Les types de diabètes insipides héréditaires

Le diabète central

Définition Ce type de diabète héréditaire tire son nom du fait que l’origine de la maladie réside au point de départ de la production de l’AVP. Par conséquent, le taux plasmatique de l’hormone sera très faible, voire quasi nul, donc les cellules rénales resteront insensibles à son action et il n’y aura aucun mécanisme de concentration de l’urine mis en jeu. La conséquence ultime sera une réabsorption hydrique très limitée au niveau du rein, ce qui entraînera une diurèse très importante avec une très faible osmolalité (Zerbe and Robertson 1984).
Etiologies Les étiologies du diabète insipide central sont variables: elles sont de nature acquise ou héréditaire. La forme acquise survient lorsque les noyaux supra-optiques et paraventriculaires subissent des dommages: la destruction des noyaux supra-optiques et paraventriculaires, lors d’un acte chirurgical par exemple, entraînera un diabète insipide central permanent. À l’opposé, il est observé des types de diabètes post-chirurgie transitoires. La forme héréditaire de ce diabète est causée par des mutations autosomiques dominantes ou récessives du gène codant l’AVP (Guyton and Hall 2000). Dans la plupart des cas, l’hérédité est autosomique dominante et la fonction de l’allèle normal est altérée. Il s’agit en fait d’un processus d’accumulation progressive des précurseurs de l’AVP mal conformés dans le réticulum endoplasmique (RE) des cellules magnocellulaires. Cette accumulation est toxique pour la cellule et il va s’ensuivre une autophagie des précurseurs (Bichet 2006). De très rares cas de transmission autosomique récessive ont été référencés et sont le plus souvent associés à un syndrome de Wolfram (caractérisé par différentes manifestations neurologiques et endocriniennes, entre autres, un diabète sucré, un DIN, une atrophie optique, des démences, des maladies mentales, etc.) (Minton, Rainbow et al. 2003). Ces défauts génétiques sont liés à des anomalies localisées sur le chromosome 4 et en particulier au niveau des gènes codant la wolframine, le gène WFS1 (Inoue, Tanizawa et al. 1998; Strom, Hortnagel et al. 1998), et le gène codant la protéine ERIS (« endoplasmic reticulum intermembrane small protein »), le gène ZCD2 (Amr, Heisey et al. 2007). Ces protéines sont toutes deux localisées au niveau du réticulum endoplasmique et jouent un rôle très important sur l’homéostasie calcique cellulaire (Takeda, Inoue et al. 2001; Osman, Saito et al. 2003; Amr, Heisey et al. 2007).

L’aquaporine-2

   Au contraire des molécules d’AQP1 et d’AQP3, dont l’expression est ubiquitaire, les molécules d’AQP2, sont présentes exclusivement au niveau du tubule collecteur rénal et plus particulièrement au niveau des cellules principales où elles vont permettre la réabsorption hydrique et ainsi participer activement au mécanisme de concentration urinaire (Fushimi, Uchida et al. 1993; Fushimi, Sasaki et al. 1994; Nielsen, Frokiaer et al. 2002). Cependant, de nombreuses études ont permis de démontrer que dans ces cellules, les molécules d’AQP2 étaient localisées dans des zones bien précises: tout d’abord et avant tout, au niveau de la membrane plasmique apicale qui est en contact avec la lumière du canal, et d’autre part, dans des vésicules intracellulaires, ou agrégophores (Nielsen, DiGiovanni et al. 1993; Nielsen, Chou et al. 1995; Nielsen, Marples et al. 1995; Borgnia, Nielsen et al. 1999). Il semblerait que, comme Wade et al. l’ont proposé au début des années 80, suite à la liaison de l’AVP sur son récepteur, situé à la membrane basolatérale des cellules, les vésicules précédemment citées, fusionnent avec la membrane apicale (Wade, Stetson et al. 1981). En effet, des études d’immunolocalisation des molécules d’AQP2 au niveau des CPTC, ont mis en évidence un système de « navette » de ces vésicules entre le compartiment cytoplasmique et la membrane apicale suite à la liaison de l’AVP (Nielsen, Chou