IBTS-77-RP-1000
Les origines des TIAC par Staphylococcus aureus dans les produits laitiers
S. aureus, plus couramment appelé staphylocoque doré en raison de la couleur jaune des colonies qu’il forme sur gélose, est une bactérie sphérique à Gram positif, anaérobie facultative, immobile et formant des amas réguliers à la manière de grappe de raisins. Cette espèce fait partie du genre Staphylococcus qui peut être divisé en deux groupes : les staphylocoques à coagulase positive et les staphylocoques à coagulase négative. La coagulase produite par les staphylocoques à coagulase positif tels que S. aureus est une exoenzyme capable de coaguler le plasma sanguin et constitue un moyen d’identification simple et rapide.
Une intoxication alimentaire due à S. aureus est suspectée lorsque des symptômes, tels que nausées, vomissements, crampes abdominales et diarrhée, affectent des individus 1 à 8 h après l’ingestion d’aliments. Ces symptômes sont dus à l’action des entérotoxines que la bactérie peut produire au cours de sa croissance. La présence de S. aureus peut être d’origine humaine ou animale.
Contamination d’origine humaine
S. aureus colonise la peau et les muqueuses de l’homme et de nombreuses espèces animales à sang chaud (Williams, 1963). Bien qu’il existe de nombreux sites de colonisation chez l’homme, le nasopharynx est le site de portage le plus fréquent. Il a en effet été estimé que 27% de la population humaine est porteuse de S. aureus dans le nasopharynx (Wertheim et coll., 2005). Les autres sites fréquents de portage sont la peau et le périnée (Wertheim, et coll., 2005). Même si le portage de S. aureus augmente le risque de contracter une infection liée à cette bactérie, l’homme ne présente généralement aucun symptôme lié à cette colonisation. De ce fait, au cours de la fabrication/préparation des aliments, une contamination de l’aliment par l’homme est possible si les conditions d’hygiène ne sont pas pleinement contrôlées (port de gants et de masques notamment). Il a été estimé qu’environ 20% des cas de TIAC impliquent une contamination par une personne infectée par un agent pathogène et ayant manipulé la nourriture (Greig et coll., 2007). Une revue récente de 816 cas de TIAC, répertoriés entre 1927 et 2006 principalement aux Etats-Unis, au Canada, en Europe et en Australie et dans lesquels des personnes ayant manipulé la nourriture ont été impliquées, a recensé les moyens de transmission des pathogènes aux aliments : les voies fécales et orales (mains contaminées après passage aux toilettes, vomissements) de personnes malades, convalescentes ou colonisées sont les plus souvent incriminées ; viennent ensuite les contaminations, essentiellement staphylococciques ou streptococciques, dues aux sécrétions nasales ou orales ainsi que les infections de la peau (Todd et coll., 2008). Ces cas de TIAC ont été provoqués principalement dans des lieux de restauration (restaurant, hôtel…), lors d’événements animés par des traiteurs ou encore à la maison (Todd et coll., 2007a). Mais il arrive aussi que les contaminations aient lieu dans les usines de transformation des aliments (Todd, et coll., 2007a). Les aliments incriminés sont principalement des aliments cuisinés qui, après contamination, ont été stockés dans des conditions inadéquates (rupture de la chaîne du froid par exemple) permettant le développement des agents pathogènes (Todd et coll., 2007b).
Contamination d’origine animale
Une des niches écologiques naturelles de S. aureus est, comme écrit précédemment, la peau et les muqueuses des animaux à sang chaud. De ce fait, cette bactérie peut coloniser les pis des femelles laitières dans les élevages ovins, caprins ou bovins, et provoquer des infections de la glande mammaire. La mammite est la principale pathologie rencontrée en élevage laitier, elle se manifeste de deux façons :
• la mammite sub-clinique ne présente pas de symptôme visible bien que la composition du lait soit altérée (augmentation du nombre de cellules somatiques) et la production diminuée,
• la mammite clinique présente des symptômes visibles localisés sur la mamelle (inflammation, œdème, gangrène…), des symptômes fonctionnels (modifications de la qualité et de la quantité du lait) et des symptômes plus généraux dans les cas les plus graves (fièvre, anorexie, faiblesse…) (Bergonier et Berthelot, 2003).
