Les souches de la flore tellurique et marine du genre Rhodococcus isolées de sites contaminés

Historique du Genre Rhodococcus : Un coque rouge

   L’observation de Goodfellow et al. (1998) et Jones et Goodfellow (2010) fournit des vérités accablantes sur l’histoire de ce genre difficile à identifier. L’impact chemo-taxonomique et les approches moléculaires ont pu permettre de définir plus précisément ce genre. Zopf (1891) a d’abord proposé de créer le genre Rhodococcus pour inclure deux bactéries rouges nommés ensuite par Overbeck (1891) : Micrococcus erythromyxa et M. rhodochrous. Ce nom de genre, également suggéré par Winslow et Rogers (1906) et Molisch (1907) pour d’autres coques rouges, et avec R. rhodochrous comme souche type, a été maintenu au cours des quatre premières éditions du Manuel de bactériologie Déterminative de Bergey.Ceux-ci et plusieurs autres souches ont ensuite été « ré assimilés » dans le genre Micrococcus pour la cinquième édition du Manuel de Bergey, un arrangement qui a persisté dans la sixième, et qui reflète le manque actuel de caractères adaptés à leur description. Gordon (Gordon et Mihm 1957, 1959) a été la première à réaliser pleinement les insuffisances de s’appuyer totalement sur la morphologie des cellules et des réponses de coloration pour trier la taxonomie d’un grand nombre de souches disponibles qui avaient été placés, souvent à contrecœur, dans plusieurs genres différents, notamment Rhodococcus. En conséquence, elle a entrepris une série d’études définissant l’application d’une approche plus polyphasique (par exemple Gordon et Mihm 1961). Au départ, elle a placé tous ces éléments dans le genre Mycobacterium comme M. rhodochrous, basée principalement sur des similitudes dans leur morphologie des colonies et la solidité de l’acide de certaines cultures (Gordon, 1966). Il a fallu une taxonomie numérique pour révéler le véritable rang taxonomique des M. rhodochrous, qui a émergé à partir de ces études comme un regroupement digne d’un statut de genre distinct, et une claire distinction des autres membres du genre Mycobacterium ainsi que Nocardia et Corynebacterium (Goodfellow et al.,1998) Cependant, il a fallu attendre la septième édition du Manuel de bactériologie Déterminative de Bergey pour prendre une mesure officielle. Ces souches ont été retirées du genre Mycobacterium et réaffectées provisoirement à un certain nombre des espèces Nocardia (McClung 1974). Le genre Gordona (plus tard Gordonia) proposé par Tsukamura (1971),dont les membres de certaines souches M. rhodochrous étaient très semblables phénotypiques, était à l’époque considéré comme un genre de statut incertain (incertaesedis), et n’a pas été mentionné dans la présente édition du Manuel. Sa formation et la reconnaissance formelle éventuelle jouent un rôle important dans l’histoire Rhodococcus. Parmi les destins taxonomiques possibles envisagés par Bousefield et Goodfellow (1976) pour ces souches de M. Rhodococcus c’est de les laisser là où ils étaient, en les plaçant dans un autre genre pré-existant ou élaborer un nouveau genre pour les intégrer. Le genre Rhodococcus existait déjà, mais était tombé dans l’oubli. Il avait été ressuscité par Tsukamura (1974) pour contenir six espèces qui avaient été placées en tant que membres du genre Gordona, à savoir : R. aurantiacus, R. bronchialis, R. rhodochrous, R. roseus, R. et R. rubropertinctus terrae. Cette liste des espèces a été modifiée par Goodfellow et Alderson (1977) après leur vaste étude taxonomique numérique, qui a conduit à l’ajout de quatre autres espèces : R. coprophilus, R. corallinus, R. equi et R. ruber.

