LES PESTIVIRUS

LES PESTIVIRUS

DETECTION DES ANTICORPS

Test de séroneutralisation

Le test de séroneutralisation est une méthode quantitative, permettant d’évaluer le titre d’anticorps neutralisants, du sérum. Pour cela, différentes dilutions du sérum sont réalisées et chacune de ces dilutions est mise à incuber avec une suspension virale, de concentration connue. Ces solutions sont alors inoculées à des cultures cellulaires. En l’absence d’anticorps, le virus est révélé, soit par visualisation directe de l’effet cytopathique, dans le cas d’une souche cp, soit par immunohistochimie, dans le cas d’une souche ncp. Ainsi, l’absence d’effet cytopathique ou de réaction immunohistochimique traduit la présence d’anticorps. Le titre de neutralisation virale est exprimé par la dernière dilution, à laquelle le virus a été neutralisé dans 50 % des puits. Le titre en anticorps, du sérum testé, est, par la suite, obtenu grâce à la formule statistique de Spearman-Kärber (OIE, 2008). C’est une méthode de référence car sensible et spécifique, cependant, elle est longue (5 à 7 jours) et fastidieuse.

ELISA indirect

Cette technique consiste à déposer le sérum, sur un tapis d’antigènes, composés d’une protéine spécifique (NS2/3) ou de la totalité des protéines virales, dans le cas de la détection des anticorps totaux. Il existe un kit spécifique du BDV pour la détection des anticorps totaux. Les anticorps spécifiques de ce tapis se fixent aux antigènes présents au fond des puits. Ils sont, ensuite, révélés par des anti-globulines, spécifiques d’espèce, conjuguées à une peroxydase. Cette enzyme, en contact avec un substrat chromogène, émet un signal lumineux, mesuré par densité optique, qui est proportionnel à la quantité d’anticorps présents, dans l’échantillon.

ELISA compétition

Dans l’ELISA compétition, les anticorps du sérum sont mis en compétition avec des anticorps anti-NS2/3 marqués à la peroxydase. Dans un premier temps, le sérum est déposé dans des puits, au fond desquels se trouve l’antigène NS2/3. Dans un second temps, les anticorps antiNS2/3 sont déposés dans les puits. En l’absence d’anticorps dans le sérum, la peroxydase, en présence d’un substrat, émet un signal dont la densité optique est inversement proportionnelle à la quantité d’anticorps présents, dans l’échantillon .
Ces techniques ELISA sont rapides automatisables et peu coûteuses. Elles peuvent être réalisées sur sérum ou lait de mélange.

 Organisation structurale et génomique 

Génome

Le génome des pestivirus est constitué d’une molécule d’ARN simple brin, de polarité positive. Cet ARN, d’environ 12 kb de longueur, comprend deux extrémités 3’ et 5’ non transcrites ou UTRs (Untranslated Region) et un cadre unique de lecture ou ORF (Open Reading Frame). Les UTRs se replient pour former des structures secondaires qui interagissent avec les protéines cellulaires et virales pour réguler la transcription et la réplication de l’ORF (Neill, 2013).

 Protéines virales

La transcription et la traduction de l’ORF permettent la synthèse d’une polyprotéine de 4000 acides aminés. Cette polyprotéine est ensuite clivée par des protéases virales et cellulaires en douze protéines dont quatre protéines structurales et huit protéines non-structurales.

Protéines structurales

Les quatre protéines structurales sont la protéine C de la nucléocapside et les glycoprotéines Erns ou E0, E1 et E2 de l’enveloppe. La protéine C constitue la capside, elle englobe et protège le génome viral, à l’intérieur de la particule virale, par des interactions entre l’ARN et des acides aminés chargés qui la constituent (Neill, 2013). Elle aurait également un rôle dans la régulation de la transcription ainsi que dans la virulence de l’infection par le CSFV (Gladue et al., 2014). La glycoprotéine Erns est reliée au virus, sous forme d’homo-dimères, par des interactions faibles car elle n’est pas directement intégrée dans la membrane. Cette protéine peut donc également être sécrétée par la cellule infectée, dans le milieu extracellulaire. Des anticorps neutralisants sont produits contre cette glycoprotéine (Neill, 2013). Son activité ribonucléase lui permet de limiter la réponse immunitaire innée de l’individu, en bloquant la synthèse de l’interféron de type I. Erns joue également un rôle dans l’attachement du virus à la cellule et donc dans son entrée dans la cellule (Wang et al., 2015). Les glycoprotéines E1 et E2 sont insérées dans la membrane du virus par l’intermédiaire d’acides aminés hydrophobes sous forme d’homo-dimères E2 ou d’hétéro-dimères entre E1 et E2. Cet hétéro-dimère joue un rôle dans l’entrée du virus dans la cellule. En effet, E2 possède une séquence aminoacide qui permet la fusion des membranes du virus et de la cellule hôte via le récepteur cellulaire CD46 notamment (Maurer et al., 2004). E2 est également la glycoprotéine qui induit la grande majorité de la production d’anticorps neutralisants et donc une inhibition de l’infection par la réponse immunitaire à médiation humorale. Cependant, la réponse mise en place est relativement spécifique du fait de la grande diversité génétique de E2 (Neill, 2013).