Lorsqu’une mammite est détectée, le lait produit par l’animal atteint est écarté du reste de la production pour éviter la contamination de la totalité de la production. Cependant, dans des cas de mammites sub-cliniques ou de conditions d’hygiène défaillantes (contaminations croisées dues au matériel de traite par exemple), il peut arriver que le lait soit contaminé par la bactérie à l’origine de mammites. S. aureus est une des causes majeures des mammites bovines, ovines et caprines (Bergonier et coll., 2003; Ster et coll., 2005).
Le lait cru est souvent incriminé dans les cas de TIAC par les produits laitiers, et notamment les fromages au lait cru (De Buyser, et coll., 2001), même si le lien n’est pas toujours simple à établir. Dans des cas de production fermière de fromage au lait cru, Jorgensen et coll. ont montré que S. aureus était présent partout dans la ferme et qu’il se propageait à partir du lait dans l’environnement, sur les équipements et dans les fromages produits (Jorgensen et coll., 2005b). Dans le cas de fabrication d’aliments à partir de lait cru, la relation entre la souche de S. aureus présente dans l’aliment et celle présente dans le lait cru peut être clairement et facilement établie comme c’était le cas lors de la TIAC en Norvège en 2003 impliquant de la purée de pommes de terre préparée avec du lait cru (Jorgensen et coll., 2005a). Dans le cas de consommation directe de lait cru, il est tout aussi aisé de relier l’intoxication alimentaire au lait qui, par exemple, dans un cas d’intoxication en Suisse en 2008, provenait d’une chèvre atteinte de mammite (Giezendanner et coll., 2009).
Les conditions de croissance de Staphylococcus aureus et de production d’entérotoxines
S. aureus ne forme pas de spores et peut donc être facilement éliminé par traitement thermique. Cependant, dans les cas de fabrication de produits à partir de lait cru ou de cas de contaminations postérieures au traitement thermique, cette caractéristique ne permet pas de s’affranchir du risque lié à S. aureus.
S. aureus est une bactérie anaérobie facultative, mésophile, neutrophile et halophile. Son optimum de croissance se situe donc à une température d’environ 37°C avec un pH compris entre 6 et 7 mais elle est capable de se développer à des températures comprises entre 7 et 48°C et à des pH compris entre 4 et 10 (Charlier et coll., 2009; Genigeorgis et coll.,1971; Genigeorgis et Sadler, 1966). La croissance de S. aureus est possible dans des milieux présentant une activité de l’eau (AW) très faible (0,83), avec un optimum quand l’AW est supérieure à 0,99 (Bennett, 2001). La bactérie est aussi capable de supporter des concentrations en chlorure de sodium allant jusqu’à 20% (Charlier, et coll., 2009). Elle est capable de produire des SE à des températures comprises entre 10 et 45°C, avec un pH pouvant être compris entre 4 et 10 et dans un milieu présentant une AW de 0,84 à plus de 0,99 (Bennett, 2001; Genigeorgis, et coll., 1971; Genigeorgis et Sadler, 1966). La condition aérobie est plus favorable à la croissance ainsi qu’à la production de toxines que la condition anaérobie. Tous ces paramètres interagissent entre eux et toutes les combinaisons de température-pH-Aw-[NaCl]-aération ne permettent pas la croissance de la bactérie ou la production de SE mais ces conditions extrêmes illustrent bien le grand nombre de situations dans lesquelles S. aureus est capable de se développer, survivre et produire des toxines. Les bonnes capacités d’adaptation évoquées précédemment permettent à S. aureus de coloniser la peau et les muqueuses des êtres humains et des animaux. Il a aussi été montré que S. aureus était capable de survivre, entre autres, dans la poussière, sur les tissus, sur le verre ou les surfaces vitrées ainsi que sur les sols (Todd et coll., 2009). Et comme en témoignent les nombreux aliments impliqués dans des cas de TIAC par S. aureus, la bactérie se développe et produit des toxines entre autres sur les viandes, dans des produits de charcuterie, les préparations à base d’œufs et les produits laitiers .