Le genre Rhodococcus

  Rho.do.coc’cus : Gr.n. rhodon, la rose ; Gr.n. coccus, un grain, Sur la base de vastes données taxonomiques poly phasiques, les membres du genre Rhodococcus sont actuellement placés dans les producteurs d’acides mycoliques Sous-ordre des Corynebacterineae dans la famille des Nocardiaceae au sein du phylum Actinobacteria, qui contient des bactéries Gram-positives, des pourcentages élevés en G+ C. Il a été suggéréque le Nocardiaceae devrait être émendé sur la base de l’ARNr 16S nucléotides de signature (2009 Zhi et al.) pour intégrer tous les genres précédemment placés dans la famille des Gordoniaceae Par conséquent, en plus de Rhodococcus (Goodfellow et al.,1998; Zopf 1891), Nocardia (Trevisan 1889) et Smaragdicoccus (Adachi et al., 2007), cette famille aurait désormais inclu Gordonia (Stackebrandt et al.,1988. Tsukamura 1971), Skermania (Chun et al., 1997), Williamsia (Kampfer et al., 1999) et Millisia (Soddell et al.,2006). Les principales caractéristiques chimio taxonomiques de ces derniers et les autres genres des Corynebacterineae sont donnés dans la Tableau 2. Le genre Rhodococcus embrasse des organismes ayant les caractéristiques suivantes (Goodfellow et al.,1998; Goodfellow et Maldanado 2006; Jones et Goodfellow 2010): Les membres sont Gram positif à Gram variable, non-mobile, aérobie organismes chemoorganotrophiques avec un métabolisme oxydatif, capables généralement d’utiliser un large éventail de composés organiques comme source d’énergie (source de carbone). Ils démontrent un cycle de vie dont la complexité varie entre les différents membres. Selon la souche, des tiges et des cocci peuvent subir une série de transformations morphologiques, et prendre des formes de coques dans une conversion de tiges et de filaments. Certains d’entre eux forment des branches et évoluent vers des filaments ou hyphes abondamment ramifiés, qui peuvent devenir « aériennement » organisés. Ces différentes formes morphologiques se fragmentent, éventuellement et réapparaissent à nouveau pour prendre des formes de coques et de coccobacilles courtes. Tous ne possèdent pas une pigmentation rouge, et la couleur de la colonie peut varier avec la souche : de l’incolore au chamois, crème, jaune, orange et rouge.

La taxonomie moléculaire

   L’outil le plus puissant dans l’analyse et la réorganisation de la taxonomie de Rhodococcus au cours des dernières années a été l’analyse de la séquence du gène de l’ARNr 16S. Le degré de variation dans la séquence entre deux organismes donnés peut être considéré comme une mesure de la façon dont les organismes sont étroitement liés Les Bactéries avec ADNr 16S : 97% de similitudes ou plus, peuvent être les mêmes espèces (Stackebrandt et Goebel, 1994). En cas de doute, les valeurs de réassociation ADN-ADN peuvent être obtenues; une valeur d’homologie de 70% est considérée comme le minimum pour l’identité de l’espèce (Wayne et al., 1987). Les séquences d’ADNr 16S sont maintenant disponibles pour toutes les espèces de Rhodococcus décrites valablement et les expériences de réassociation ADN-ADN ont été effectuées si nécessaire (Rainey et al., 1995c; Briglia et al., 1996). Par conséquent, il est probable que toutes les espèces actuelles sont stables mais il peut y avoir un doute sur l’état de R. percolatus qui a 99,3% 16S d’identité de séquence d’ADNr et 71% d’homologie ADN-ADN avec R. opacus. Mais les deux espèces peuvent être séparées sur la base du phénotype nutritionnel et la composition en acides gras (Briglia et al., 1996). L’étude de Rainey et al. (1995c) a montré que Rhodococcus est un genre relativement divergent tombant dans cinq groupes distincts. Un groupe contient R. erythropolis avec R. globerulus, R. marinonascens et R. opacus, un second contient R. rhodochrous avec R. ruber et R. coprophilus, tandis que R. rhodnii, R. fascians et R. equi Ces travaux ont également conclu que le genre Nocardia a évolué au sein de Rhodococcus plutôt qu’à ses côtés. Plus tard, Briglia et al. (1996) ont montré que R. zopfii réside dans le groupe R. rhodochrous tandis que R. percolatus réside dans le groupe R. erythropolis. Les Phylogénies peuvent également être déduites à partir d’autres séquences moléculaires. Ochi (1995) a analysé la séquence ribosomique AT-L30 protéines et il a trouvé généralement un bon accord avec les résultats de phylogénies obtenues à partir des analyses d’ADNr 16S

