LES PRODUITS CHIMIQUES 

INTRODUCTION GENERALE

  Depuis les temps les plus reculés, la principale préoccupation de l’homme a été l’amélioration de ses conditions de vie. Il a développé une relation étroite avec la nature en exploitant les ressources animales et végétales nécessaires à sa survie. Dans ce cadre, les plantes occupent une place importante dans les activités humaines : elles sont utilisées pour satisfaire les besoins de base tels que la nourriture, les vêtements la construction de logement, les soins,…. Cependant, ces plantes qui ont le pouvoir de vie, ont aussi le pouvoir de mort en élaborant des substances toxiques (LEMOINE, 2004). Ces substances appelées toxines ou poisons naturels, provoquent après leur administration accidentelle ou volontaire des perturbations ou même la mort de l’organisme. Mais les poisons d’origine animale, végétale, et microbienne peuvent être utilisés comme remèdes s’ils sont employés de manière adéquate (KOKKALI et coll., 2011). Malgré les risques liés à leur manipulation, l’homme a toujours su exploiter leurs propriétés. Ainsi, il les utilise :
pour pêcher : cas des appâts préparés à partir des extraits des tiges de « famatalaro », Euphorbia laro (EUPHORBIACEAE) et les extraits de tubercule de « faganga », Dioscorea sansibarensis Pax (DIOSCOREACEAE), qui sont très toxiques pour les poissons (RAKOTO-RATSIMAMANGA, 1998 ; RAHERINIAINA, 2004) ;
pour chasser : à titre d’exemple, la confection de flèches empoisonnées avec Chondrodendron tomentosum (MENISPERMACEAE), chez les Indiens d’Amérique (BRUNETON, 1993) ;
pour lutter contre les animaux nuisibles : les bulbes de Rhodocodon madagascariensis (famonontotozy) ou les écorces de Rauvolfia media Pichon (antalihazo) servent à tuer les rats et les chiens errants ; les feuilles, les fruits ou les racines de Paullinia pinnata (famahivala), Mandulea grandidieri (arangoaika) et Melia azedarach (voandelaka) sont utilisées contre les insectes ; les bulbes de Dipcadii cowani (tongolomboalavo) servent à protéger les cultures contre les rats ; les feuilles fraîches de Buddleia axillaris (fanotrokotro) ont des propriétés insectifuges qui permettent d’éloigner les poux et les puces (RAKOTO-RATSIMAMANGA, 1998) ;
pour rendre la justice : à Madagascar, les extraits de « tangena » Cerbera venenifera (APOCYNACEAE) sont utilisés comme poisons d’épreuve
Actuellement, grâce au développement de la toxicologie, science qui étudie les poisons, associé au progrès des autres disciplines scientifiques telles que la biologie, la chimie, la biochimie, la physiologie et la pharmacologie, les connaissances sur les toxines n’ont cessé d’être approfondies (ANDRIANTSOANIRINA, 2006). Plusieurs molécules ont été isolées et caractérisées sur les plans chimique et biologique. Elles ont été employées à des fins thérapeutiques et ont aussi permis d’élucider des phénomènes biologiques et les mécanismes de fonctionnement des voies métaboliques. On peut citer, à titre d’exemples :
la roténone, principe toxique de plusieurs Papilionacées, inhibitrice du complexe I de la chaine respiratoire (MORELAND, 1980) ;
la toxine tétanique ou tétanospasmine, protéine toxique d’origine bactérienne (Clostridium tetani) qui a contribué à l’élucidation du fonctionnement du système nerveux central (BIZZINI, 1977) ;
la toxine diphtérique, une exotoxine sécrétée par le bacille Corynebacterium diphteria, qui a permis d’apporter des explications sur la voie de biosynthèse des protéines et son mécanisme de régulation (COLLIER, 1977) ;
la toxine botulinique, une neurotoxine isolée de Clostridium botulinum qui est commercialisée sous le nom de « botox » et qui est utilisée dans le traitement des troubles dus à une hyperactivité musculaire, tel le strabisme en inhibant la libération du neurotransmetteur acétylcholine. Elle entraine aussi une réduction de l’activité musculaire (SINGLETON, 1994 ; GRAVEL et BOUDREAULT, 2000) ;
le venin d’abeille qui est utilisé pour soigner les douleurs musculaires et le venin de crapaud pour soigner les ascites et les maladies du cœur (HABERMEHL, 1981) ;
la cobrotoxine du serpent Naja naja utilisée dans le traitement du cancer au stade terminal, grâce à son activité analgésique puissante (ROCHAT et coll., 1976 ; HABERMEHL, 1981) ;
la digitaline, un hétéroside extrait de Digitalis purpurea (SCROFULARIACEAE) qui guérit les insuffisances cardiaques chroniques.
la morphine extraite de la plante Papaver somniferum (PAPAVERACEAE), utilisée comme analgésique et qui constitue un outil biomédical important (BRUNETON, 1993). La flore malgache comporte plusieurs espèces toxiques, qu’elles soient endémiques ou introduites (DEBRAY et JAQUEMIN, 1971). Cependant, les connaissances sur la plupart d’entre elles sont encore incomplètes (ANGENOT, 1970).

