Soutenance mémoire
Les protéines du lactosérum provenant du lait camelin
Activité protéolytique des bactéries lactiques
Les résultats obtenus, sur le milieu YMA, ont montré, l’apparition des zones claires, de diamètres variés cerné entre 16 mm et 30,5 mm, pour les souches S. thermophilus et des diamètres situent entre 22mm et 33mm pour les souches Lactobacillus Ssp ou bien des zones ayant la forme d’empreinte digitale. Par fois, nous avons enregistré l’absence totale d’une clarification du milieu, signe d’absence d’activité protéolytique avec une croissance bactérienne, le cas de la souche (St8) S. thermophilus et de deux autres souches (Lb3 et Lb7) Lactobacillus ssp.
De même les isolats Lactobacillus ssp semblent plus protéolytiques (ayant des zones de protéolyse avec des diamètres nettement supérieur) sur milieu YMA en comparaison aux souches S. thermophilus. D’autre part, selon Vuillemard, (1986), la souche lactique est considérée comme protéolytique, lorsqu’elle présente un diamètre d’une zone de lyse compris entre 05 et 15 mm. En comparaison, à nos souches, nos résultats sont en accord (concordent) ce principe, dont les diamètres des zones de protéolyse étaient élevés. De ce fait, nos souches lactiques thermophiles, sont d’un grand d’intérêt technologique (puisque sont protéolytiques et acidifiantes). Nos résultats, relatifs aux diamètres des zones de protéolyses, qui étaient relativement élevée, ces derniers peuvent être expliqués par le mode d’ensemencement suivi sur le milieu gélosé YMA (par spots, inondation), sans l’utilisation des disques du papier Wattman, ce qui a augmenté la vitesse de diffusion de l’inoculum dans la gélose. Tandis que, la méthode utilisée par : Thivierge, (1999) était une méthode de diffusion dans des puis creusés dans la gélose. De ce fait, nos isolats, ont exhibé sur le milieu YMA une activité protéolytique, néanmoins, l’évaluation de cette activité a été approximative (arbitraire) et quantitative, uniquement sur ce milieu. Nos résultats sont en concordance avec le principe avancé par Mayra-Makim, (2004), ayant déjà noté la supériorité de l’activité des souches Lactobacillus ssp en comparaison aux autres souches lactiques thermophiles et mésophiles. Selon Zadi- Karam et al., (2004), l’activité protéolytique, se traduisait par une clarification du milieu, due à la dégradation du substrat (protéine) du lait; inclus dans ce dernier. De plus, cette activité présentant des migrations électrophorétiques différentes. D’après Moulay et al., (2006), la protéinase extracellulaire de la paroi cellulaire des bactéries lactiques, est une enzyme clé dans leur système protéolytique, où son activité est nécessaire pour leur croissance dans le lait, en dégradant les molécules de caséines en peptides.
Cinétique de production des arômes par méthode analytique
En plus de la production du lactate et de la diminution du pH (acidification du milieu fermentaire), ce processus fermentaire, assuré par les souches lactiques thermophiles, avait abouti aussi à la formation de composés aromatiques, dont l’acétaldéhyde. Cet composé aromatique (l’acétaldéhyde) estimé à des valeurs en ppm, améliore les caractères organoleptiques du produit final et augmente sa consistance et sa texture. Le protocole colorimétrique adopté pour le dosage du (premier) principal arôme (acétaldéhyde), avec de légères modifications : (concernant l’entretien et la revification des souches, mode de préparation du coagulum et d’ensemencement, les températures d’incubations relatives aux souches lactiques thermophiles.