et al. 1995). De plus, ce trafic des vésicules est un processus réversible: à l’arrêt de l’administration d’AVP ou de son analogue, la dDAVP, ces mêmes expériences de localisation cellulaire ont montré une diminution du nombre de molécules d’AQP2 à la membrane. Ceci semble confirmer le fait que les molécules d’AQP2, préalablement contenues dans les vésicules intracellulaires, gagnent la membrane suite à la liaison de l’AVP sur l’AVPR2 (Wade, Stetson et al. 1981). D’un point de vue moléculaire, le processus aboutissant à la fusion des vésicules à la membrane fait suite à une série d’évènements, décrits dans le chapitre traitant de la protéine de l’AVPR2 (voir, « Voie de signalisation », page 66), permettant l’activation de la PKA qui va, à son tour activer la translocation des vésicules. En effet, les molécules d’AQP2 possèdent un site consensus pour cette kinase au niveau de l’extrémité C-terminale, le motif RRQS (Arginine-Arginine-Glutamine-Sérine). Suite à l’activation du récepteur à l’AVP, la Sérine de ce motif, en position 256, va être très rapidement (moins d’une minute) phosphorylée par la PKA (Nishimoto, Zelenina et al. 1999; Christensen, Zelenina et al. 2000). Ce délai concorde avec le temps nécessaire à l’AVP pour augmenter la perméabilité de la membrane tel que démontré par Wall et col. (Wall, Han et al. 1992). Plus récemment, il a été prouvé que cette même sérine pouvait être la cible d’une seconde kinase, la G-CK (« Golgi apparatus casein kinase ») (Procino, Carmosino et al. 2003). En effet, la séquence primaire de l’AQP2 révèle, au niveau du site de phosphorylation par la PKA, la présence du site cible de la G-CK: RRQSVEL (Arginine-Arginine-Glutamine-Sérine-Valine-GlutamateLeucine) dont le résidu indispensable à l’action de la kinase, l’acide glutamique, est présent (Procino, Carmosino et al. 2003). De plus, l’étude des mutants de l’AQP2, S256A et E258K, suggère que la phosphorylation par la G-CK soit nécessaire au transport des molécules du Golgi vers les vésicules intracellulaires et que la PKA ne permette que la translocation de ces vésicules à la membrane (Procino, Carmosino et al. 2003). Ce système de régulation d’expression des molécules d’AQP2 est dit « à court terme » puisqu’il fait suite à la stimulation du récepteur à la vasopressine en réponse à une sensation de soif de l’organisme. Cependant, et de manière pour le moins surprenante, il semblerait que ce processus de translocation des vésicules à la membrane ne dépende pas uniquement de la phosphorylation des résidus Sérine256 des molécules d’AQP2. En effet, différentes équipes ont montré que l’accumulation d’AQP2 à la membrane pouvait avoir lieu malgré l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de la PKA, et ce malgré la stimulation de l’AVPR2 par l’AVP (Valenti, Procino et al. 2000; Lu, Sun et al. 2004). De plus, le recyclage des molécules d’AQP2 exprimées à la membrane, serait extrêmement rapide et aurait lieu de manière constitutive (Lu, Sun et al. 2004). Parallèlement au système de régulation de l’expression de l’AQP2 « à court terme », un second mécanisme a été mis en évidence. Ce dernier serait lié à l’existence d’un élément de réponse à l’AMPc (« cAMP response element » ou CRE) situé dans le promoteur du gène de l’AQP2 et jouerait donc sur l’activation de la transcription de ce gène (Yasui, Zelenin et al. 1997). En effet, un traitement à long terme à la dDAVP durant 5 jours ou une restriction hydrique de 24 à 48 heures entraîne une expression continue de molécules d’AQP2 à la membrane (Nielsen, DiGiovanni et al. 1993; DiGiovanni, Nielsen et al. 1994; Knepper 1997). Ce traitement à la dDAVP, ou la sécrétion d’AVP, entraînant une production continue d’AMPc, ce dernier pourrait lier le CRE dans le promoteur et ainsi activer la transcription du gène de l’AQP2 sur une plus longue durée (Hozawa, Holtzman et al. 1996). Pour cette raison, ce système porte le nom de « régulation à long terme ».

