Soutenance mémoire
Levure non-lipodépendante : Malassezia pachydermatis
Conditions de culture
Milieux de culture
Il existe différents types de milieux adaptés à la culture des levures, sous forme solide ou liquide. Malassezia pachydermatis est une levure nonlipodépendante qui, de ce fait, croit aisément sur les milieux usuels. Cependant, dans certaines conditions, son isolement nécessite des milieux enrichis. Le plus fréquemment utilisé est la gélose de Sabouraud qui permet l’isolement, l’identification et la culture (7, 21, 22). Son utilisation est recommandée d’ailleurs par le Codex de la Pharmacopée Française pour le contrôle de stérilité des produits pharmaceutiques. Il est composé de peptone (10 g), de glucose (20 à 60g), de gélose (20g) et d’eau (qsp 1000 ml) (22). En routine, il permet l’isolement de la plupart des espèces fongiques responsables des dermatoses chez les carnivores domestiques (Microsporum canis et autres Dermatophytes, Malassezia pachydermatis et Candida spp.). Le milieu de Dixon modifié est aussi utilisé pour la culture fongique (54, 95). A la différence du milieu de Sabouraud, il est enrichi en lipides (2). Ce dernier est composé de malt, de peptone, de Tween 40, de glycérol, acide oléique et d’agar. Selon Guillot, il semble que ce milieu soit plus favorable à la croissance de Malassezia pachydermatis que le milieu de Sabouraud (54). En conclusion ces deux milieux peuvent être utilisés en routine pour la culture de Malassezia pachydermatis (9). D’autres milieux ont été utilisés et testés, mais se sont révélés moins pratiques ou moins adaptés à leur développement. Par exemple, la gélose au sang n’est pas adéquate car la croissance des levures est réduite et de ce fait difficile à mettre en évidence (48). Pourtant, Blanco a obtenu de bons résultats dans son expérience avec une association de gélose au sang et de gélose MacConkey (7). Les milieux de culture usuels peuvent être supplémentés en antibiotiques ou en vitamines. Les antibiotiques les plus fréquemment employés sont le chloramphénicol et la gentamicine, et permettent d’éviter la croissance de contaminants bactériens. La gélose de Sabouraud-gentamicine est indiquée pour l’isolement de toutes les espèces de levures. La gentamicine inhibe presque la totalité des espèces bactériennes, et particulièrement les bacilles à Gram négatif résistant au chloramphénicol (certains Proteus, Enterobacter et Pseudomonas). Ces derniers pourraient soit inhiber la croissance fongique soit gêner l’identification des levures. Mais rappelons que l’association de Staphylococcus intermedius avec certaines souches de Malassezia pachydermatis permettrait au contraire la croissance de ces dernières (cf.ante) (34, 68). D’après Blanco, le milieu de Sabouraud-glucose sans antibiotique est le milieu le plus adapté pour l’isolement des levures, en particulier pour Malassezia pachydermatis. La présence d’une flore bactérienne suer la gélose ne serait pas un obstacle à l’identification de micro-organismes. Dans sa publication, il insiste sur le fait que les antibiotiques ont ralenti voire inhibé la croissance durant les trois premiers jours de l’incubation lors de son expérience. La sensibilité à certains antibiotiques a été reportée dans d’autres études (7). Pour Guillot, le milieu de Dixon modifié et supplémenté en antibiotiques est le plus adapté (54). De la vitamine PP, ou acide nicotinique, peut être ajoutée aux milieux usuels. Il s’agit de la seule vitamine utile à la croissance M. pachydermatis, et peut même se révéler indispensable pour la culture de certaines souches. La cyclohéximidine (Actidione®) est un antifongique qui permet d’inhiber le développement de champignons dits « contaminants » dans le milieu (22), mais qui est sans action sur Malassezia. Au contraire, l’Actidione® favoriserait sa croissance au lieu de l’inhiber (48, 50). Malassezia n’est pas une levure lipodépendante mais elle reste cependant une levure lipophile. Elle se développe aisément sur les milieux usuels car ceux-ci contiennent une quantité restreinte mais suffisante d’acides gras à courtes chaînes. Mais l’ajout de lipides supplémentaires, notamment d’acides gras à longue chaîne (48), peut être bénéfique à sa croissance (2, 9). Dans sa thèse, Bazin précise que l’ajout d’huile d’olive peut-être utile car certaines souches de M. pachydermatis ne peuvent être isolées en culture Sabouraud sans huile (2, 18, 50). Blanco pense que cet ajout n’augmente pas la fréquence d’isolement, en particulier au bout de 24h. Par ailleurs, du fait de la faible sélectivité de ce milieu et des difficultés d’observation des colonies, Blanco ne le recommande que pour une utilisation occasionnelle, dans le cadre d’études particulières (7). Il ajoute que Malassezia pachydermatis n’a pas besoin de lipides supplémentaires à ceux trouvés dans le milieu pour croître. Ceci va dans le sens des études précédentes qui classent toutes les levures nonlipodépendantes dans l’espèce Malassezia pachydermatis. Il reconnaît toutefois que la présence de lipides adéquats stimulent a croissance. Le milieu peut être aussi enrichi en Tween. Il s’agit de polysorbate, généralement utilisé comme tensio-actif. C’est une huile végétale soluble dans l’eau, l’alcool et le propylène glycol et constitue donc une autre source de lipides à ajouter
aux milieux de culture, qui semblerait optimiser la croissance. Mais il faut être prudent car selon les souches, soit les molécules n’apportent aucune amélioration soit elles peuvent inhiber la pousse (7, 48). D’ailleurs certains acides gras présents dans du cérumen de chien seraient également capables d’inhiber le développement de certains micro-organismes (63). On répertorie encore d’autres milieux, additionnées en lipides : Leeming’medium (supplémenté en lipides) ou le milieu de Ushijima. Ces milieux sont appropriés pour l’isolement de toutes les espèces de Malassezia, y compris les lipodépendantes qui peuvent être retrouvées parfois sur la peau des chiens et des chat (54).