Les entérotoxines staphylococciques
Les entérotoxines staphylococciques font partie de la grande famille des exotoxines pyrogènes staphylococciques et streptococciques. Cette famille de protéines est à l’origine du syndrome de choc toxique et a été impliquée dans des cas d’intoxication alimentaire et de nombreuses maladies auto-immunes ou allergiques. Les SE sont avant tout impliquées dans les toxi-infections alimentaires.
D’autres espèces que S. aureus sont capables de produire des SE. Parmi les staphylocoques à coagulase positive, il a été montré que Staphylococcus intermedius est capable de produire des SE (Becker et coll., 2001) et a déjà été incriminé dans des cas de TIAC (Khambaty et coll., 1994). Certaines espèces de staphylocoques à coagulase négative sont également capables de produire des SE. C’est par exemple le cas de S. cohnii, S. epidermidis, S. xylosus, S. haemolyticus, S. simulans, S. equrorum, S. lentus et S. capitis (Bautista et coll., 1988; Vernozy-Rozand et coll., 1996). Nous résumerons ici les principales caractéristiques des entérotoxines produites par S. aureus, qui sont par ailleurs, les plus étudiées.
Les différentes entérotoxines et leurs caractéristiques
Les entérotoxines staphylococciques sont des protéines solubles à chaîne linéaire de faible masse moléculaire (22,6 à 28,3 kDA). A ce jour, 24 entérotoxines staphylococciques ont été décrites dans la littérature. Ces différentes entérotoxines ont été désignées par une lettre de l’alphabet dans l’ordre de leur découverte. Elles ont, dans un premier temps, été identifiées grâce à leurs différentes propriétés antigéniques (SEA à SEJ). Depuis, le développement des techniques de séquençage a accéléré la découverte de nouveaux types d’entérotoxines (SEK à SEV). Ces SE, produites par S. aureus, présentent de fortes similarités en terme de structure, de séquences peptidiques et de fonction (Le Loir, et coll., 2003). Les SE sont, comme les autres exotoxines pyrogènes, des superantigènes du fait de leur capacité à suractiver le système immunitaire. Concrètement, lors d’une réponse immunitaire classique de l’organisme face à un antigène, les lymphocytes T4 reconnaissent, via leur récepteur membranaire, les antigènes présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe II à la surface d’une cellule présentatrice d’antigène.
Cette reconnaissance permet une haute spécificité de la réponse immunitaire, les lymphocytes T4 étant capable de reconnaître un antigène spécifique. Un superantigène est capable de créer un lien non spécifique entre les cellules présentatrices d’antigène et les lymphocytes T4 ce qui va provoquer l’activation et la prolifération d’un grand nombre de lymphocytes (20%) (Rasooly et Do, 2009). Il en résulte alors une réaction immunitaire exacerbée. Parmi les différentes entérotoxines, l’activité superantigène de SEB a été largement étudiée et SEB est maintenant considérée comme une arme biologique puissante (Greenfield et coll., 2002; Henghold, 2004).
