Les propriétés neuoprotectrices et autophagiques de l’oleuropéine sur des neurones dopa minergiques soumis a un stress oxyda tif

L’ oleuropéine

Introduction

Des études épidémiologiques ont démontré que l’incidence des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives était moindre dans les pays de la région méditerranéenne, c’est ce qui a alimenté une multitude de recherches sur le régime alimentaire de cette région. L’olive provenant de la plante Olea europaea est native de la région méditerranéenne, l’huile ainsi que le fruit sont des composants importants de la diète de cette région. Leurs propriétés pharmacologiques ont été reconnues comme composants importants en médecine et diète santé à cause de leurs composants phénoliques, dont l’ Oe.
L’De fait partie de la famille des sécoiridoides (Figure 1.11), c’est le composant phénolique le plus important dans les cultivars d’olive et atteint des concentrations de plus de 140 mg/g sur base de matière sèche dans l’olive jeune, et 60 à 90 mg/g dans les feuilles (Syed Haris 2010).

Biodisponibilité

L’Oe est très abondante dans la phase de croissance du fruit. Dans les jeunes fruits, elle peut atteindre 14 % de poids sec. Son niveau reste très important à la récolte de cultivars verts. Cependant, dans les cultivars noirs, son niveau diminue très rapidement durant la maturation, dans quelques variétés, cela peut atteindre 0 quand le fruit est complètement noir.
Les composants phénoliques de l’huile d’olive vierge sont très bio-disponibles.
En effet, des études ont démontré que l’absorption de l’ Oe était de 55 à 60 % chez des sujets humains (Vissers 2002). Deux autres études ont démontré que l’Oe est rapidement absorbé après une administration orale avec une concentration plasmatique maximale survenant 2 heures après l’ administration (Del Boccio 2003, Tan 2003).
Enfm, d’autres des recherches ont aussi démontré que l’Oe pouvait traverser la barrière hémato encéphalique (Serra 2012).

Effets pharmacologiques

L’ Oe possède de nombreux effets pharmacologiques bénéfiques sur la santé tels qu’antioxydant et anti-inflammatoire comme l’ont démontré des études qui ont été réalisées sur des modèles in vitro et in vivo. De plus, plusieurs études épidémiologiques ont démontré que l’incidence de certains types de cancer dans le bassin méditerranéen est plus faible par rapport à d’autres régions (Barbaro 2014, Bulotta 2014).
Une étude in vivo montre que l’administration d’huile avec des concentrations croissantes d’Oe réduit l’ excrétion urinaire de 8-iso-PGF2a, et ceci de manière dosedépendante.
Le 8-iso-PGF2a est un marqueur de la peroxydation des lipides, ce qui est une conséquence du stress oxydatif (Visioli 1998). Une autre étude in vivo indique que l’ajout de l’Oe augmente la capacité des LDL à résister à l’oxydation et en même temps réduit les taux plasmatiques de cholestérol total, libre et estérifié (Coni 2000).
De plus, l’Oe a démontré in vitro (Speroni E 1998) sa capacité à neutraliser les ERO (Visioli 1998) et à augmenter l’activité des molécules anti-oxydantes SOD (Andreadou 2006).
En ce qui concerne l’effet anti-inflammatoire, l’Oe agit en réduisant l’ activité lypoxygenase et la production de leucotriène B4 (De la Puerta 1999). Quant à l’effet anti-cancer, l’Oe a démontré sa capacité à réduire la viabilité des cellules cancéreuses en inhibant leur taux de prolifération et en induisant l’apoptose (Han 2009).
Quant à l’ effet neuroprotecteur, une étude a démontré que l’Oe peut diminuer et même prévenir l’ agrégation du peptide ~-amyloïde, l’un des principaux facteurs responsables de la neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer (Bazoti 2006).
De plus, l’Oe est un inhibiteur de Tau, une protéine associée aux microtubules connuepour fonner des dépôts d’amyloïdes caractéristiques de la maladie d’Alzheimer (Daccache 2011). En concordance avec les résultats qu’on a obtenus sur l’effet de l’Oe sur l’apoptose, Asban-Aliabadi et al. ont démontré que l’Oe exerce des effets antiapoptotiques sur les cellules PC12 exposées à la 6-0HDA (pasban-Aliabadi 2013).
À notre connaissance, aucune étude n’a mis en évidence le rôle de l’Oe sur le mécanisme de l’autophagie. Le sujet de ce mémoire et de l’article est original et est d’actualité.