Environnement : Température, atmosphère et pH
• Température La température généralement recommandée pour la culture des levures est de 37°C, ce qui correspond d’ailleurs à la température du conduit auditif externe (7). Pour Guillot (54), la gamme de température 32-37°C convient au développement des Malassezia,sans différence notable entre ces deux limites. Par contre, le milieu de Sabouraud semble moins performant à la température de 27°C, les colonies se développent plus lentement ; on peut donc avoir des faux négatifs si la durée d’incubation n’est pas assez longue (7 jours minimum sur Sabouraud) (9). De meilleurs résultats pour ce milieu peuvent être obtenus en réglant l’étuve à 37°C ou en utilisant une atmosphère enrichie en CO2 (54). Des résultats similaires ont été obtenus par Bond et Lloyd qui ne trouvent de différence significative entre 32°C et 37°C (9). La croissance semble être inhibée à partir de 40-45°C (48).
• Atmosphère
– Oxygène Elle poussent en milieu aérobie mais sont également capables de se développer dans des conditions microaérophiles, ou anaérobies pendant une durée limitée pour cette dernière et avec une croissance faible (1, 34). La culture en milieu microaérophile est peu répandue bien qu’elle ait prouvé à maintes reprises son efficacité (7). 5 à 10% de CO2 augmentent de manière significative la fréquence d’isolation de Malassezia pachydermatis mais uniquement sur un milieu de Sabouraud comme nous l’avons déjà souligné (9).
– Hygrométrie En étuve, il est nécessaire de maintenir une hygrométrie adaptée au développement fongique. On rajoute souvent un récipient rempli d’eau dans l’étuve. D’ailleurs, des variations géographiques ont été détectées lors de la culture et l’isolement de Malassezia pachydermatis. Il apparaîtrait que cette levure serait plus facile à isoler lorsque les prélèvements des échantillons à tester sont réalisés par temps humide (7).
• pH La croissance est optimale pour des pH compris entre 4 et 8. Elle est par contre inhibée pour des gammes de pH de 1 à 3 et de 9 à 10. A pH 4, la croissance est meilleure qu’aux pH 1 à 3, mais est inférieure à ceux compris entre 5 et 8. L’étude de Matousek et al. ne montre pas de différence significative pour les pH 5 à 8 (77). Cette étude suggère aussi qu’une acidification locale de la peau pourrait avoir des effets thérapeutiques bénéfiques sur des infections fongiques chez les chiens (77). Ceci reste toutefois délicat car des conditions seulement « légèrement acides » (pH 4 à 6) favorisent le développement des levures. Par contre, même si les pH audelà de 9 inhibent la croissance des levures, il n’est pas possible d’utiliser cette propriété dans le cadre d’un traitement. L’alcalinisation de la peau provoque, chez les humains, des effets secondaires inacceptables, à savoir des irritations et des prédispositions aux infections bactériennes.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Présentation d’une levure non-lipodépendante : Malassezia pachydermatis |
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Table des matières
SOMMAIRE DES FIGURES ET DES TABLEAUX
INTRODUCTION
I. LE GENRE MALASSEZIA
1. Taxonomie
1.1 Eléments de classification
a. Généralités sur les champignons
b. Place des levures du genre Malassezia dans la systématique
1.2 Diversité au sein du genre Malassezia
1.3 Origine du nom : Malassezia pachydermatis et synonymie
2. Présentation d’une levure non-lipodépendante : Malassezia pachydermatis
2.1 Description de cette levure
a. Morphologie macroscopique et microscopique
b. Ultrastructure
2.2 Biologie de Malassezia pachydermatis
a. Assimilation des nutriments
b. Reproduction
c. Ecologie de Malassezia pachydermatis
• Répartition de M. pachydermatis sur les êtres vivants
• Fréquence d’isolement chez les chiens et les chats
• Localisation sur les animaux
• Prédispositions raciales
• Densité de populations de levures
• Localisation au niveau de la peau
2.3 Conditions de culture
a. Milieux de culture
b. Environnement : température, atmosphère et pH
• Température
• Atmosphère
• pH
c. Conditions de conservation des levures
3. Etude des autres espèces appartenant au genre Malassezia