Les espèces actuelles de Rhodococcus

   Au moment de la rédaction de ce mémoire, 31 espèces Rhodococcus avaient été valablement désignées et reconnues (Jones et Goodfellow al., 2010). Ils sont énumérés dans le tableau 3, ainsi que leurs sites d’origine de l’isolement. Comme mentionné précédemment et figurant au tableau 1a, b, un brassage considérable parmi les membres de ce genre et d’autres de la Corynebacterineae a eu lieu, et ensuite les caractères additionnels ont clarifié leur phylogénie. Par exemple, certaines espèces initialement incluses dans le genre Rhodococcus ont été « ré-attribuées » par la suite dans plusieurs genres différents (tableau 1a) [par exemple Rhodococcus Maris est maintenant Dietzia maris (Rainey et al. 1995b)], tandis que d’autres à l’origine placées ailleurs sont reconnues aujourd’hui comme Rhodococcus spp. (Tableau 1b) [Par exemple Corynebacteroides Rhodococcus était auparavant Nocardia corynebacteroides (Yassin et Schaal 2005)]. Dans quelques cas, ils apparaissent comme synonymes tardifs d’espèces décrites précédemment [par exemple R. roseus est synonyme de R. rhodochrous (Rainey et al., 1995a)].

Rhodococcus dans la biotechnologie

   Les bactéries appartenant au genre Rhodococcus ont un grand nombre d’enzymes qui leur permettent d’effectuer plusieurs biocatalyses et les réactions de dégradation ayant une pertinence industrielle (Bell et al., 1998 de Carvalho da Fonseca et 2005b, Larkin, Kulakov et Allen 2006). Les Rhodococcus ont révélé être capables de dégrader une large gamme de composés naturels et des xénobiotiques hydrophobes: à chaîne courte, longue chaîne ainsi que des hydrocarbures et des composés aromatiques halogénés,comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques, des biphényles polychlorés et dibenzothiophènes référence (MR). La résistance cellulaire démontrée et la dégradation de tous ces composés sont liées au génome des cellules (Larkin, Kulakov et Allen 2005). La mobilisation des grands plasmides linéaires et la présence de plusieurs homologues d’enzymes dans les voies cataboliques (Van der Geize et Dijkhuizen 2004 Larkin, Kulakov et Allen 2006).
Bioremediation et Biodégradation La capacité de dégrader un grand nombre de composés organiques et leur tolérance associée font des bactéries Rhodococcus, une étude de cas appropriée en vue d’une utilisation dans la biorestauration et la biodégradation des polluants (Bell et al., 1998 Larkin, Kulakov et Allen 2006 de Carvalho 2009). Les déchets produits par les industries sont grandes en quantité et très variés. La contamination des sols et de l’eau devient un problème difficile à résoudre. Les Rhodococcus ont montré leur capacité à dégrader les polluants biodisponibles faibles, allant de simples hydrocarbures, aux hydrocarbures chlorés, les hydrocarbures aromatiques, les nitroaromatiques et aromates polycycliques chlorés (Bell et al., 1998). Les rapports établis au sujet des espèces Rhodococcus démontrent que R. rhodochrous peut dégrader les polychlorobiphényles (PCB) (Boyle et al 1992.) Il est aussi une bactérie de désulfuration (Bozdemir et al.,1996). R. globerulus P6 peut dégrader les polluants chimiques de polychlorobiphényles (PCB) (Asturias et Timmis 1993). L’assainissement biologique des déchets contenant de l’atrazine et de s-triazine peuvent être effectués par R. corallinus (Arnold et al., 1996). R. ruber et R. erythropolis ont été décrits comme capables d’assainir les environnements contaminés par le pétrole brut (Bell et al., 1998). La souche R. erythropolis DCL14 a été décrit pour être capable de dégrader une large gamme de composés toxiques, comme les n-alcanes et des composés aromatiques, du mazout et de l’huile (de Carvalho da Fonseca et 2005b)
La production des Biosurfactants En réponse à la présence de composés hydrophobes, tels que les hydrocarbures liquides, les bactéries appartenant au genre Rhodococcus produisent des biosurfactants, Les tensioactifs cellulaires produits par ce genre sont principalement des glycolipides (Lang et Philp, 1998) ils favorisent l’adhérence des cellules bactérienne des phases hydrophobes dans deux systèmes de phase. Ce fait réduit la tension interfaciale entre les phases, ce qui permet une entrée plus facile de composés hydrophobes dans des cellules. La dispersion des composés hydrophobes causée par les agents tensio-actifs augmente l’aire de surface pour l’action microbienne (Bell et al., 1998). L’utilisation de biosurfactants présente plusieurs avantages et complète le traitement des déchets chimiques par bioremédiation (Kosaric 1992). La souche de R. erythropolis DCL14 a une production de tensioactif glycolipide-base en présence d’alcanes à longue chaîne (de Carvalho, Wick et Heipieper 2009). Les biosurfactants produits par R. erythropolis, R. opacus, et R. ruber peuvent être appliqués dans le pétrole brut, par exemple pour le nettoyage des réservoirs d’huile ou l’enlèvement du pétrole à partir de sables contaminés (Ivshina et al., 1998).