UTILISATIONS TRADITIONNELLES DES Crotalaria

  Plusieurs espèces de Crotalaria ont une importance agricole et d’autres sont utilisées comme remèdes. A titre d’exemples, on peut citer :
 Crotalaria uncinella Lam., de nom vernaculaire Lakamisy, est employée en décoction comme antidysentérique (PERNET et coll., 1957) ;
 Crotalaria berteriana D.C, synonyme de Crotalaria fulva Roxb., connue sous les noms vernaculaires d’Ambarivatrindolo, Amberivatrindolo ou Ranomanga, est utilisée contre les affections galeuses et les tumeurs blanches. Elle est cultivée comme engrais vert ou plante de couverture dans les plantations de canne à sucre. Cette plante fournit également une belle fibre ; elle a été utilisée pendant la seconde guerre mondiale pour la production de pâte à papier (HECKEL, 1910 ;RAKOTO-RATSIMAMANGA et coll., 1969) ;
 Crotalaria cytisoides Hils. et Boj. connue sous le nom de Lakamisy, employée en infusion antidysentérique. Elle est également utilisée contre la gale. Sa tisane permet de traiter les personnes atteintes de troubles plus ou moins psychiques. Cet arbuste est également utilisé comme poison de pêche (PERNET et coll., 1957 ; RAKOTO-RATSIMAMANGA et coll. 1969) ;
 Crotalaria diosmaefolia Benth., dont la décoction des feuilles est utilisée pour traiter l’empoisonnement par quelques plantes toxiques (RAKOTORATSIMAMANGA et coll., 1969) ;
 Crotalaria retusa L., est utilisée comme engrais vert grâce à sa capacité à fixer l’azote atmosphérique. Elle est aussi employée en médecine empirique dans le
traitement du cœur (DHOLE et coll., 2011 ; http://www.barbadine.com/pages/crotalaria_retusa_lien.htlm);Synthèse bibliographique
 Crotalaria naragutensis Hutch., dont les écorces de racine en association avec d’autres plantes sont utilisées sous forme de décoction dans le traitement du prolapsus anal (ADJONOHOUN et coll., 1996) ;
 Crotalaria juncea Linn. utilisé dans la purification du sang et le traitement de l’anémie (KIRTIKAR et coll., 1935 ; NADKAMI et coll., 1954 ; SHARMA et coll., 2001 ; BHATT et coll., 2009). Sa graine présente des activités antispermatogénique, antiovulatoire et contraceptive (BALA et coll., 1973 ; RAO et coll., 1979 ; PRAKASH, 1985 ; VIJAYKUMAR et coll., 2004 ; MALASHETTY et coll., 2007).