3.1 Critères de diagnose des Malassezia
a. Etude morphologique
b. Caractéristiques physiologiques et biochimiques
c. Etude du génome par différentes techniques de biologie moléculaire
3.2 Ecologie de ces espèces
4. Etude clinique des dermatites à Malassezia
4.1 Techniques d’isolement de ces levure
a. Cytologie
b. Mise en culture 22 4.2 Etude des formes cliniques des Malassezioses
a. Chez l’animal 23 b. Chez l’Homme
4.3 Interactions des Malassezia avec la peau de l’hôte
4.4 Facteurs favorisants
5. Traitement des Malassezioses en médecine vétérinaire
5.1 Présentation des antifongiques disponibles et de leurs formulations
a. Antiseptiques
b. Antifongiques stricts
c. Antibiotiques ayant une activité antifongique
5.2 Démarches thérapeutiques
II. LA PIROCTONE OLAMINE
1. Famille et structure de la Piroctone olamine
1.1 Famille des Hydroxy-pyridones
1.2 Synonymes et noms chimiques de la Piroctone olamine
a. Noms courants 28 b. Noms systématiques
1.3 Dénomination officielle : Piroctone olamine
1.4 Formules chimiques
a. Formule brute b. Formules développée et simplifiée
2. Propriétés de la Piroctone olamine
2.1 Propriétés physiques
2.2 Propriétés chimiques
2.3 Stabilité de la Piroctone olamine
a. Thermostabilité
b. Photodégradation et photosensibilité
c. Conservation lors du stockage
2.4 Compatibilité de la Piroctone olamine avec les matières premières utilisées en cosmétique
2.5 Pharmacocinétique
2.6 Toxicité 3
a. Toxicité par voie orale
b. Toxicité par voie cutanée
c. Embryotoxicité et tératogenèse
3. Spectre et mode d’action
3.1 Spectre de la Piroctone olamine
3.2 Mode d’action
4. Formes galéniques des Hydroxy-pyridones
4.1 Présentations en médecine humaine
a. Produits disponibles sur le marché
b. Influence du temps d’application
4.2 Présentations en médecine vétérinaire
4.3 Etudes comparatives de la Piroctone olamine avec d’autres Antifongique
III. ETUDE EXPERIMENTALE
1. Etapes communes à tous les protocoles
1.1 Obtention du principe actif
1.2 Préparation du milieu de culture et répartition dans les boîtes de Pétri
a. Choix du milieu
b. Préparation du milieu
c. Répartition du milieu de culture dans les boîtes de Pétri
1.3 Obtention des Malassezia pachydermatis et mise en culture
2. Protocole A : Etude de l’efficacité antifongique du shampooing Allermyl® sur des Malassezia pachydermatis in vitro
2.1 Matériels et méthodes
a. Détermination des quantités de shampooing à appliquer sur la surface d’une boîte de Pétri
b. Application sur les géloses
• Effet préventif antifongique
• Effet curatif antifongique
• Chronologie de l’essai
2.2 Résultats du protocole A
a. Résultats de l’étude de l’effet préventif antifongique de la Piroctone olamine
b. Résultats de l’étude de l’effet curatif antifongique sur des colonies de 3 jours d’âge
c. Conclusion du protocole A
3. Protocole B : Application du shampooing sur les Malassezia puis élimination du shampooing résiduel
4. Protocole C : Etude de l’efficacité antifongique de la Piroctone
olamine en solution sur Malassezia pachydermatis en boîte de Pétri
4.1 Matériels et méthodes
a. Détermination des quantités de Piroctone olamine à appliquer sur les géloses
• Préparation d’une solution à 1% de Piroctone olamine
• Effet préventif
• Effet curatif
b. Protocole expérimental
• Effet préventif
• Effet curatif
4.2 Résultats du protocole C
a. Résultats de l’étude de l’effet préventif de la Piroctone olamine
b. Résultats de l’étude de l’effet curatif de la Piroctone olamine
IV. DISCUSSION
1. Critique du protocole C
1.1 Choix de la souche de Malassezia pachydermatis
1.2 Nombre de boîtes utilisées par concentration
1.3 Réalisation des solutions à tester
2. Discussion des résultats des protocoles A et C
2.1 Protocole A
2.2 Protocole C
• Etude de l’effet préventif antifongique de la Piroctone olamine sur les Malassezia
• Etude de l’effet curatif antifongique de la Piroctone olamine sur les Malassezia
3. Comparaison de nos résultats avec les publications concernant l’efficacité antifongique de la Piroctone olamine
4. Perspective
CONCLUSION 68 BIBLIOGRAPHIE
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