l’usage d’un étalon industriel (de pureté relative), avait montré que l’optimum de cette production, pour l’ensemble des souches sélectionnées, était atteint après environ 16H d’incubation à 42ºC, température optimale relative aux souches lactiques thermophiles étudiées (Chaves et al., 2002 ; 2003). Déjà Singh et al., (1980), avaient noté que l’espèce S. thermophilus, en culture pure, comme en culture mixte ; en co- culture avec les espèces Lactobacillus bulgaricus, produit plus de lactate. L’espèce est, selon le même auteur, seule responsable, de l’acidification et de la production d’acétaldéhyde à 37 ºC ainsi qu’à 42 ºC. En générale, dans le métabolisme bactérien l’acétaldéhyde est transformé en éthanol par une déshydrogénase mais dans la plus part des souches utilisées dans le yaourt cette enzyme n’as pas pu être détectée, ce qui explique que l’acétaldéhyde s’accumule dans le milieu de fermentation (Manca de Nadre et al., 1988; Loones, 1989). L’acetoine et le diacetyle proviennent du métabolisme des S. thermophilus. Plusieurs voies ont été décrites pour la production de l’acétaldéhyde par l’espèce S. thermophilus : -A partir des acides aminés tels que la méthionine (Met) et thréonine (Thr) -A partir d’acides nucléique tels que la thymidine -A partir de glucose via l’acétyle- CoA. Loones, (1989). En outre, Benaama et al., (2011, 2012) : avaient noté un maximum de production d’acétaldéhyde par des souches (indigènes) de S. thermophilus, isolées du lait cru d’espèce bovine, après uniquement 10 H d’incubation à 42 ºC, en culture pure, sur un milieu de culture (lait écrémé reconstitué à 10% W/V). Pour l’ensemble de nos souches, le suivi de la cinétique, de production des arômes, durant 24H d’incubation, a montré une succession de deux étapes : – Une première étape, ascendante, après environ 16 heures de fermentation, durant laquelle, il y a synthèse d’arôme (acétaldéhyde), suivie par une deuxième étape, de déclin (descendante), pendant laquelle il y a appauvrissement du milieu en composés aromatiques. Cette 2ème phase, d’atténuation d’arôme dans le milieu de fermentation, commune presque à toutes les souches thermophiles étudiées, pourrait être expliquée, par un probable épuisement des précurseurs d’arôme dans le milieu de culture.
Cinétique de la production de d’arôme par polarographie
En plus, de la production du lactate et la diminution du pH (acidification du milieu fermentaire), le processus fermentaire, assuré par nos souches lactiques thermophiles, avait abouti, aussi, à la formation des composés aromatiques, dont le diacétyle, ce qui pourrait améliorer les caractères gustatifs et organoleptiques du produit laitier final. Le protocole présélectif, par les deux réactifs de Voges Proskauer, nous a permis une sélection préalable des souches thermophiles produisant du diacétyle Déjà Bottazzi et Dellaglio, (1967) avaient noté, des rapports de diacétyle/acétaldéhyde, produit par l’espèce: Streptococcus thermophilus sur deux milieux de culture: le lait écrémé et le bouillon MRS de: 0.3/01 sur le premier et de 0.8 /01 sur le deuxième : Sur les deux milieux, les souches Streptococcus thermophilus produisent plus d’acétaldéhyde/diacétyle, que toutes les souches Lactococcus sp homofermentaires. Monnet et Corrieu (2005; 2007), avaient noté que les souches : Streptococcus thermophilus TIL 865, mutantes (obtenues par mutation directe) déficientes en α – acétolactate décarboxylase, sur des milieux de culture chimiquement définis, additionné de la leucine ou additionné de leucine et d’isoleucine, ces dernières croîtront rapidement sur le lait, cette propriété a été utilisée pour la sélection rapide des souches mutantes sur milieu gélosé. Sous des conditions partielles d’aérobiose et d’anaérobiose, ces mutantes, produisent des quantités de diacétyle, trois fois plus élevées que les souches mères. Sur un ensemble de 74 souches Streptococcus thermophilus et 75 Lb. bulgaricus, isolées d’un yaourt traditionnel Grec, testées pour leur : cinétique d’acidification, acidité, viscosité et production d’arômes : en culture pure sur le lait à pH 4,6 : les résultats ont montré que seules les souches Lb. bulgaricus etaient acidifiantes, produisant d’acétaldéhyde et des valeurs élevées de viscosité. Cependant, l’acétoine était produit uniquement par les souches Streptococcus thermophilus (Xanthopoulos et al., 2001).