Classe de protéines: les récepteurs couplés aux protéines G

   Les RCPG semblent faire partie des plus anciens transducteurs de signaux: en effet, ils sont retrouvés dans des espèces aussi variées que les plantes, les levures, les champignons, les protozoaires, les métazoaires ainsi que les mammifères (Dohlman, Thorner et al. 1991; Devreotes 1994; Vernier, Cardinaud et al. 1995; New and Wong 1998; Plakidou-Dymock, Dymock et al. 1998; Bockaert and Pin 1999). La famille des RCPG regroupe le plus grand nombre de récepteurs connus à ce jour: plus de 1% du génome humain code pour ce type de protéines. Depuis le clonage du premier récepteur, près de 800 gènes et plus de 1000 RCPG ont été identifiés (Takeda, Kadowaki et al. 2002). Parmi ce nombre considérable de récepteurs, il est intéressant de noter que ceux-ci peuvent lier des molécules aussi diverses et variées que des hormones, des molécules du goût, de l’odorat, des ions, des photons, des lipides, des amines ainsi que de très grandes molécules telles que des protéines (Gether 2000) (Figure 8). À la suite de la liaison du ligand spécifique du récepteur ou à la réception d’un signal physique, il va s’opérer un changement conformationnel à l’intérieur des sept hélices transmembranaires (Meng and Bourne 2001; Okada, Ernst et al. 2001). Cette modification structurelle va être ensuite transmise au niveau de la boucle cytoplasmique du récepteur qui activera à son tour un second membre de la voie de signalisation, ou protéine signal (Bockaert and Pin 1999). Dans la majorité des récepteurs à sept segments transmembranaires, cette protéine signal est une protéine G hétérotrimérique. Par la suite, cette dernière va moduler différents effecteurs (adénylate cyclase, phospholipase A et C) ce qui entraînera une augmentation de la production d’AMPc ou une élévation du taux de calcium intracytoplasmique provoquant une réponse cellulaire. Un tel mécanisme de rhodopsine. D’après (Palczewski, Kumasaka et al. 2000).
Structure des RCPG D’un point de vue structurel, les sept segments transmembranaires, constitués d’hélices α hydrophobes de grandeur variable en fonction du récepteur (de 25 à 35 résidus) et maintenues entre elles par une multitude de liaisons hydrogène, forment une structure compacte en forme de baril, ou corps central (Baldwin 1993). Les travaux de l’équipe de K. Palczewski ont fourni la première structure à haute résolution d’un récepteur couplé aux protéines G, la rhodopsine bovine, par cristallographie aux rayons X (Palczewski, Kumasaka et al. 2000). Cette structure a permis de confirmer l’arrangement ainsi que l’orientation des sept hélices transmembranaires formant le corps central des RCPG (Figure 9). Les domaines transmembranaires sont connectés entre eux par trois boucles extracellulaires et trois boucles intracellulaires de longueur variable, de 10 à 40 résidus voir Le domaine cytoplasmique est en haut et le domaine extracellulaire, en bas. Les 3 boucles extra et intracytoplasmiques sont représentées. Une quatrième boucle intracellulaire, due à un ancrage lipidique consécutif à la palmitoylation d’une cystéine, apparaît au niveau de l’extrémité C-terminale. Le RCPG de la rhodopsine est particulier : le ligand est présent de manière constitutive dans le récepteur. En effet, Le chromophore est présent à l’intérieur du corps central lié à une lysine. Lorsque le photon va l’exciter, il y aura changement de conformation du récepteur et transmission du signal. 