Synthèse Industrielle et transformations Les Espèce Rhodococcus ont été définies pour produire un certain nombre de produits commercialement intéressants et potentiellement utiles. Rhodococcus rhodochrous J1 est utilisé par l’industrie de la chimie Nitto Company Ltd (Japon) pour produire plus de 30 000 tonnes d’acrylamide par an (Yamada et Kobayashi, 1996). C’est le premier exemple de production industrielle réussie d’un produit chimique de base en utilisant un microbe. Une nitrilase surproduction est utilisée. Les recherches ont continué dans l’application de nitrilases (surtout à partir de Rhodococcus) pour produire une gamme d’autres produits tels que l’acide acrylique et divers amides, y compris les vitamines nicotinamide , l’acide paminobenzoique et les antimycobactériens hydrazides de l’acide isonicotinique et pyrazinamide (Kobayashi et Shimizu, 1994; Yamada et Kobayashi, 1996). Ces conversions montrent des rendements élevés et une forte spécificité avec un potentiel considérable pour une application industrielle. Les nitrilases dans R. rhodochrous J1 sont génétiquement couplés avec des amidases qui pourraient être utilisés pour d’autres transformations (Kobayashi et al.,1993). Des gènes nitrilase spécifique au genre Rhodococcus ont été clonés et exprimés dans E. coli (Kobayashi et al., 1993). Des sondes génétiques ont été développées pour dépister les gènes nitrilase dans d’autres souches (Duran et al., 1993). La production de poly (3-hydroxyalcanoïque) aminés par R. ruber a été étudiée (Pieper et Steinbüchel 1992). Un tel composé, un copolyester de 3-hydroxybutyrate et de 3 – hydroxyvalerate (3HB-co3HV), est produit commercialement comme un plastique biodégradable -” BIOPOL” – par Zeneca Bio. Les produits utilisent la bactérie Alcaligenes eutrophus (Lee, 1996). Rhodococcus ruber peut produire aussi le 3HB-co3HV avec une proportion différente de monomères tout en poussant sur des substrats moins coûteux que ceux utilisés pour la production BIOPOL. Une gamme d’autres transformations potentiellement utiles en utilisant des cellules de Rhodococcus ou des enzymes a été décrite. Woods et Murrell (1990) signalent la transformation des alcènes gazeux en époxydes par une culture. Les époxydes sont utilisés dans les Ferro-cristaux liquides électriques (Kieslich 1991). La biotransformation produit le sec-cedrenol, un composé ayant une valeur médicale potentielle, a été décrit (Takigawa et al., 1993). Ludwig et al. (1995) ont identifié une déshydrogénase d’alcool secondaire avec une spécificité rare pour les alcools à longue chaîne, et cela pourrait être utilisé pour produire des stéréo-isomères spécifiques d’alcools secondaires. Peters et al. (1993) rapportent des utilisations possibles de synthèse reductases carbonylés à partir de Rhodococcus pour donner une série de composés qui peuvent être utilisés pour la synthèse de produits pharmaceutiques et agrochimiques. Les acides muconiques peuvent être produits par une souche de R. rhodochrous (Warhurst et al., 1994). Les oxydases cholestérol de Rhodococcus ont été étudiées et pourraient avoir des applications dans l’industrie alimentaire ou dans la production de stéroïdes (Finnerty 1992; Christodoulou et al.,1994. Kreit et al., 1994). L’efficacité de la production des acides aminés L-leucine et la L-phénylalanine en utilisant des enzymes de Rhodococcus a été rapportée (Hummel et al., 1987;. Bhalla et al.,1992).
Applications Diverses. Des suggestions ont été faites pour l’utilisation des Rhodococcus dans l’industrie alimentaire. En plus de son cholestérol oxydases (voir ci-dessus), R. fascians a été étudiée pour sa capacité à dégrader la limonine, un composé au goût amer trouvé dans les jus de fruits. La possibilité d’améliorer la saveur du jus de fruit amer en utilisant R. fascians dans des bioréacteurs a été étudiée (Iborra et al., 1994;. Marwaha et al., 1994).La forte coloration de nombreuses colonies de Rhodococcus a conduit à s’intéresser aux pigments. Un gène de pigment petite Rhodococcus a été exprimé dans E. coli et il a été proposé que le gène pourrait être utilisé comme un gène rapporteur pour permettre une identification rapide des colonies de bactéries transformées (Hart et al., 1990).