Modèles expérimentaux

Cellules PC12

Les cellules PC12 proviennent d’un phéochromocytome de la glande surrénale du rat, d’où leur capacité à synthétiser des catécholamines, dont la dopamine. Après avoir été traitées avec un facteur de croissance qui est le Growth Nerve Factor (NGF), ces cellules arrêtent de proliférer et acquirent des propriétés de neurones dopaminergiques (Figure 1.12). Les PC12 traitées avec la neurptoxine 6-0HDA sont utilisées comme modèle cellulaire de la MP. Les PC12 sécrètent exclusivement de la Dopamine lorsque différenciées, expriment le DAT ainsi que les récepteurs pour l’estrogène alpha et bêta, les neurofilaments H-M et L. Donc, les travaux expérimentaux qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisés avec des cellules PC12 différentiées en cellules neuronales.

Hydroxydopamine (6-0HDA)

La 6-0HDA (Figure 1.13) est la première neurotoxine catécholaminergique qui a été découverte et employée pour mimer la MP dans les modèles animaux et cellulaires puisqu’elle induit préférentiellement la mort des neurones dopaminergiques et noradrénergiques (Yelena 1995).
Il a été rapporté que la 6- OHDA est oxydé au niveau extracellulaire, sa toxicité est donc médiée par les produits d’oxydation générés, en particulier le peroxyde d’hydrogène et le p-quinone. Ce stress oxydatif induit un dysfonctionnement mitochondrial. En effet, le H20 2 induit l’oxydation de la peroredoxine 3, la relâche du cytochrome c et par la suite l’activation de la caspase 3. Le quinone peut activer la caspase 3 en passant par les caspases 8 et 12 indépendamment de la mitochondrie. Ce qui conduit à l’apoptose des cellules catécholaminergiques (Figure 1.14) (Hanrott 2006, Saito 2007).

Objectifs

Étant donné les nombreuses vertus qu’offre l’Oe, nous avons estimé important d’évaluer son potentiel neuroprotecteur in vitro sur des neurones dopaminergiques en culture, les cellules PC12 différenciées. Des résultats du laboratoire précédents à mon mémoire ont montré que l’Oe à une concentration de 10-12 M induit une diminution significative de l’apoptose dans les cellules PC12 différenciées traitées avec la 6-0HDA.
Je me suis donc intéressée au mécanisme d’action de l’Oe. L’objectif principal de mon mémoire était d’élucider le processus par lequel cette molécule exerçait son effet neuro protecteur. Pour cela, mon mémoire s’ est appuyé sur deux volets:
J’ai en premier lieu vérifié les propriétés antioxydantes de l’Oe par test de MitoSox.
En deuxième lieu, j’ai analysé l’effet de l’Oe sur la voie de l’autophagie, ce qui nous a amenés à étudier ce processus c’est l’hypothèse que l’Oe pourrait avoir un effet sur la MP en agissant sur l’autophagie, ce mécanisme qui est devenu au cours des dernières années le centre d’attention de plusieurs chercheurs et qui surtout a démontré une relation étroite avec la pathogénèse de la MP.
À cette [m, des marqueurs fiables de l’autophagie tels que LC3, HDAC6, et l’expression de P62 par immunofluorescence et Western Blot ont été mesuré.
De plus, afm de voir l’effet de l’Oe sur les lysosomes et mitochondries, on a utilisé respectivement les marqueurs suivants LAMP2 et mtHSP70.
Mes résultats, résumés dans l’article scientifique, ont démontré que des faibles doses d’Oe, 10-12 M, exercent un effet anti-oxydant et neuroprotecteur sur les PC12 neuronales. De plus, ces faibles doses d’Oe peuvent moduler le processus d’autophagie.
Il est encore trop tôt pour déterminer si l’De peut être considérée autant que molécule pro-ou anti-autophagique.