Supports génétiques et système de régulation
Les différentes souches de S. aureus productrices d’entérotoxines possèdent soit un soit plusieurs des gènes SE/SEl (se). Ces gènes sont localisés soit sur le chromosome soit plus fréquemment sur des éléments génétiques mobiles tels que des prophages (sea, see et sep) (Betley et Mekalanos, 1985; Couch, et coll., 1988; Kuroda, et coll., 2001; Omoe, et coll., 2005), des plasmides (sec1, sed, sej, ser, ses et set) (Altboum, et coll., 1985; Bayles et Iandolo, 1989; Omoe, et coll., 2003; Ono, et coll., 2008; Zhang, et coll., 1998) et des îlots de pathogénicité (sek, sel et seq) (Orwin, et coll., 2003; Yarwood, et coll., 2002b) . Le gène ser est codé par au moins deux plasmides dont un qui code aussi sed et sej (pIB485) (Omoe, et coll., 2003). Le gène sec de la souche de S. aureus isolée de mammite bovine (RF122) (sec-bovine) est codé sur le même plasmide que sel (Fitzgerald, et coll., 2001) alors que le gène sec1 se trouve sur un prophage (Altboum, et coll., 1985). Le gène seb a été trouvé à la fois sur le chromosome, un plasmide et l’îlot de pathogénicité codant aussi pour seq et sek (Altboum, et coll., 1985; Johns et Khan, 1988; Shafer et Iandolo, 1978; Shalita, et coll., 1977; Yarwood, et coll., 2002b). Le plasmide pF5 qui porte le gène ser encode aussi sej et les gènes des deux dernières entérotoxines décrites, ses et set (Omoe, et coll., 2003; Ono, et coll., 2008). Jarraud et coll. ont mis en évidence l’existence d’un opéron chromosomique, egc (enterotoxin gene cluster), qui code les gènes de nombreuses entérotoxines : seg, sei, sem, sen, seo et parfois seu ou sev (Jarraud, et coll., 2001; Letertre, et coll., 2003; Thomas, et coll., 2006).
Les données disponibles sur les systèmes de régulation des entérotoxines staphylococciques concernent essentiellement les SE classiques. Au cours de la croissance de S. aureus, la production des entérotoxines B, C et D est maximale en phase stationnaire de croissance (Bayles et Iandolo, 1989; Bergdoll et coll., 1974; McLean et coll., 1968; Otero et coll., 1990) alors que SEA est majoritairement produite au cours de la phase exponentielle de croissance (Borst et Betley, 1994; Czop et Bergdoll, 1974).L’expression des gènes des trois SE produites en phase stationnaire de croissance (SEB, SEC et SED) est contrôlée par le système de régulation principal de la virulence de S. aureus, le système agr (accessory gene regulator) (Bayles et Iandolo, 1989; Gaskill et Khan, 1988; Regassa et coll., 1991) alors que les gènes codant SEA et SEJ ne le sont pas (Tremaine et coll., 1993; Zhang, et coll., 1998).
Le système agr régule l’expression d’un grand nombre de gènes de protéines sécrétées par S. aureus (Novick, 2003). L’activation du système est maximale en phase post-exponentielle de croissance car elle est étroitement liée à la densité de population (quorum sensing) (Ji et coll., 1995). L’expression des gènes contrôlés par agr varie également en fonction des phases de croissance.
Les moyens de détection des entérotoxines dans les produits laitiers
Le diagnostic des TIAC à S. aureus est généralement confirmé soit uniquement par la détection d’entérotoxines staphylococciques dans les restes de nourriture (lorsque la symptomatologie est caractéristique), soit par la détection de SE et l’isolement de souches de S. aureus présentant des caractéristiques similaires chez les personnes malades et dans les restes de nourriture. En pratique, le diagnostic final repose principalement sur la détection de toxines dans l’aliment.
Les différentes techniques de détection des entérotoxines
La détection des SE dans les aliments est souvent difficile en raison des faibles quantités présentes et de leur nature protéique. Trois méthodes sont généralement utilisées pour détecter les SE dans la nourriture : les techniques biologiques, les techniques immunochimiques et les techniques de biologie moléculaire. Pour doser les SE par des techniques immunochimiques et certaines méthodes biologiques, il est nécessaire au préalable d’extraire et de concentrer les toxines de la matrice alimentaire.