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Table des matières
Introduction
I. Problématique de la production et d’importation du lait en Algerie
1. Données sur la production du lait en Algerie
1.1. Introduction
2. Structure de la filière lait en Algérie
3. Evolution de la production du lait en Algerie
4. Importation du lait en poudre
4.1. Evolution des importations d’Algerie en poudre du lait
5. La collecte du lait cru
6. Les différentes zones de collecte du lait en Algerie
6.1. Zone I
6.2. Zone II
6.3. Zone III
II. Le lait d’espèce cameline
1. Lait de chamelle
1.1. Données sur l’espèce Camelus dromedarius
1.2. Caractéristiques du lait de chamelle
1.2.1. Caractéristiques physiques et gustatives du lait de chamelle
1.3. Composition biochimique du lait de chamelle
1.3.1. Protéines du lait camelin
1.3.2. Les caséines
1.3.3. Différentes fractions des caséines du lait camelin
2. Les protéines du lactosérum provenant du lait camelin
2.1.α- Lactalbumine
2.2. Lactophorine
2.3. Les immunoglobulines
2.4. La lactoferrine
2.5. Lactopéroxydase
2.6. Les lysozymes
3. Matière grasse
3.1. Globule gras
3.2. Les acides gras
3.3. Phospholipides du lait de chamelle
4. Les vitamines
5. Les glucides
6. Sels et éléments minéraux
III. Propriétés thérapeutiques attribués au lait d’espèce cameline
1. Effets thérapeutiques du lait d’espèce cameline
1.1. Notions sur les bienfaits du lait cameli
2. Propriétés antimicrobiennes du lait de chamelle
3. Propriétés antivirale du lait d’espèce cameline
4. Effets thérapeutiques contre les maladies gastro-intestinales
5. Effets thérapeutiques contre l’autisme
6. Effets contre l’intolérance au lactose
7. Effets thérapeutiques contre les cancers et maladies auto-immunes
8. Effets thérapeutiques contre le Diabète Type 1
9. Effets thérapeutiques contre allergie
10. Effet hypocholestérolémique
11. Effets de détoxification
VI. Bactéries lactiques thermophiles
1. Bactéries lactiques thermophiles
1.1. Caractéristiques des bactéries lactiques thermophiles
1.2. Classification des bactéries lactiques selon température de croissance
1.3. Groupe des bactéries lactiques thermophiles
1. 4. Habitat
1. 5. Culture des bactéries lactiques thermophiles
2. Caractéristiques des principaux genres d’intérêt en technologie laitière
2. 1. Genre Lactobacillus ssp
2. 2. Genre Streptococcus thermophilus
3. Fermentation lactique
3.1. Principales voies fermentaires empreintées par les bactéries lactiques
3.1.1. Voie homofermentaire (HMF)
3.1.2. Voie hétérofermentraire (HTF) ou voie des pentoses phosphate
4. Rôles des bactéries lactiques en industrie agroalimentaire
4. 1. Aptitude acidifiante
4. 2. Aptitude aromatisante
4. 2.1. Dosage des aromes
4.2.1.1. Dosage du diacetyle et d’acétaldéhyde d
4. 3. Aptitude protéolytique
5. Production de bactériocines
5.1. Les bactériocines produits par les espèces Streptococcus thermophilus
5. 2. Bactériocines produits par Lactobacillus acidophilus
5. 3. Bactériocines produits par Lactobacillus helviticus
Partie Expérimentale
I .Matériel et Méthodes
1. Lieu de réalisation de l’étude
2. Matériel
3. Echantillonnage
3.1. Origine des échantillons du lait d’espèce Cameline
3.1.1. Stratégie d’échantillonnage
3.1.1. A. Traite, collecte et transport des échantillons
II. Méthodes
1. Analyses physico-chimiques
1.2. Exploitation et traitement statistiques des résultats
2. Analyses microbiologiques
3. Isolement des souches lactiques thermophiles
3. 1. Isolement et purification des souches lactiques thermophiles
3. 2. Caractérisation des souches lactiques thermophiles
3. 2. 1. Etude des caractères physiologiques et biochimiques
4. Exploration de la diversité des flores lactiques thermophiles du lait camelin
4.1. Réalisation de la technique Polymérase Chaine Réaction (PCR)
4.1.1. Rappel sur le principe de la PCR
5. Extraction d’ADN des isolats lactiques thermophiles
5.1 Rappel sur le principe de la technique d’extraction d’ADN bactérien