LES PROPRIÉTÉS NEUOPROTECTRICES ET AUTOPHAGIQUES DE L’OLEUROPÉINE SUR DES NEURONES DOP AMINERGIQUES SOUMIS À UN STRESS OXYDATIF

Contribution des auteurs

Astrogliose, et une infiltration lymphocytaire. À la suite d’une activation appropriée, les cellules micro gliales peuvent exercer une activité antimicrobienne, et induire une toxicité cellulaire par la production et la libération des ERO et de l’azote. Bien que peu réactifs, les radicaux libres NO et 0 2- peuvent se combiner pour former des espèces hautement réactives d’azote peroxynitrite (ONOO-) (Figure 1.7). Ces dernières peuvent causer des dommages oxydatifs dans diverses protéines, telles que la tyrosine hydroxylase et l’a-synucléine, et ainsi contribuer à la dégénérescence des neurones dopaminergiques (Hirsch 2009).cytotoxicité ainsi qu’un test de fragmentation de l’ADN. Ces derniers ont démontré que notre molécule naturelle agit autant que neuroprotecteur sur les neurones dopaminergiques en réduisant le taux de mort cellulaire induite par la 6-0HDA.
Dans le but d’évaluer l’effet antioxydant de l’Oe, le test de MitoSox a été utilisé. Les résultats indiquent que l’Oe protège les cellules PC12 différentiées en neurones dopaminergiques contre l’oxydation induite par le diéthyldithiocarbamate (DDC) qui est considéré comme un pro-oxydant, inhibiteur de la SOD. Enfm, afm de connaitre l’effet de l’Oe sur le processus qui joue un rôle critique dans la pathogénèse de la maladie de Parkinson et qui est l’autophagie, on a mesuré des marqueurs importants de l’autophagie comme LC3 et p62 par immunofluorescence et immunobuvardage de type Western.
En conclusion, l’Oe possède des propriétés neuroprotectrices qui pourraient être reliées à son effet antioxydant ainsi qu’à sa capacité à moduler le mécanisme de l’autophagie.

Effets pharmacologiques

L’ Oe possède de nombreux effets pharmacologiques bénéfiques sur la santé tels qu’antioxydant et anti-inflammatoire comme l’ont démontré des études qui ont été réalisées sur des modèles in vitro et in vivo. De plus, plusieurs études épidémiologiques ont démontré que l’incidence de certains types de cancer dans le bassin méditerranéen est plus faible par rapport à d’autres régions (Barbaro 2014, Bulotta 2014).
Une étude in vivo montre que l’administration d’huile avec des concentrations croissantes d’Oe réduit l’ excrétion urinaire de 8-iso-PGF2a, et ceci de manière dosedépendante.
Le 8-iso-PGF2a est un marqueur de la peroxydation des lipides, ce qui est une conséquence du stress oxydatif (Visioli 1998). Une autre étude in vivo indique que l’ajout de l’Oe augmente la capacité des LDL à résister à l’oxydation et en même temps réduit les taux plasmatiques de cholestérol total, libre et estérifié (Coni 2000).
De plus, l’Oe a démontré in vitro (Speroni E 1998) sa capacité à neutraliser les ERO (Visioli 1998) et à augmenter l’activité des molécules anti-oxydantes SOD (Andreadou 2006).
En ce qui concerne l’effet anti-inflammatoire, l’Oe agit en réduisant l’ activité lypoxygenase et la production de leucotriène B4 (De la Puerta 1999). Quant à l’effet anti-cancer, l’Oe a démontré sa capacité à réduire la viabilité des cellules cancéreuses en inhibant leur taux de prolifération et en induisant l’apoptose (Han 2009).
Quant à l’ effet neuroprotecteur, une étude a démontré que l’Oe peut diminuer et même prévenir l’ agrégation du peptide ~-amyloïde, l’un des principaux facteurs responsables de la neurodégénérescence dans la maladie d’Alzheimer (Bazoti 2006).
De plus, l’Oe est un inhibiteur de Tau, une protéine associée aux microtubules connue pour fonner des dépôts d’amyloïdes caractéristiques de la maladie d’Alzheimer (Daccache 2011). En concordance avec les résultats qu’on a obtenus sur l’effet de l’Oe sur l’apoptose, Asban-Aliabadi et al. ont démontré que l’Oe exerce des effets antiapoptotiques sur les cellules PC12 exposées à la 6-0HDA (pasban-Aliabadi 2013).
À notre connaissance, aucune étude n’a mis en évidence le rôle de l’Oe sur le mécanisme de l’autophagie. Le sujet de ce mémoire et de l’article est original et est d’actualité.

