observée entre les deux pronoyaux, le paternel étant plus gros que le maternel (figure I-4). Il faut aussi noter que, dès leur formation, les pronoyaux contiennent des structures sphériques appelées NPB (nucleolar precursor bodies) (Austin 1961; Geuskens and Alexandre 1984; Debey et al. 1989). Ces structures compactes, entourées d’un anneau de chromatine condensée, ont été considérées pendant plusieurs années comme des précurseurs de nucléoles (Debey et al. 1989). L’origine, la structure et le rôle de ces structures seront abordés plus en détails dans le chapitre II du manuscrit.

Les histones et les modifications post-traductionnelles

   Chez les eucaryotes, l’ADN est associé à des protéines nucléaires basiques, les histones. Cette association forme la chromatine. L’unité fonctionnelle de la chromatine est le nucléosome. Selon le modèle proposé par Kornerg en 1974, le nucléosome est composé d’un octamère d’histones cœur autour duquel s’enroule 146 paires de bases d’ADN, plus une histone de liaison, l’histone H1. Quatre histones principales constituent l’octamère. Il s’agit de H2A, H2B, H3 et H4 qui s’organisent en un trétramère de H3/H4 associé à deux dimères H2A/H2B. Les histones sont des protéines nucléaires de 11 à 16 kDa très conservées au cours de l’évolution. Sur le plan structural, les molécules d’histones présentent des domaines globulaires de type « histone fold » contenant trois hélice α (α1,α2 et α3) grâce auxquels elles s’associent en hétérodimère H3/H4 et H2A/H2B et interagissent avec l’ADN. L’enroulement de l’ADN autour du nucléosome se fait au niveau du petit sillon de la double hélice d’ADN alors que le grand sillon reste lui accessible aux facteurs protéiques. Les extrémités Nterminales ou « queues d’histones », très conservées entre espèces s’extériorisent du nucléosome (Luger et al. 1997) (figure I-5) et permettent aussi les interactions inter-histones et avec d’autres protéines. Même si de manière générale toutes les histones sont considérablement enrichies en résidu lysine et arginine, la plus grande proportion de lysines se retrouve dans les histones H2A et H2B alors que les histones H3 et H4 présentent un enrichissement en résidus arginine. Leur position externe et leur fort enrichissement en résidus lysine et arginine exposent les extrémités N-terminale des histones à des modifications post-traductionnelles susceptibles d’influencer l’organisation de la chromatine. En effet, ces modifications post-traductionnelles des histones constituent essentiellement des sites de reconnaissance et points d’ancrage d’autres facteurs impliqués dans le remodelage de la chromatine. Parmi les modifications les plus connues, on retrouve la méthylation, l’acétylation, la phosphorylation et l’ubiquitinylation. Cependant, au cours de ses dernières années, d’autres modifications d’histones ont été découverte telles que la sumoylation ou la citrunilation (Tan et al. 2011).

Les modifications post-traductionnelles des histones: la méthylation

   La méthylation des « queues d’histones » fait intervenir des histones méthyltransférases (HMTs) qui rajoutent des groupes méthyle au niveau des résidus arginine et lysine sur les histones H3 et H4. La réaction antagoniste, la déméthylation, est elle assurée par des histones déméthylases (Dimitrova et al. 2015). Les groupes méthyles apposés peuvent être uniques (mono-méthylation), double (di-méthylation) ou triple (tri- méthylation). Ces marques de méthylation sont reconnues spécifiquement par des facteurs à chromo-domaine, à motif tudor, et à domaine WD40 et doigt PHD (plant homeo domain) qui entraîneront une réorganisation de la chromatine rendant plus ou moins accessible les promoteurs des gènes (effet répressif ou permissif sur la transcription des gènes) (Mozzetta et al. 2015). Parmi toutes les marques de méthylation d’histones décrites à ce jour, je présenterai ici les exemples les plus connus puis je décrirai leur distribution dans les pronoyaux parentaux.
 H3K9 : La méthylation de l’histone H3 sur la lysine 9 est l’une des marques de méthylation de l’histone H3 la plus étudiée. De manière générale, suite à la triméthylation de H3K9, la chromatine adopte de façon temporaire et réversible une configuration condensée. Cette marque est classiquement associée avec une répression de l’expression des gènes. En effet, une accumulation de H3K9me3 via l’action des histones méthyltransférases SUV39H1 et SUV39H2 ainsi que SETDB1 (SET domain bifurcated 1) a été décrite au niveau de l’hétérochromatine constitutive localisée dans les régions centromériques et péricentromériques du génome (Becker et al. 2016). La triméthylation de H3K9 entraîne le recrutement de la protéine HP1 (heterochromatin protein 1, ou CBX1 pour chromo box protein 1) via son chromo-domaine N-terminal (Bannister et al. 2001; Lachner et al. 2001). HP1 possède trois isoformes (α, β et γ) présentant des similarités de séquence et de structure (Singh et al. 1991). Les isoformes de HP1 sont des protéines d’environ 25 kDa : HP1α est présente sur l’hétérochromatine péricentromérique, HP1γ est présente sur l’euchromatine et HP1β présente une distribution intermédiaire. HP1 possède également un domaine « hinge » qui permet la liaison à l’ADN et à l’ARN (Muchardt et al. 2002; Meehan et al. 2003) ainsi qu’un domaine « chromo-shadow » responsable de la dimérisation de HP1 (Smothers and Henikoff 2000). En effet, HP1 est connue pour son implication dans l’expansion et le maintien de l’hétérochromatine via un mécanisme d’auto-recrutement (Saksouk et al. 2015). Grâce à son domaine « chromo-shadow », HP1 favorise également le recrutement de protéines intervenant dans l’hétérochromatinisation (Kosak and Groudine 2004; Gaszner and Felsenfeld 2006). Il s’agit notamment des ADN-méthyltransférases DNMT1 et DNMT3a (Fuks et al. 2003), de l’histone-méthyltransférase SUV39H (Meehan et al. 2003), de la protéine CAF-1 (chromatin-assembly-factor-1) intervenant dans l’assemblage des nucléosomes et de SUV4-20H (Murzina et al. 1999), une histone lysine méthyltransférase qui catalyse la méthylation H4 sur la lysine 20 (H4K20me2/3) dont je parlerai plus tard (Li et al. 1992; Lachner et al. 2001; Peters et al. 2001; Schotta et al. 2004).