METHODES DE PURIFICATION

Traitement par la chaleur
Principe Cette méthode est utilisée dans le but d’éliminer les macromolécules telles que les protéines qui coagulent sous l’effet de la chaleur.Etude chimique
Mode opératoire L’extrait à tester est chauffé dans un bain-marie bouillant pendant 15 min à 96°C. Une centrifugation à 10 000 tours/min pendant 15 min (Hettich, Universal II) est ensuite effectuée pour éliminer le précipité formé.
Précipitation par l’acétate neutre de plomb
Principe L’acétate neutre de plomb (ANP) est un sel de métal lourd ayant la capacité de
précipiter sous forme de sels insolubles de nombreux composés tels que les polysaccharides, les protéines, les acides nucléiques, les acides organiques, permettant ainsi de clarifier les extraits.
Mode opératoire Un volume bien déterminé d’une solution aqueuse d’ANP à 20% (p/v) est versé goutte à goutte sous agitation magnétique dans l’extrait à tester. Le précipité formé est éliminé par une centrifugation à 10 000 tours/min pendant 15 min (Hettich, Universal II). Le surnageant est récupéré tandis que le culot est éliminé. L’opération est répétée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus formation de précipité. L’excès de plomb dans le surnageant est éliminé par ajout d’une solution aqueuse de phosphate disodique 10% (p/v) suivi d’une centrifugation à 10 000 tours/min pendant 15 min (Hettich, Universal II). Le surnageant est recueilli et concentré par évaporation jusqu’au volume initial de l’extrait.
Fractionnement par le n-butanol (MAHUZIER et HAMON, 1990 ; KAMOUN, 1997 ; BRUNETON, 1993)
Principe La méthode est basée sur la partition de solutés entre 2 solvants non miscibles tels que le n-butanol et l’eau distillée.
Mode opératoire L’extrait à tester et le n-butanol de même volume sont versés dans une ampoule à décanter. Le mélange est agité énergiquement, puis laissé au repos jusqu’à la décantation totale des deux liquides, formant deux phases bien distinctes (phase supérieure organique etEtude chimique phase inférieure aqueuse). La phase organique est recueillie tandis que la phase aqueuse est encore traitée deux fois de la même manière.Les trois phases organiques rassemblées, ainsi que la phase aqueuse sont filtrées séparément pour éliminer les éléments insolubles. Chaque filtrat obtenu est évaporé afin d’éliminer le butanol après avoir ajouté un excès d’eau.
Dialyse
Principe La dialyse est une technique de séparation des molécules en fonction de leur taille, à l’aide d’une membrane à pores calibrés, appelée membrane de dialyse. Cette membrane à perméabilité sélective permet de séparer les grosses molécules des petites. Deux phénomènes importants sont mis en jeu lors de la dialyse :
 la diffusion : les molécules diffusent à travers la membrane de dialyse vers le liquide de contre-dialyse (à l’extérieur de la membrane). La diffusion des grosses molécules est lente ou nulle, celle des petites est rapide et se fait selon un gradient de concentration ;
 l’osmose : l’eau diffuse de la solution la moins concentrée (liquide de contredialyse) vers la plus concentrée (extrait à dialyser).
Mode opératoire La membrane de dialyse utilisée est un cylindre en cellophane de 3,3 cm de largeur à plat, appelé aussi boudin ou sac à dialyse. Elle laisse passer toutes les substances ayant un poids moléculaire inférieur à 12 000-14 000 Da.Préparation de la membrane de dialyse : La membrane présente à sa surface une couche protectrice formée de glycérine, de métaux lourds et de composés sulfurés qui doit être éliminée par trempage dans l’eau distillée bouillante pendant 15 min. Cette opération est répétée 3 fois en renouvelant l’eau distillée. Après refroidissement, la membrane ainsi préparée est conservée à +4°C dans la dernière eau bouillie pendant quelque jours. La membrane est de nouveau rincée avec de l’eau distillée avant son utilisation.Etude chimique

Déroulement de la dialyse :

  Le boudin à dialyse est rempli aux 2/3 de son volume d’extrait à dialyser. Il est fermé à ses deux extrémités par un nœud en laissant assez d’espace pour éviter l’éclatement de la membrane par l’augmentation du volume de l’extrait. Ensuite, il est immergé totalement dans le liquide de contre-dialyse (eau distillée de volume égal à 100 fois celui de l’extrait à traiter). Une légère agitation magnétique est nécessaire pour éviter la formation d’un gradient de concentration de substances diffusibles autour du boudin. Le liquide de contre-dialyse doit être renouvelé fréquemment afin d’accélérer les échanges. A la fin de la dialyse, le dialysat (solution à l’extérieur du boudin) ainsi que l’adialysat (solution à l’intérieur) sont concentrés par évaporation jusqu’au rapport 1/1 (p/v)

Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules

  Le test consiste à observer les effets de l’extrait à étudier sur la croissance des hypocotyles et épicotyles de jeunes plantules. Il est réalisé sur des représentants des Monocotylédones et des représentants des Dicotylédones. Ces graines sont trempées à l’obscurité pendant 48 h et à 30°C dans l’eau de robinet. Après ce trempage, un lot de 10 graines qui sert de témoin est transféré sur du coton imbibé d’eau de robinet et 9 lots de 10 graines sont transférés sur du coton imbibé d’extrait à tester à différentes concentrations. Ces lots sont arrosés avec de l’eau de robinet. La longueur de l’hypocotyle et de l’épicotyle est mesurée tous les 2 jours pendant 15 jours. Les résultats sont soumis à des analyses statistiques ANOVA utilisant le logiciel STATITCF (MSDOS 6.21), suivies du test de Newman-Keuls à 5% d’intervalle de confiance. Pour cela, deux facteurs ont été testés successivement : le nombre de jours d’expérimentation et la concentration de l’extrait à tester.

CONCLUSION GENERALE 

  En conclusion, les résultats des travaux réalisés sur Crotalaria trichotoma Bojer, récoltée à Iaroka (FABACEAE) bien qu’ils soient préliminaires, nous ont permis de :
 mettre en évidence une activité toxique dans les feuilles de la plante ;
 mettre au point une technique d’extraction et de purification des principes toxiques de la plante ;
 apporter les premières informations sur leurs propriétés physico-chimiques, leur nature chimique et leurs propriétés biologiques. Dans l’avenir, nous envisageons :
 d’améliorer le procédé d’extraction et de purification, afin d’obtenir un meilleur rendement en principes toxiques;
 d’isoler les principes toxiques pour mieux étudier leurs propriétés physicochimiques, leur structure et leur nature chimique ;
 d’élucider leur mécanisme d’action ;
 d’approfondir les propriétés biologiques sur d’autres animaux, végétaux et sur les microorganismes et de prospecter d’autres propriétés biologiques

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Table des matières

REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Première partie : ETUDE CHIMIQUE 
1 INTRODUCTION 
2 MATERIELS ET METHODES

2.1 Matériels
2.1.1 MATERIEL VEGETAL
2.1.2 DATE ET LIEU DE RECOLTE
2.1.3 PREPARATION ET CONSERVATION DU MATERIEL VEGETAL
2.1.4 LES PRODUITS CHIMIQUES
2.2 Méthodes
2.2.1 METHODES D’EXTRACTION DES PRINCIPES ACTIFS
2.2.1.1 Extraction à froid
2.2.1.2 Extraction à chaud
2.2.2 METHODES DE PURIFICATION
2.2.2.1 Traitement par la chaleur
2.2.2.1.1 Principe .
2.2.2.1.2 Mode opératoire
2.2.2.2 Précipitation par l’acétate neutre de plomb
2.2.2.2.1 Principe 
2.2.2.2.2 Mode opératoire
2.2.2.3 Fractionnement par le n-butanol
2.2.2.3.1 Principe
2.2.2.3.2 Mode opératoire
2.2.2.4 Dialyse
2.2.2.4.1 Principe
2.2.2.4.1 Mode opératoire
2.2.3 METHODE DE CONCENTRATION
2.2.4 CALCUL DE RENDEMENT
2.2.5 METHODES D’ANALYSE
2.2.5.1 Chromatographie sur couche mince
2.2.5.1.1 Principe
2.2.5.1.2. Mode opératoire
2.2.5.2 Criblage phytochimique
2.2.5.2.1 Préparation des extraits à tester
a) Extrait aqueux 
b) Extrait hydroéthanolique
c) Extrait éthanolique
d) Extrait chloroformique
e) Extrait acide
2.2.5.2.2 Méthodes de détection
a) Les alcaloïdes
b) Les saponosides (test de mousse)
c) Les tanins et polyphénols
c1) Test à la gélatine
c2) Test à la gélatine salée 
c3) Test au chlorure ferrique
d) Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
d1) Test de LIEBERMANN-BURCHARD
d2) Test de SALKOWSKI 
e) Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
e1) Les flavonoïdes (test de WILLSTÄTTER) 
e2) Les leucoanthocyanes (test de BATE-SMITH) 
f) Les désoxyoses (test de KELLER-KILIANI) 
g) Les anthraquinones (test de BORNTRAGER)
h) Les iridoïdes
i) Les coumarines
j) Les hétérosides cyanogénétiques : (TEST DE GRIGNARD)
3 RESULTATS
3.1 Extraction
3.1.1 EXTRACTION A FROID
3.1.1.1 Extraction aqueuse
3.1.1.2 Extraction hydroéthanolique
3.1.2 EXTRACTION A CHAUD
3.2 Purification 
3.2.1 METHODES RETENUES DANS LE PROTOCOLE DE PURIFICATION
3.2.1.1 Traitement par la chaleur
3.2.1.2 Fractionnement par le n-butanol
3.2.2 METHODES NON RETENUES DANS LE PROTOCOLE DE PURIFICATION
3.2.2.1 Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
3.2.2.2 Dialyse
3.3 Rendements
3.4 Analyse des extraits par chromatographie sur couche mince
3.5 Caracterisation chimique 
3.5.1 PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES
3.5.2 NATURE CHIMIQUE
4. DISCUSSION ET CONCLUSION
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1 INTRODUCTION
2 MATERIELS ET METHODES