Modèles expérimentaux

Cellules PC12

Les cellules PC12 proviennent d’un phéochromocytome de la glande surrénale du rat, d’où leur capacité à synthétiser des catécholamines, dont la dopamine. Après avoir été traitées avec un facteur de croissance qui est le Growth Nerve Factor (NGF), ces cellules arrêtent de proliférer et acquirent des propriétés de neurones dopaminergiques (Figure 1.12). Les PC12 traitées avec la neurptoxine 6-0HDA sont utilisées comme modèle cellulaire de la MP. Les PC12 sécrètent exclusivement de la Dopamine lorsque différenciées, expriment le DAT ainsi que les récepteurs pour l’estrogène alpha et bêta, les neurofilaments H-M et L. Donc, les travaux expérimentaux qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisés avec des cellules PC12 différentiées en cellules neuronales.

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Table des matières

CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1 La maladie de Parkinson
1.1.1 Diagnostic
1.1.2 Prévalence génétique de la MP
1.1.3 Épidémiologie
1.1.4 Pathogenénèse
1.1.5 Neuro-inflarnmation
1.1.6 Traitement
1.2 L’autophagie
1.2.1 La macro autophagie
1.2.2 Les marqueurs d’autophagie utilisés
1.2.3 La micro autophagie
1.2.4 L’ autophagie médiée par les chaperons (CMA)
1.2.5 Le rôle de l’ autophagie dans la MP
1.3 L’oleuropéine
1.3.1 Introduction
1.3.2 Biodisponibilité
1.3.3 Effets pharmacologiques
1.4 Modèles expérimentaux
1.4.1 Cellules PC12
1.4.2 Hydroxydopamine (6-0HDA)
1.5 Objectifs
CHAPITRE II
LES PROPRIÉTÉS NEUOPROTECTRICES ET AUTOPHAGIQUES DE L ‘OLEUROPÉINE SUR DES NEURONES DOPA MINERGIQUES SOUMIS A UN STRESS OXYDA TIF
2.1 Contribution des auteurs
2.2 Résumé de l’article
2.3 Article scientifique
Abstract
Introduction
Materials and methods
Drugs and chemicals
Cell culture and treatments
Cytotoxicity Measurements
DNA Fragmentation Analysis
Detection ofMitochondrial·02-
Detection of autophagic vacuoles by Cyto-ID
Fluorescence Microscopy
Electrophoresis and Immunoblot Analysis
Statistical analysis
Results
Oleuropein reduces 6-0HDA induced cellular death and oxidative stress
Oleuropein modulates the autophagic flux
Oleuropein reverts abnormal relocalization of lysosomes and
mitochondria induced by 6-0HDA
Discussion
Acknowledgments
References
Legends to the figures
Figures
CHAPITRE III
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPIDQUES

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