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Table des matières

Dédicace et Remerciements
Liste d’abréviation
Liste des figures et tableaux
Résumé
Introduction
Chapitre I : Etudes bibliographique
I – Les Rhodococcus agents de biodégradation dans la nature 
1- Préambule
2 – Historique du Genre Rhodococcus : Un coque rouge
3- Systématique actuelle
3.1- Le genre Rhodococcus
3.2 – Classification des Rhodococcus
3.2.1 – Taxonomie numérique
3.2.2 – Chemotaxonomie
3.2.3- Taxonomie moléculaire
3.3- Espèces actuelles de Rhodococcus
4- Ecologie des Rhodococcus
5- La Nouvelle identification des Rhodococcus
6- Rhodococcus dans la biotechnologie
6.1- Bioremediation et Biodégradation
6.2- Production des Biosurfactants
6.3- Synthèse Industrielle et transformations
6.4- Applications Diverse
II- Caractérisation génétique des souches
1- PCR
2- Méthodologies moléculaires appliquées à l’étude des souches bactériennes telluriques
2.1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S amplifiés (ARDRA)
2.2- Séquençage des ADNr 16S et Analyse phylogénétique
III- Intérêt des biosurfactants dans la caractérisation
Les biosurfactants
1- Définitions
2- Structure et classification des biosurfactants
3- Biosynthèse et rôle physiologique
4- Rôle des biosurfactants dans la biodégradation des hydrocarbures
5- Potentiels des biosurfactants
6- Les différentes applications des biosurfactants
7 – Biosurfactants des Rhodococcus
Chapitre II : Matériel et Méthodes
II- Méthodologie de travail
II.1 – Echantillonnage et prélèvement
II.2- Isolement
II.2.1- Méthode classique sans enrichissement
II.2.2- Méthode avec pré-enrichissement
II.3- Purification
II.4- Conservation des souches purifiées
III- Identification des souches purifiées
III.1 – Etudes Morphologique
a- Macroscopique
b- Microscopique
1- L’Etat frais
2- Gram
3- Mobilité
4- Recherche de spores
III.2- Etudes biochimique et aptitudes
a- Etudes biochimique
1- Etudes des types respiratoires
2- Test catalase
3- Test NaCl
4- Test Urease
5- Digestion du Tween 80
b- Etudes des aptitudes et propriétés
1- Test de dégradation du pétrole
2- Test de production de Glycolipides
3- Test de dégradation du cholestérol
4- Détermination de l’index d’émulsion E24
5- Interaction souches sélectionnées / pétrole brut
6- Test de l’INT
7- Test d’hémolyse
8- Culture sur gélose au sang (colonies)
IV- Identification par méthodes de biologie moléculaire
1- Amplification de l’ADNr 16S
a- Extraction d’ADN
b- Amplification de L’ADNr 16S par PCR
b.1- Principe
b.2- Amplification
b.3- Electrophorèse de l’ADN
2- La recherche du gène Cholestérol Oxydase « CHO »
a- Extraction d’ADN génomique
b- Vérification qualitatif de l’ADN extrait
c- Préparation de la solution mixte
d- Amplification du gène CHO
e- Electrophorèse de l’ADN
Chapitre III: Résultats et discussion
I- Isolement
1- Caractéristique des Echantillons
2- Sélection des souches
II- Identification des souches
II.1- Etudes Morphologique
1- Etudes macroscopique
2- Etudes microscopique
II.2 – Etudes biochimique et aptitudes
a- Etudes biochimique
b- Etudes des aptitudes
III- Identification par méthodes de biologie moléculaire
A – ARN S16
B – Gene CHO
Conclusion et perspective
Référence bibliographique
Annexes

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