LES TECHNIQUES DE DETERMINATION DE LA PLOÏDIE

Leucémies Aigües : généralités

Les leucémies aigües constituent un groupe de pathologies malignes caractérisées par une prolifération médullaire de progéniteurs de cellules hématopoïétiques, non différenciés appelés blastes. Cette multiplication anormale va générer, en premier lieu, une insuffisance médullaire du fait de l’envahissement par les cellules malignes. La moelle osseuse est alors très rapidement incapable de produire des cellules sanguines normales ce qui se traduit par des cytopénies périphériques. En parallèle, l’invasion du sang et des organes hématopoïétiques secondaires engendre un syndrome tumoral de gravité variable.

En ce qui concerne la physiopathologie, une combinaison d’anomalies génétiques acquises confère un avantage sélectif en affectant la différenciation, stimulant la prolifération et la survie ce qui provoquera la sélection et l’expansion d’un clone cellulaire malin. Plusieurs altérations sont identifiées progressivement comme étant plus largement impliquées dans l’initiation de la transformation leucémique. Un certain nombre de facteurs de risques et de prédispositions ont été mis en évidence mais ils ne sont retrouvés que dans 5% des situations (1). Parmi les anomalies génétiques constitutionnelles les plus fréquemment citées, nous retrouvons la trisomie 21 (2)(3)(4), le syndrome de Li-Fraumeni (5) ou encore la maladie de Fanconi. Par ailleurs, la plupart des pathologies hématologiques acquises sont susceptibles d’évoluer vers la leucémie aigüe. Enfin, l’exposition au benzène, aux hydrocarbures, les chimiothérapies (agents alkylants et inhibiteurs des topoisomérases) et radiothérapies sont reconnus comme des facteurs favorisants.

On distingue deux grandes catégories de leucémies aigües :
– Les formes myéloblastiques plus fréquentes chez l’adulte et le sujet âgé
– Les formes lymphoblastiques B et T que l’on retrouvera plus fréquemment chez l’enfant .

Les LA constituent le cancer le plus fréquent de l’enfant (25 à 30%) et sa forme lymphoblastique représente 80% des LA pédiatriques dont 85% sont de lignée B et 15% de lignée T (6)(1). Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux leucémies aigues lymphoblastiques B pédiatriques (LALB).

DIAGNOSTIC et CLASSIFICATIONS

Clinique : une pathologie aigüe

Nous pouvons retrouver tout d’abord les conséquences de l’insuffisance médullaire :
– Un syndrome hémorragique se traduisant par des hémorragies cutanéo-muqueuses liées à une fréquente thrombopénie au diagnostic. Il peut potentiellement être aggravé par l’existence d’une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) associée.
– Un syndrome infectieux lié à une éventuelle neutropénie. Nous pouvons décrire des infections classiques mais persistantes malgré le traitement ou anormalement sévères (l’angine étant le tableau de présentation le plus fréquent). Des infections à germes opportunistes peuvent aussi constituer un signe d’appel.
– Un syndrome anémique sur la chute rapide et importante du taux d’hémoglobine qui est en général mal toléré avec pâleur, tachycardie, asthénie…

Le syndrome tumoral quant à lui est souvent bien présent dans les LAL B de l’enfant avec l’apparition d’adénopathies, d’une splénomégalie plus ou moins associée à une hépatomégalie et des douleurs osseuses. Plus rarement, un envahissement d’autres organes peut avoir lieu avec des manifestations telles qu’une atteinte testiculaire ou encore des signes d’envahissement neuro-méningé.

Cytologie, l’élément central

La numération formule sanguine montre classiquement un tableau de tricytopénie (anémie, thrombopénie et neutropénie) associée à une hyperleucocytose avec la présence de cellules blastiques circulantes. Cependant, toutes les associations d’anomalies sont possibles et une numération normale de même que l’absence de blaste dans le sang n’exclut pas le diagnostic. Celui-ci nécessite dans tous cas la réalisation d’un prélèvement de moelle osseuse et la mise évidence d’au moins 20% de cellules blastiques. L’ancienne classification FAB permettait de classer les LA en fonction de leur aspect morphologique, lignée cellulaire et degré de différenciation. Malheureusement, ceci reste en partie subjectif et ne permet pas d’être sûr à 100% du type de LA. En effet, il est possible de retrouver des granulations dans une LAL et inversement certains blastes myéloïdes très immatures n’en présentent aucune. Seule l’existence de corps d’Auer signe le caractère myéloïde et ils doivent être recherchés attentivement. Actuellement, la cytométrie en flux est devenue indispensable pour la détermination de lignée et, à fortiori, dans la classification des LALB.

Immunophénotypage

La classification EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemia) des LALB (cf tableau 1) est entièrement basée sur l’identification des clusters de différenciation (CD) intra-cellulaires et de surface retrouvés au niveau des cellules blastiques (7). La cytométrie en flux permet ainsi de déterminer avec une plus grande spécificité s’il s’agit d’une LAM ou d’une LAL, de préciser si celle-ci est de lignée B ou T et de définir le degré de différenciation. Dans un deuxième temps, on identifie le phénotype spécifique des blastes, ce que l’on appelle les LAIP (leukemia associated immunophenotype). Ceux-ci permettront à terme de distinguer spécifiquement les blastes des autres cellules et constitueront les marqueurs de suivi de maladie résiduelle spécifiques de la maladie du patient. Il peut s’agir de :
– marqueurs aberrants dit d’infidélité de lignée (ex : CD13 ou CD33 dans une LALB)
– marqueurs anormalement sur ou sous exprimés
– coexpressions anormales de CD, témoignant d’une anomalie dans la différenciation (ex : coexpression de marqueurs d’immaturité et de marqueurs présents dans les cellules très différenciées) .