150 pour la troisième boucle intracytoplasmique. Les régions N-terminale et C-terminale sont localisées respectivement au niveau extracellulaire et intracellulaire (Figure 10). Si les séquences des segments transmembranaires présentent de très fortes homologies, les boucles hydrophiles ainsi que les extrémités N et C-terminales divergent énormément d’un récepteur à l’autre. Plus récemment, une équipe internationale est parvenue à cristalliser un second membre des RCPG de la famille A (voir « Famille des RCPG », page 38), le récepteur β2- adrénergique humain (β2AR) (Cherezov, Rosenbaum et al. 2007; Rasmussen, Choi et al. 2007; Rosenbaum, Cherezov et al. 2007). De ces études, il ressort que la structure de ce RCPG, bien qu’il comporte effectivement sept segments transmembranaires (Figure 11, page 37), présente certaines divergences avec le récepteur de la rhodopsine (Cherezov, Rosenbaum et al. 2007). En effet, bien que ces auteurs aient modifié la structure du récepteur en remplaçant la troisième boucle intracellulaire par la protéine lysozyme T4 et en éliminant l’extrémité N-terminale, ces modifications ayant pour seul but de faciliter la cristallisation sans altérer les propriétés du récepteur (Rosenbaum, Cherezov et al. 2007), le β2AR comporte deux segments supplémentaires. Tout d’abord nous pouvons distinguer une huitième hélice, à priori commune à bon nombre de RCPG (Katragadda, Maciejewski et al. 2004), ainsi qu’une petite hélice supplémentaire et un pont disulfure inhabituels au niveau de la deuxième boucle extracellulaire (Figure 12) (Cherezov, Rosenbaum et al. 2007). Les deux récepteurs sont enchâssés dans la membrane lipidique de part et d’autre des molécules de cholestérol. Le ligand est représenté en vert.  De plus, il apparaît que les extrémités cytoplasmiques des segments transmembranaires III et VI présentent des interactions plus faibles que dans la rhodopsine (Figure 13) (Rasmussen, Choi et al. 2007; Rosenbaum, Cherezov et al. 2007). Cette caractéristique pourrait expliquer à la fois l’instabilité structurale et le haut niveau d’activité de ce récepteur comparativement au récepteur à la rhodopsine (Rasmussen, Choi et al. 2007). En effet, dans le cas de ce dernier, le réseau de liaison hydrogène entre ces deux segments transmembranaires forme un « loquet ionique » (« ionic lock ») qui stabilise le récepteur dans sa conformation inactive (Ballesteros, Jensen et al. 2001).
Familles des RCPG Les différents RCPG ont été classés en trois familles en fonction de leurs homologies de séquences et donc de structure (Gether 2000). Les membres de chacune de ces trois familles, présentent une similitude: en effet, chaque membre possède, dans les premières et deuxièmes boucles extracellulaires, deux résidus cystéines permettant la formation d’un pont disulfure responsable de la stabilité du récepteur (Dixon, Sigal et al. 1987; Dohlman, Caron et al. 1990). De plus, chacun des membres de ces trois familles, possède, au niveau de son extrémité N-terminale, différents sites potentiels de N-glycosylation; cette Rhodopsine active Rhodopsine inactive modification post-traductionnelle permet de réguler l’expression des récepteurs à la surface cellulaire. En effet, l’inhibition de cette glycosylation entraîne une diminution du taux d’expression du récepteur à la membrane, c’est le cas par exemple pour les récepteurs β2 adrénergiques et à la rhodopsine (Rands, Candelore et al. 1990; Liu, Davis et al. 1993). Mises à part ces caractéristiques communes, les membres des trois familles divergent assez sensiblement au niveau structural (Figure 14). Les membres appartenant à la famille B, tel que les hormones de haut poids moléculaire (glucagon, sécrétine, calcitonine, etc.) présentent une longue extrémité N-terminale. Celleci contient au minimum six résidus cystéine formant très certainement un réseau de ponts disulfure impliqué dans la reconnaissance du ligand. Enfin, la famille C, regroupant les récepteurs au glutamate, aux ions calcium, à l’acide gamma-aminobutyrique (GABA), molécules du goût, se caractérise par un très long domaine N-terminal contenant le site de fixation du ligand ainsi que par une troisième boucle cytoplasmique relativement petite. L’extrémité C-terminale des membres de cette famille peut être de longueur très variable, bien qu’en général très longue.