• Techniques biologiques :Les techniques biologiques sont basées sur la capacité des aliments à induire des symptômes tels que vomissements ou troubles gastro-intestinaux chez les animaux et/ou leur action superantigénique sur des cultures cellulaires. Historiquement, les SE étaient détectées en administrant des échantillons suspects à des animaux, des singes le plus souvent. Ce type d’essai présente de nombreux désavantages : il soulève des problèmes éthiques liés à l’utilisation d’animaux et c’est un essai coûteux dont la sensibilité n’est pas suffisante, les singes étant moins sensibles aux SE que les humains . L’activité émétique des entérotoxines a été testée sur d’autres animaux que les singes, les musaraignes (Hu et coll., 2003) et les furets (Wright et coll., 2000) par exemple, mais plutôt dans le but de mieux comprendre les mécanismes d’action des SE. Deux autres méthodes, qui exploitent l’activité superantigénique de SEA, ont été développées pour détecter SEA (Hawryluk et Hirshfield, 2002; Rasooly et Do, 2009). Elles permettent de détecter SEA à des concentrations très faibles (de l’ordre du picomolaire ou du picogramme/ml) mais pour le moment SEA est la seule entérotoxine pour laquelle ces méthodes sont disponibles.
• Techniques immunochimiques :Les techniques immunochimiques sont basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques anti-SE. Des kits commerciaux, utilisant tous ce type de techniques, sont disponibles et permettent de détecter les entérotoxines « classiques », SEA à SED et généralement SEE. Trois de ces kits (Transia Plate SET de Diffchamb S.A., Ridascreen SET de R. Biopharm et TECRA SEVI de Tecra) utilisent la méthode ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). La technique ELISA consiste à utiliser des anticorps spécifiques fixés sur une phase solide et une enzyme (ex : peroxydase) qui va catalyser une réaction libérant un composant coloré dont la concentration peut être mesurée par spectrométrie. Les SE présentes dans l’échantillon analysé vont tout d’abord se lier aux anticorps attachés sur la phase solide. Puis, soit en introduisant des SE conjuguées à l’enzyme qui vont se fixer sur les anticorps « libres » (ELISA compétitif), soit en ajoutant des anticorps couplés à l’enzyme (anticorps secondaires) qui vont se fixer sur les SE de l’échantillon elles-mêmes fixées sur la phase solide (ELISA Sandwich), la concentration en SE va pouvoir être évaluée inversement (ELISA compétitif) ou proportionnellement (ELISA Sandwich) à l’intensité de couleur. Le kit commercial SET RPLA d’Oxoïd utilise la méthode d’agglutination passive reverse de particules de latex (RPLA, Reverse Passive Latex Agglutination).
• Techniques de biologie moléculaire :Les méthodes de biologie moléculaire utilisées pour détecter les entérotoxines impliquent souvent une PCR. La PCR permet en effet de rechercher les gènes codant pour des entérotoxines dans des souches de S. aureus isolées d’aliments contaminés. L’application de cette méthode nécessite bien entendu que les souches de S. aureus soient isolées. Cette technique permet d’indiquer la présence ou l’absence de gènes codant les SE mais elle ne permet pas de savoir si les gènes étaient exprimés au cours de la fabrication des aliments incriminés. Elle ne permet pas de détecter les toxines elles-mêmes mais seulement de caractériser les souches impliquées dans des cas de TIAC.
La méthode de référence pour le dosage les entérotoxines dites «classiques» dans les produits laitiers
En France et en Europe, une méthode de référence officielle pour détecter les SE dans les produits laitiers a été développée et validée au laboratoire d’Etudes et de Recherches sur la Qualité des Aliments et sur les Procédés agro-alimentaires à l’AFSSA, Laboratoire Communautaire de Référence (LCR) pour les staphylocoques à coagulase positive. Elle ne concerne que les entérotoxines SEA à SEE.
Cette méthode de référence comporte, après l’extraction des protéines, une première phase de concentration par dialyse indispensable pour détecter les faibles quantités de toxines présentes dans les aliments (Anonymous, 2006; Hennekinne, et coll., 2007).
Les deux méthodes officielles pour détecter les entérotoxines sont ensuite, au choix, la trousse VIDAS SET 2 commercialisée par BioMérieux ou la trousse Transia Plate SE commercialisée par Diffchamb. Cette dernière nécessite au préalable un traitement de l’extrait protéique par des immunoglobulines de lapin pour éviter des faux positifs possibles en présence dans l’échantillon de la protéine A produite par S. aureus. Ces deux kits vont indiquer s’il y a ou non des SE dans l’échantillon analysé.