5.2. Extraction d’ADN bactérien à partir d’une culture bactérienne
5.3. Extraction d’ADN des isolats à paroi Gram positif
5.3. A. Etapes suivies
5. 3. B. Etape de précipitation d’ADN
5. 3. C. Réactifs utilisés
5.4. Extraction d’ADN des isolats à paroi Gram négatif
5.4. A. Etapes de la technique après optimisation
5. 4. B. Extractions de l’ADN génomique des isolats thermophiles
5.4. C. Amplification d’ADN des isolats par PCR
a. l’ADN ribosomal nucléaire
b. Etape d’amplification des régions intergéniques ITS par PCR
C. Amplification par PCR de l’ADN 16S des isolats lactiques
d. Analyse électrophorétique de L’ADN des souches
5.4. D. séquençage de l’ADN 16S des souches lactiques isolées
6. Réalisation des antibiogrammes des isolats lactiques thermophiles
7. Sélection des isolats lactiques thermophiles d’intérêt technologique
7.1. Etude des aptitudes protéolytiques des isolats lactiques
7.2. Suivi de la cinétique d’acidification
7.3. Suivi de la cinétique d’aromatisation
7.4. Suivi de production des composés aromatiques par les isolats
7.4. 1. Evaluation de la production d’acetoine
7.4. 2. Par la méthode classique de Voges Proskauer
7.4.3. Evaluation de production d’acetoine (arômes) par polarographie
7.4. 3.1. Principe de la polarographie
7.4. 3.1. A. Différentes techniques polarographiques
7.4. 3.1. B. Principe de polarographie impulsionnelle différentielle
8. Cinétique de production d’acétaldéhyde
8. 1. Suivi de la production d’acétaldéhyde par méthode analytique
9. Exploration In vitro d’antagonisme entre isolats et souches pathogènes
9.1. Antagonisme dirigé contre des souches procaryotes à Gram négatif
9. 2. Antagonisme dirigé contre des souches procaryotes à Gram positif
10. Etape de revivification des souches lactiques thermophiles
10.1. Mise en évidence de l’activité antagoniste
11. Conservation des souches lactiques
11. A. Conservation de courte durée
11. B. Conservation de longue durée
II. Résultats
9 1. Résultats des analyses physico- chimiques
1.1. Traitement statistiques des résultats des tests physico- chimiques
2. Résultats des analyses microbiologiques
3. Isolement et purification des souches lactiques thermophiles
3.1 Examen macroscopique des isolats lactiques thermophiles
3.2 Aspects macroscopique des souches thermophiles
3.2. A. Isolats Streptococcus thermophilus : Aspect macroscopique
3.2. B. Isolats Streptococcus thermophilus : Aspect macroscopique
4. Examen microscopique des isolats
4. 1. Aspects microscopiques (Observation à l’état frais)
4. 2. Coloration au bleu de méthylène
4. 3. Coloration de Gram
5. Purification des souches lactiques thermophiles
5.1. Purification des souches lactiques sur milieux sélectifs MRS
5.2. Purification des souches lactiques sur milieu sélectif M17
6. Caractérisation physiologique et biochimique des isolats thermophiles
7. Biodiversité des flores lactiques thermophiles dans le lait camelin
7.1. Extraction d’ADN à partir des isolats lactiques thermophiles lot 1
7.2. Extraction d’ADN à partir des isolats lactiques thermophiles lot 2
7.3. Résultats de la PCR souches lactiques thermophiles lot 2
8. Résultats de l’antibiogramme
9. Sélection technologique des isolats lactiques thermophiles
9. 1. Etude des aptitudes protéolytiques des souches lactiques
9. 2. Résultats des tests de protéolyse sur milieu Y. M .A.
9. 3. Cinétique d’acidification du lait
9. 4. Cinétique de la production des aromes
9. 4. 1. Révélation de la production des arômes
9. 4. 2. Evaluation des arômes par polarographie
9. 5. Cinétique de la production de l’acétaldéhyde
10. Exploration In Vitro d’antagonisme entre isolats lactiques et souches pathogènes
10.1. Entre souches lactiques et souches pathogènes à Gram positif
10.2. Entre souches lactiques et souches pathogènes à Gram négatif
10. 3. Entre souches lactiques et souches pathogènes eucaryotes
Discussion
Conclusion
Perspectives
Références
Publications scientifiques Annexes
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