Transduction du signal Comme il a été mentionné auparavant, chacun des RCPG est obligatoirement associé à une protéine G chargée de véhiculer le message reçu par le récepteur suite à la liaison d’un ligand donné (photons, hormones, protéines, ions, etc.). Les protéines G sont des hydrolases régulatrices de nucléotide à guanosine triphosphate (GTP) hétérotrimériques se composant de trois sous-unités, α, β et γ. Les sous-unités α et γ sont liées à la membrane par des lipides; la sous-unité β quant à elle, est liée à la sous-unité γ. Dans la forme inactive de la protéine, les trois sous-unités sont liées entre elles, mais indépendantes du récepteur, et la sous-unité α est liée au guanosine diphosphate (GDP) (Figure 15, page 42) . Une fois le ligand fixé au récepteur, celui-ci va activer, suite à un changement conformationnel, la protéine G hétérotrimérique en se liant à elle par l’intermédiaire de la sous-unité α et peut-être également par la sous-unité γ. Cette liaison de la protéine G au récepteur va entraîner un changement de conformation de la sous-unité α provoquant le largage du GDP suivi de la liaison du GTP ce qui entraînera la dissociation de l’ensemble βγ/protéine G (Marinissen and Gutkind 2001). Les deux complexes, sous-unité α/GTP et β/γ vont pouvoir activer leurs effecteurs intracellulaires et engendrer une réponse cellulaire. Une fois le signal transmis aux effecteurs, il va y avoir hydrolyse du GTP, dissociation des complexes sous-unité α/effecteurs et réassociation des sous-unités α et βγ. Ainsi, la protéine G retrouvera une conformation native inactive propice à une nouvelle activation par le récepteur. Jusqu’à présent, on dénombre 20 sous-unités α, 6 sous-unités β et 11 sous-unités γ (Neves, Ram et al. 2002). Les protéines G sont classées en différentes familles en fonction de la nature de la sous-unité α: on distingue ainsi les familles Gαs, Gαi, Gαq/11 et Gα12/13 (Neves, Ram et al. 2002). Chacune de ces familles peut moduler différents effecteurs ce qui entraînera une grande diversité de signaux (Figure 16) (Ulloa-Aguirre, Stanislaus et al. 1999; Neves, Ram et al. 2002). En effet, d’un point de vue général, la sous-unité Gα va pouvoir contrôler des enzymes (phospholipases A2 et C, adénylate et guanylate cyclase, c-Jun kinase, tyrosine phosphatase, etc.) dont le rôle va être de moduler le taux de second messagers (phosphoinositides et glycérol, Ca++, AMPc, GMPc, etc.), des canaux potassiques, calciques, sodiques ou chlore, des échangeurs ioniques (sodium/proton), des kinases (tyrosine kinase) ou des MAP kinases (« mitogen-activated protein kinase ») (Bockaert and Pin 1999). De manière plus détaillée, les protéines Gαs vont activer la voie de l’adénylate cyclase ce qui va provoquer une augmentation de la concentration intracellulaire d’AMPc suite à l’hydrolyse d’adénosine triphosphate (ATP). Cet AMPc va ensuite activer la PKA impliquée dans de nombreuses réponses cellulaires. Les sous-unités Gαi quant à elles vont, au contraire, inhiber cette voie de la PKA. Dans le cas des sous-unités Gαq, la phospholipase C (PLC) va être stimulée, ce qui engendrera une hydrolyse du phosphoinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) en diacylglycérol (Prié, Ronco et al.) et inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). Ces deux derniers composés, vont permettre une augmentation de la concentration calcique intracellulaire ainsi qu’une activation de la protéine kinase C (PKC). Les sous-unités Gα12/13 vont, pour leur part, activer la voie de la phospholipase A2 (PLA2) (Ulloa-Aguirre, Stanislaus et al. 1999). De plus, il est important de noter que différents effecteurs des protéines G (PKA, PKC, PLA2 ainsi que les ions calcium (Ca++)) peuvent activer la voie des MAP kinases avec pour conséquence, une stimulation des facteurs de transcription (Thibonnier, Preston et al. 1997; Wetzker and Bohmer 2003). D’une manière pour le moins surprenante, divers travaux ont montré qu’un même récepteur pouvait activer de multiples seconds messagers. Ainsi, il a été prouvé que le récepteur endogène à la TSH (« thyroid-stimulating hormone ») n’activait pas uniquement les sousunités Gαs et Gαq/11, mais également les familles Gαi et Gα12 indiquant qu’il existait dans les cellules une modulation pour le moins complexe des voies de transduction du signal et donc des réponses cellulaires (Figure 17, page 45) (Laugwitz, Allgeier et al. 1996; Marinissen and Gutkind 2001). Le complexe de sous-unités βγ peut également moduler l’activité de nombreux effecteurs: des enzymes (PLA2 et C, adénylate cyclase, etc.), des canaux (calciques dépendant du voltage, sodiques ou potassiques à rectification entrante) ainsi que des kinases (phosphoinositide3 kinase, β-adrenergique receptor kinase, c-Jun kinase, MAP kinase, etc.) (Jan and Jan 1997; Schneider, Igelmund et al. 1997; Ulloa-Aguirre, Stanislaus et al. 1999; Marinissen and Gutkind 2001).