En cas de résultats positifs, les entérotoxines sont dosées par la méthode de confirmation du LCR (Hennekinne et coll., 2003; Hennekinne, et coll., 2007). C’est une méthode de type ELISA Sandwich. Les entérotoxines sont tout d’abord détectées à l’aide d’anticorps monoclonaux des SE (Lapeyre et coll., 1987) fixés sur une phase solide puis leur présence est révélée par des anticorps polyclonaux de lapins couplés à la peroxydase et quantifiée par colorimétrie.
Incidence de la production de bactériocine
La production de bactériocine par les bactéries lactiques présentes dans les produits alimentaires peut aussi être impliquée dans l’effet inhibiteur de celles-ci sur la croissance de S. aureus. Les bactériocines sont des peptides ou protéines synthétisés naturellement par certaines bactéries. Leurs propriétés permettent d’éliminer certains micro-organismes ou de ralentir leur croissance. Ces molécules ont donc un intérêt potentiel dans la préservation naturelle des aliments et elles constituent notamment une alternative à l’utilisation de conservateurs chimiques ou encore au traitement thermique des matières premières (Galvez et coll., 2007). La plus étudiée est la nisine produite par L. lactis et efficace contre S. aureus.
A ce jour, elle est couramment utilisée comme conservateur dans un large panel d’aliments dans une cinquantaine de pays (Delves-Broughton et coll., 1996). Elle est notamment mise en œuvre dans la fabrication des fromages fondus (Delves-Broughton, et coll., 1996; Zottola et coll., 1994) ou de desserts lactés tels que le Cuajada (Arques et coll., 2008).
Plusieurs études ont permis de caractériser les bactériocines produites par des bactéries lactiques des produits de salaison et leurs effets sur S. aureus (Ammor et coll., 2006a; Ammor et coll., 2006b; Mataragas et coll., 2002; Sobrino et coll., 1991; Sudirman et coll., 1993; Vignolo et coll., 1993). Dans les fromages, l’utilisation de bactéries lactiques productrices de bactériocines efficaces contre S. aureus a été peu rapportée. Au cours de la fabrication d’un fromage italien, le Montasio, une bactériocine produite par Lb. plantarum a réduit de manière significative la population de S. aureus après 10 jours de stockage (Stecchini et coll., 1991).
Une souche de L. lactis, productrice de nisine, a permis d’éliminer S. aureus dans des fromages frais marocains (Jben) lorsque la population initiale de S. aureus était de 103 ufc/ml (Hamama et coll., 2002). Combinées à un traitement à haute pression du lait, les bactériocines produites par différentes souches de L. lactis, Ec. faecium et Ec. faecalis (nisine, lacticine, entérocine ou bactériocine non caractérisée) permettent d’inhiber la croissance de S. aureus au cours de fabrication de fromages au lait cru (Arques et coll., 2005).