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Table des matières

INTRODUCTION
Chapitre I – l’embryon préimplantatoire
I-1) Fécondation et premier cycle embryonnaire chez la souris
I-1-1) Les gamètes
I-1-2) Fécondation et premier cycle embryonnaire
I-2) Organisation du génome dans l’embryon précoce de souris
I-2-1) La chromatine : généralités
I-2-2) Asymétrie parentale dans l’embryon dès le stade 1-cellule
I-3) Démarrage des activités transcriptionnelles dans l’embryon de souris
I-3-1) Activation « mineure » et « majeure »
I-3-2) Régulation de l’activité transcriptionnelle
I-4) Evolution du développement jusqu’au stade blastocyste
Chapitre II/ Les compartiments nucléaires impliqués dans la ribogenèse
II-1) Le nucléole en cellules somatiques
II-1-1) Généralités
II-1-2) Les protéines nucléolaires
II-1-3) Dynamique du nucléole pendant le cycle cellulaire
II-2) Le nucléole et le NPB dans l’embryon de souris
II-2-1) Définition en fonction du stade de développement
II-2-2) Origine et structure des NPB dans l’embryon de souris
II-2-3) Transition entre NPB et nucléole réticulé de type «somatique»
II-2-4) Fonctionnement et dynamique nucléolaire dans l’embryon
II-3) Le corps de Cajal
II-3-1) Composition
II-3-2) Fonction
Chapitre III/ Les séquences centromériques, péricentromériques et ribosomiques
III-1) L’hétérochromatine péricentromérique
III-1-1) Organisation, formation et fonction de l’hétérochromatine péri-centromérique
III-1-2) Transcription et régulation de l’hétérochromatine péricentromérique
III-1-3) L’hétérochromatine péri/centromérique dans l’embryon de souris
III-2) Les gènes ribosomiques
III-2-1) Structure et localisation des gènes ribosomiques
III-2-2) Transcription des gènes ribosomiques
III-2-3) Maturation de l’ARN pré-ribosomique et assemblage des ribosomes
III-2-4) Etat transcriptionnel et régulation
III-2-5) Proximité des ADNr avec l’hétérochromatine péricentromérique
III-2-6) Régulation des gènes ribosomiques dans l’embryon de souris
PROBLEMATIQUE SCIENTIFIQUE
MATERIEL ET METHODES
Superovulation et autorisation d’expérimentation
Collecte d’ovocytes en métaphase II et d’embryons au stade 1-cellule
Production d’embryons parthénotes diploïdes
Production d’embryons androgénotes par injection de spermatozoïde
Production d’embryons androgénotes et gynogénotes par échange de pronoyaux
Immunofluorescence UBF et NOPP140
Sondes pour l’ADN-FISH
Sondes pour l’ARN-FISH des séquences satellites majeurs
ADN-FISH des séquences satellites majeurs et mineurs
ARN-FISH des séquences satellites majeurs (brin sens et anti-sens)
ADN-FISH des gènes ribosomiques et des séquences satellites majeurs
Observation et acquisition des images
Tests statistiques
RESULTATS
Partie I- Nucléologenèse embryonnaire
I-1) Distribution des protéines nucléolaires UBF et NOPP140 au cours du développement embryonnaire précoce
I-1-1) Introduction
I-1-2) Article  » 3D distribution of UBF & Nopp140 in relationship to rDNA transcription during mouse preimplantation development »
I-2) Distribution et organisation des gènes ribosomiques au cours du développement
I-2-1) Introduction
I-2-2) Evolution des NPB au cours du développement
I-2-3) Organisation des séquences d’ADNr du stade 1-cellule au stade blastocyste
I-2-4) Interaction entre ADNr et l’hétérochromatine péricentromérique
I-2-5) Discussion et perspectives
I-2-5) Perspectives
II-Organisation de l’hétérochromatine péricentromérique et contribution parentale
II-1) Introduction
II-2) Résultats
II-2-1) Organisation des séquences satellites majeurs et mineurs
II-2-2) Transcription des séquences satellites majeurs
II-2-3) Cinétique de développement des embryons
II-2-4) Discussion
CONCLUSION GENERALE
BIBLIOGRAPHIE

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