Désensibilisation et oligomérisation des RCPG Une stimulation continue ou prolongée d’un récepteur par un ligand, ou un agoniste, entraîne une atténuation de la réponse cellulaire. Ce phénomène, appelé « désensibilisation » vise, en fait, à protéger la cellule contre une stimulation excessive. En effet, une équipe a démontré qu’un défaut du mécanisme de « désensibilisation » entraînait des effets toxiques pour la cellule ainsi qu’une signalisation anarchique (Bohm, Grady et al. 1997). Ce mécanisme de « désensibilisation », qui se produit très rapidement (de quelques secondes à quelques minutes après l’activation du récepteur), implique la phosphorylation de celui-ci au niveau des boucles extracellulaires et de l’extrémité C-terminale (Benovic, Pike et al. 1985). Cette réaction est réalisée par les kinases des RCPG (« G protein-coupled receptor kinase » ou GRK) ou par des kinases qui sont elles-mêmes activées par les seconds messagers, comme par exemple la PKA et la PKC. La phosphorylation du Figure 17. Voies d’activation des RCPG et transduction du signal en fonction des sous-unités. D’après (Marinissen and Gutkind 2001). récepteur va ensuite provoquer le recrutement d’une protéine soluble du cytosol, l’arrestine, ce qui entraînera, la liaison de clathrine (Goodman, Krupnick et al. 1996) ainsi que le découplage du récepteur et de la protéine G et provoquera l’internalisation du récepteur en vue de son recyclage ou de sa dégradation (Bouvier, Hausdorff et al. 1988; Hausdorff, Bouvier et al. 1989; Lohse, Benovic et al. 1990; Ferguson, Menard et al. 1995; Gurevich, Dion et al. 1995). À l’origine, le modèle traditionnel de fixation d’un ligand sur un récepteur couplé aux protéines G était basé sur l’idée qu’un ligand liait son récepteur sous forme monomérique (stœchiométrie récepteur/protéineG/effecteur 1:1:1) (Stryer 1986; Gilman 1987; Birnbaumer, Abramowitz et al. 1990; Park, Filipek et al. 2004). Cependant, plusieurs études ont clairement montré que les RCPG, comme de très nombreux récepteurs (tyrosine kinase, facteurs de croissance, cytokines, etc.) pouvaient se trouver sous forme d’homo ou d’hétérodimères (Angers, Salahpour et al. 2000; Salahpour, Angers et al. 2000; Angers, Salahpour et al. 2002; Terrillon and Bouvier 2004). En effet, à partir de la seconde moitié des années 90, il est apparu que l’ensemble des RCPG analysés existaient sous forme dimérique. Il est dorénavant admis que l’activité des récepteurs (transport dans le réticulum endoplasmique, liaison du ligand et transduction du signal) est étroitement liée à leur dimérisation, favorisant les interactions RCPG/protéines accessoires (Hebert and Bouvier 1998; George, Fan et al. 2000; Salahpour, Angers et al. 2000; Bouvier 2001; Angers, Salahpour et al. 2002; Brady and Limbird 2002; Milligan, Ramsay et al. 2003; Park, Filipek et al. 2004; Terrillon and Bouvier 2004) . La preuve « structurelle » d’un tel phénomène de dimérisation a été apportée en 2003 par l’équipe de K. Palczewsky grâce à l’utilisation d’un microscope à force atomique (Fotiadis, Liang et al. 2003). En effet, cette équipe a montré pour la première fois que la rhodopsine existait sous forme de dimères dans la rétine: les récepteurs apparaissent organisés en rangées de dimères (Figure 18, page 47). Cependant, et malgré le fait que cette dimérisation ait été mise en évidence pour de nombreux RCPG, certaines questions restent à l’heure actuelle en suspens. La première, et la plus importante d’entre elles, est tout simplement de savoir si cette dimérisation est un processus général des RCPG, et donc, si leur activation normale implique obligatoirement ce phénomène. Ensuite, les réponses à apporter concerneront le rôle de la dimérisation dans l’internalisation des récepteurs, dans l’affinité du ligand pour son récepteur et enfin dans la transduction du signal.