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Table des matières
AVANT-PROPOS
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I – LES TOXI-INFECTIONS ALIMENTAIRES COLLECTIVES LIEES A LA CONSOMMATION DE
FROMAGES CONTAMINES PAR STAPHYLOCOCCUS AUREUS ET LEURS ORIGINES
1. Généralités sur les TIAC
2. Les origines des TIAC par Staphylococcus aureus dans les produits laitiers
2.1. Contamination d’origine humaine
2.2. Contamination d’origine animale
2.3. Les conditions de croissance de Staphylococcus aureus et de production d’entérotoxines
3. Les entérotoxines staphylococciques
3.1. Les différentes entérotoxines et leurs caractéristiques
3.2. Supports génétiques et système de régulation
4. Les moyens de détection des entérotoxines dans les produits laitiers
4.1. Les différentes techniques de détection des entérotoxines
4.2. La méthode de référence pour le dosage les entérotoxines dites « classiques » dans les produits laitiers
4.3. Méthode de détection des entérotoxines récemment décrites
Synthèse
II – STAPHYLOCOCCUS AUREUS ET SON ENVIRONNEMENT
1. Staphylococcus aureus et la flore des produits fermentés
1.1. Incidence de l’activité acidifiante des micro-organismes
1.2. Incidence de la production de H2O2
1.3. Incidence de la production de bactériocine
1.4. Incidence de la compétition nutritionnelle
2. Comportement de Staphylococcus aureus dans les fromages
Synthèse
III – LA RT-PCR QUANTITATIVE, UN OUTIL POUR MESURER L’EXPRESSION DES GENES
1. Outils d’analyse de la qualité des ARN
1.1. Les méthodes d’extraction d’ARN
1.2. Pureté chimique des ARN
1.3. Intégrité des ARN
2. Extraction des ARN bactériens à partir d’une matrice fromagère
2.1. Méthode directe
2.2. Méthode indirecte
3. La RT-PCR quantitative
3.1. Pourquoi la PCR quantitative ?
3.2. Les différentes technologies utilisées pour la PCR quantitative
3.3. Comment analyser les résultats de RT-PCR ?
3.4. Les gènes de référence pour la normalisation de résultats de RT-PCR quantitative
Synthèse
CONCLUSION DE LA SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ET INTRODUCTION DU TRAVAIL DE THESE
MATERIELS ET METHODES
I – SOUCHES ET CONDITIONS DE CULTURE
1. Souches et conditions de stockage
2. Conditions de culture
2.1. Croissance en lait
2.2. Préparation pour l’inoculation dans les laits utilisés pour les fabrications fromagères
3. Vérification de la présence des gènes des entérotoxines A, B, C et D
II – FABRICATIONS FROMAGERES
1. Fabrications en mini-cuve
2. Fabrications en cuve automatisée
2.1. Choix de paramètres technologiques à étudier
2.2. Plans d’expériences utilisés pour étudier l’effet des paramètres technologiques sélectionnés
2.3. Déroulement des fabrications
3. Analyses des fromages
3.1. Analyses physico-chimiques
3.2. Analyse microbiologique
3.3. Préparation des culots cellulaires en vue de l’extraction des ARN
3.4. Dosage des entérotoxines staphylococciques
III – TRAITEMENT DE L’ARN
1. Extraction des ARN totaux à partir de culots cellulaires
2. Elimination de l’ADNg et analyse des échantillons d’ARN
3. RT-PCR quantitative
3.1. Transcription inverse (RT)
3.2. Amorces utilisées pour la PCR quantitative
3.3. PCR quantitative
4. Analyse des résultats de PCR quantitative
RESULTATS ET DISCUSSION
I – MISE AU POINT D’UNE BOITE A OUTILS POUR ETUDIER L’EXPRESSION DES
GENES DES ENTEROTOXINES STAPHYLOCOCCIQUES AU COURS D’UNE FABRICATION DE
FROMAGE
1. Contexte et objectifs
2. Article 1 : Tool for quantification of staphylococcal enterotoxin gene expression in cheese
3. Conclusion
II – EXPRESSION DES GENES ET PRODUCTION D’ENTEROTOXINES STAPHYLOCOCCIQUES AU COURS DE LA FABRICATION DE FROMAGES A PATE PRESSEE
NON CUITE
1. Contexte et objectifs
2. Article 2 : Staphylococcal enterotoxin gene expression and production during the manufacturing of uncooked semi-hard cheese
3. Conclusion
III – APPLICATION DE LA METHODE DES SURFACES DE REPONSES POUR MINIMISER LA PRODUCTION D’ENTEROTOXINE STAPHYLOCOCCIQUE PENDANT LA FABRICATION DE FROMAGES A PATE PRESSEE NON CUITE
1. Contexte et objectifs
2. Article 3 : Application of the response surface methodology to minimize
staphylococcal enterotoxin production during the manufacturing of uncooked semi-hard cheese
3. Conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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