2.1 Matériels
2.1.1 LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.1.1 Les animaux à sang chaud
2.1.1.1.1 Les souris 
2.1.1.1.2 Les poussins 
2.1.1.2 Les animaux à sang froid
2.1.1.2 1 Les têtards de grenouille
2.1.1.2.2 Les larves de moustique
2.1.2.2.3 Les poissons
2.1.2 LES VEGETAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.3 MATERIELS DE MICROBIOLOGIE
2.1.3.1 Les microorganismes
2.1.3.2 Les milieux de culture
2.1.3.3 Les disques pour les tests d’antibiogramme
2.2 Méthodes
2.2.1 METHODES D’ETUDES DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
2.2.1.1 Estimation de la toxicité sur souris
2.2.1.1.1 Test par voie orale
2.2.1.1.2 Test par voie intrapéritonéale
a) Estimation de la toxicité
b) Détermination de la DL50 (24 h)
2.2.1.2 Estimation de la toxicité sur poussins
2.2.1.2.1 Test par voie orale
2.2.1.2.2 Test par voie intrapéritonéale
2.2.2 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
2.2.2.1 Princip

2.2.2.2 Mode opératoire
2.2.2.3 Détermination de la CL
50 (24 h)
2.2.3 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
2.2.3.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.3.2 Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.4 METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
2.2.4.1 Stérilisation
2.2.4.2 Test d’activité antimicrobienne
2.2.4.2.1 Méthode de diffusion en milieu solide
a) Principe
b) Mode opératoire
2.2.4.2.2 Détermination de la CM
a) Principe
b) Mode opératoire 
2.2.4.2.3 Détermination de la CMB
3 RESULTATS
3.1 Effets sur les animaux
3.1.1EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
3.1.1.1 Effets sur la souris
3.1.1.1.1 Test par voie orale (gavage)
3.1.1.1.2 Toxicité par voie intraperitonéale
a) Description des symptômes d’intoxication
b) Détermination de la DL50 (24 h)
3.1.1.2 Effets sur les poussin
s
3.1.2 EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
3.1.2.1 Effets de l’extrait brut sur les têtards de grenouille
3.1.2.2 Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique
3.1.2.3 Effets de l’extrait brut sur les alevins de carpe
3.2 Effets sur les végétaux
3.2.1 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LE POUVOIR GERMINATIF DES GRAINES
3.2.2 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULE

3.3 Effets sur les microorganismes
3.2.1 ACTIVITE ANTIMICROBIENNE EN MILIEU SOLIDE
3.2.2 DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
3.2.2.1 Détermination de la CMI
3.2.2.2 Détermination de la CMB
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
REFERENCES WEBOGRAPHIQUES
ANNEXES

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