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Table des matières

Introduction bibliographique
1. Les diabètes insipides
1.1. Définitions
1.2. Les types de diabètes insipides héréditaires
1.2.1. L’hormone antidiurétique
1.2.1.1. Structure et synthèse de l’hormone antidiurétique
1.2.1.2. Régulation et sécrétion de l’hormone antidiurétique
1.2.1.3. Fonctions de l’hormone antidiurétique
1.2.2. Le diabète central
1.2.2.1. Définition
1.2.2.2. Etiologies
1.2.3. Les diabètes insipides néphrogéniques héréditaires (DIN)
1.2.3.1. Définitions et types de DIN
1.2.3.1.1. Le DIN lié à l’X
1.2.3.1.2. Le DIN autosomique récessif et dominant
1.2.3.2. Les causes des DIN
1.2.3.2.1. Le récepteur à la vasopressine de type 2
1.2.3.2.2. L’aquaporine-2
1.2.3.2.2.1. Propriétés générales des aquaporines
1.2.3.2.2.2. L’aquaporine-2
1.2.3.2.2.3. L’aquaporine-2 et DIN
1.2.3.3. Signes cliniques et dépistage précoce de la maladie
1.2.3.3.1. Signes cliniques
1.2.3.3.2. Dépistage
2. Les récepteurs à la vasopressine
2.1. Les types de récepteurs
2.1.1. Classe de protéine : les récepteurs couplés aux protéines G
2.1.1.1. Structure des RCPG
2.1.1.2. Famille des RCPG
2.1.1.3. Transduction du signal
2.1.1.4. Désensibilisation et oligomérisation des RCPG
2.1.2. Localisations et voies de signalisation
2.1.2.1. Les récepteurs V1a
2.1.2.2. Les récepteurs V1b
2.1.2.3. Les récepteurs à l’ocytocine
2.2. Les récepteurs à la vasopressine de type 2
2.2.1. Le gène de l’AVPR2
2.2.1.1. Structure
2.2.1.2. Expression spatio-temporelle
2.2.1.3. Défauts de structure de l’AVPR2 et DIN
2.2.1.4. Gène de l’AVPR2 normal et DIN
2.2.2. Propriétés générales des récepteurs de type 2
2.2.2.1. Classe de protéine
2.2.2.2. Voie de signalisation
2.2.2.3. Effet moléculaire de l’activation de l’AVPR2
2.2.2.4. Défauts de structure de l’AVPR2 et DIN
3. Expression et régulation des gènes chez les eucaryotes
3.1. L’expression des gènes chez les eucaryotes
3.1.1. La structure chromatinienne
3.1.1.1. L’ADN
3.1.1.2. La chromatine
3.1.2. Les différentes classes de gènes et de polymérases
3.1.2.1. Définition d’un gène
3.1.2.2. Les différents types de gènes et de polymérases
3.1.2.3. Les gènes de classe II
3.1.3. Structure et expression d’un gène de classe II
3.1.3.1. Rôle du promoteur : initier la transcription
3.1.3.1.1. Structure du promoteur
3.1.3.1.2. Formation du complexe de pré initiation (CPI)
3.1.3.2. Mécanisme général de la transcription : formation des pré-ARNm
3.1.3.3. La maturation des pré-ARNm chez les eucaryotes
3.1.3.4. L’export et la traduction des messagers matures
3.2. La régulation de l’expression des gènes
3.2.1. Importance que l’expression des gènes soit régulée
3.2.2. Les différents niveaux de régulation dont la cellule dispose
3.2.2.1. Au niveau de la structure chromatinienne
3.2.2.2. Activation de la transcription des gènes
3.2.2.2.1. Les régions régulatrices
3.2.2.2.1.1. Description
3.2.2.2.1.2. Fonctions
3.2.2.2.2. Les protéines régulatrices
3.2.2.2.2.1. Structure générale
3.2.2.2.2.2. Types de protéines régulatrices
Matériels et méthodes
4. Identification des zones délétées en amont du promoteur proximal de l’AVPR2
4.1. Amplification par réaction de polymérase en chaine (PCR) de l’ADN de patient
4.2. Séquençage du produit PCR du gène de l’AVPR2
4.3. Recherche de marqueurs de la transmission liée à l’X
4.4. Délimitation des points de cassure des délétions
4.5. Test au dDAVP
5. Expériences in vitro
5.1. Étude visant à confirmer le rôle de l’élément distal
5.1.1. Clonage de l’élément distal en amont du gène rapporteur