Génétique

L’analyse génétique des cellules anormales constitue le dernier élément indispensable au diagnostic, à la classification et surtout au pronostic de la leucémie aigüe. Plus récemment, l’apport théranostique est de plus en plus validé et mis en avant dans la littérature. Le profil génétique tumoral peut permettre d’orienter vers une thérapeutique ciblée comme c’est le cas par exemple dans les LAL avec chromosome Philadelphie ou Ph-like. De manière générale, nous aurons une modification de la présentation clinique et biologique, de l’évolution, de la réponse thérapeutique et du risque de rechute en fonction des caractéristiques génétiques des cellules leucémiques. Cependant, la cytogénétique conventionnelle et la biologie molécualire n’identifient aucune anomalie clonale primaire dans 25% des LAL pédiatriques.

Cytogénétique
La cytogénétique permet de rechercher les anomalies de nombre de chromosomes (aneuploïdies) ainsi que les anomalies de structure récurrentes (translocations, délétions …) ayant un rôle central dans la classification OMS 2016 et une valeur pronostique de premier plan .

En ce qui concerne les LALB de l’enfant, l’hyperdiploïdie constitue l’anomalie la plus fréquente (25% des cas de LAL pédiatriques) (1)(12) avec un pronostic favorable (13). Inversement, l’hypodiploïdie est plus rare, 1% des cas de LAL pédiatriques, mais associée à un pronostic plutôt défavorable (6). Dans les translocations récurrentes de bon pronostic, on retrouve la t(12;21) dans 25% des cas de LAL pédiatriques (6). Inversement, les réarrangements impliquant le gène KMT2A quant à eux ne sont retrouvés que dans 5% des cas en général mais concernent jusqu’à 80% des enfants de moins de un an avec un pronostic restant défavorable (6). L’amplification intra-chromosomique du chromosome 21 identifiée dans moins de 2% des cas classera le patient immédiatement en haut risque mais avec un pronostic largement amélioré par les thérapies intensives (14)(15). La translocation (9;22) ou chromosome Philadelphie (Ph) classique de la LAL de l’adulte, n’est mise en évidence que dans 3% des LAL de l’enfant mais doit être systématiquement recherchée car elle confère la possibilité d’une réponse aux anti-tyrosine kinase de type Imatinib. Le pronostic de ces LAL B Ph positive a été considérablement amélioré par l’avènement de ces thérapeutiques.

Biologie Moléculaire 

La biologie moléculaire arrive dans un second temps mais reste indispensable surtout pour les LAL avec un caryotype normal afin de rechercher les anomalies ayant un intérêt pronostique. Ces patients seront classés dans la catégorie dite « B other ». De plus en plus de marqueurs moléculaires à forte valeur pronostique sont mis en évidence tels que des mutations au sein de gènes impliqués dans le développement, la différenciation et la prolifération de la lignée B qui apparaissent chez 40% des patients (6). La plupart du temps on réalise le séquençage de panels de gènes impliqués ou de la RT-PCR à la recherche de mutations ou de réarrangements. La MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) est une forme de PCR multiplex semi-quantitative avec ligation qui permet d’évaluer le nombre de copies de gènes de manière simultané pour des dizaines de loci (16). Elle est utile pour identifier les délétions, duplications et amplifications d’intérêt notable. A noter que les délétions peuvent tout à fait être identifiées par CGH-array.

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Table des matières

INTRODUCTION
I. LEUCEMIES AIGÜES : GENERALITES
A. DIAGNOSTIC et CLASSIFICATIONS
1. Clinique : une pathologie aigüe
2. Cytologie, l’élément central
3. Immunophénotypage
4. Génétique
a) Cytogénétique
b) Biologie Moléculaire
B. PRONOSTIC et EVOLUTION
1. Facteurs pronostics pré-thérapeutiques
2. Prise en charge
II. LA PLOÏDIE
A. DEFINITIONS
B. UN OUTIL PRONOSTIC MAJEUR
1. Hyperdiploïdie : anomalie de bon pronostic
2. Hypodiploïdie : un pronostic plus sombre
C. LES TECHNIQUES DE DETERMINATION DE LA PLOÏDIE
1. Caryotype Standard
2. Cytogénétique moléculaire
a) FISH
b) CGH/SNP-Array
à La CGH conventionnelle
à La CGH-array
à La SNP-array
3. Cytométrie en flux
OBJECTIF DE LA THESE
MATERIEL ET METHODE 
I. LES PATIENTS
II. LES TECHNIQUES REALISEES
A. L’index d’ADN
B. Caryotype et FISH
1. Mise en Culture
2. Sortie de Culture
3. Dénaturation et Caryotypage
4. Hybridation in situ
C. CGH/SNP-array
RESULTATS
I. ANOMALIES CYTOGENETIQUES OBSERVEES DANS NOTRE COHORTE
II. CONCORDANCE DES TECHNIQUES
III. DESCRIPTION DE CAS PRESENTANT UNE PARFAITE CONCORDANCE DES TECHNIQUES
A. CAS n°1 avec hyperdiploïdie classique
B. CAS n°2 avec hypodiploïdie sévère
IV. DESCRIPTION DE CAS AYANT PRESENTE DES DIFFICULTES DIAGNOSTIQUES
A. Echec de caryotype : CAS n°3
B. Un caryotype apparemment normal : CAS n°4
C. Hypodiploïdies masquées : CAS n° 5 et 6
DISCUSSION
CONCLUSION

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