5.1.2. Promoteur de la β-globine
5.1.3. Multimérisation de l’élément distal
5.1.4. Constructions comportant une séquence similaire à TonEBP localisée en 5’ de la délétion
5.2. Lignées et culture cellulaires
5.2.1. Cellules du tubule proximal
5.2.2. Cellules du tubule collecteur
5.2.3. Lignée témoin
5.2.4. Culture cellulaire
5.3. Expériences de transfection transitoire
5.3.1. Principe de la transfection transitoire
5.3.2. Technique de transfection à la lipofectamine plus®
5.4. Caractérisation des protéines liant l’extrémité 5’ du DE chez la levure
5.4.1. Principe de la technique du simple hybride
5.4.2. Clonage de l’élément supposé régulateur
5.4.3. Fabrication et clonage de la banque d’ADNc de la médullaire rénale de rat
5.4.4. Souche de levure et milieux de croissance et de sélection utilisés
5.4.5. Transformation des levures
5.4.5.1. Par la banque d’ADNc
5.4.5.2. Par les vecteurs contenant les protéines d’intérêt
5.4.6. Extraction des plasmides d’intérêt
5.4.7. Vérification de la spécificité des protéines potentielles
5.4.7.1. Constructions utilisées
5.4.7.2. Co-transformation dans la levure et milieux de sélection
6. Expériences in vivo
6.1. Validation des résultats obtenus in vitro chez la souris
6.1.1. Principe
6.1.2. Introduction de la séquence régulatrice dans le locus Hprt de la souris
6.1.2.1. Constructions et vecteurs utilisés
6.1.2.2. Cellules souches embryonnaires et recombinaison homologue
6.1.2.3. Obtention de lignées homozygotes
Résultats
7. Identification des zones délétées chez les patients atteints de DIN
7.1. Phénotype des patients porteurs de délétions et confirmation de la transmission liée à l’X
7.2. Détermination des délétions et des points de cassure
7.3. Effet de l’administration de dDAVP aux patients porteurs de délétions
7.4. Récapitulatif des délétions identifiées
8. Confirmation du rôle « enhancer » de l’élément distal dans les cellules rénales
8.1. Comparaison de l’effet dans les trois lignées cellulaires
8.2. Effet de l’élément distal sous l’influence du promoteur de la β-globine
8.3. Effet de la multimérisation dans chacune des lignées cellulaires
8.4. Identification des zones importantes dans l’expression de l’AVPR2 à
l’intérieur de l’élément distal
9. Caractérisation des protéines liant l’extrémité 3’ de la délétion
9.1. Résultats obtenus suite au « screening » de la banque d’ADNc rénal
9.2. Analyse détaillée des huit protéines potentiellement positives
9.2.1. Analyse bibliographique des protéines
9.2.1.1. Protéines connues
9.2.1.1.1. Cut-like 1
9.2.1.1.2. HP1-BP74
9.2.1.1.3. Transcription elongation factor B, polypeptide 1-like
9.2.1.1.4. FLYWCH-type zinc finger 1
9.2.1.2. Protéines « inconnues »
9.2.2. Vérification de la spécificité de chacune des protéines
10. Séquence homologue à TonEBP
10.1. Étude de l’effet de TonEBP5’
10.2. Effet de la modification de la tonicité des cellules
10.2.1. Effet basal de l’hypertonicité
10.2.2. Comparaison de l’effet de la tonicité cellulaire en fonction du promoteur
11. Modèle murin
11.1. Reconstitution du locus Hprt dans les cellules ES
11.2. Etude de l’expression du gène rapporteur sous la dépendance de l’élément distal dans différents endothéliums
11.2.1. Dans les glomérules rénaux
11.2.2. Au niveau du plexus choroïde
11.2.3. Au niveau des cellules vasculaires hépatiques
11.3. Comparaison du marquage du vecteur d’expression de l’AVPR2 et de deux autres gènes exprimés au niveau rénal
Discussion
Conclusions et perspectives
Bibliographie

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