Protéines non structurales

Les huit protéines non-structurales sont les protéines Npro, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a et NS5b. Dans la polyprotéine, les quatre glycoprotéines structurales sont situées entre la protéine Npro et les autres protéines non structurales (Figure 1). La protéine Npro est une autoprotéase, elle se détache elle-même de la polyprotéine. Elle bloque la production de l’interféron de type 1, en dégradant le facteur de régulation de l’interféron 3 (IRF-3), et permet donc, comme la protéine Erns, d’échapper à la réponse immunitaire innée de l’hôte (Chen et al., 2007). La protéine p7 est une viroporine qui peut être retrouvée sous forme libre ou sous forme d’hétéro-dimère p7-E2, dans les cellules infectées. Les viroporines sont des protéines dont l’activité des canaux ioniques altère la perméabilité des membranes, ce qui facilite l’entrée des virus dans les cellules et leur passage d’une cellule à l’autre. La protéine p7 jouerait également un rôle dans la morphogénèse et la maturation des virions (Largo et al., 2016). Les protéines NS2 et NS3 ne vont pas être retrouvées sous la même forme en fonction du biotype du virus (cf 1.4.2.). En effet, dans les souches cytopathiques (cp), on retrouve ces deux protéines séparées l’une de l’autre. Alors que dans les souches non cytopathiques (ncp),les protéines NS2 et NS3 restent très majoritairement liées. Un clivage minimal de ces deux protéines semble néanmoins nécessaire à la réplication en tout début d’infection y compris chez les souches ncp. Ce clivage est réalisé par l’activité protéase de NS2. NS2 joue également un rôle dans la translocation de la protéine dans le réticulum endoplasmique de la cellule. La protéine NS3 possède, quant à elle, trois activités enzymatiques. Son activité sérine protéase lui permet de réaliser le clivage de nombreuses protéines, à partir de la polyprotéine. Son activité ARN hélicase permet le déroulement de la molécule d’ARN et ainsi la mise en place de la transcription (Neill, 2013). Enfin, cette protéine, quand elle est produite en grande quantité (souches cp), possède également une activité nucléoside triphosphatase (NTPase) qui, associée à une ARN hélicase, active la cytotoxicité (Tamura et al., 1993). Cette protéine est également immunogène mais n’entraine pas la production d’anticorps neutralisants. La protéine NS4a agit comme un cofacteur de l’activité sérine protéase de la protéine NS3. La protéine NS4b, incluse dans la membrane de l’appareil de Golgi, permet la réplication de l’ARN viral ainsi que le réarrangement des membranes cellulaires dans les cellules infectées. Les protéines NS5a et NS5b peuvent être retrouvées liées ou clivées et joueraient un rôle dans la réplication de l’ARN mais leur rôle est mal connu (Neill, 2013).

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Table des matières

TABLES DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION
Première partie : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. LES PESTIVIRUS
1.1. Historique
1.2. Classification
1.3. Organisation structurale et génomique (Figure 1)
1.3.1. Génome
1.3.2. Protéines virales
1.3.2.1. Protéines structurales
1.3.2.2. Protéines non structurales
1.4. Diversité des pestivirus
1.4.1. Spectre d’hôte
1.4.2. Diversité biologique et notion de biotype
1.4.3. Diversité du tropisme cellulaire et tissulaire
1.4.4. Diversité génétique et virulence
1.4.4.1. Au sein des pestivirus
1.4.4.2. Au sein des BVDV
1.4.4.3. Au sein du BDV
1.4.5. Diversité antigénique
1.4.5.1. Au sein des pestivirus
1.4.5.2. Au sein des BVDV
1.4.5.3. Au sein des BDV
1.5. Réponse du système immunitaire
1.5.1. Lors de la mise en place de l’infection transitoire
1.5.1.1. Réponse immunitaire innée
1.5.1.2. Réponse immunitaire acquise
1.5.2. Lors de la mise en place de l’infection persistante
2. LA MALADIE DE LA FRONTIERE (BORDER DISEASE)
2.1. Historique et importance
2.2. Mécanismes de transmission
2.2.1. Sources animales
2.2.2. Matières virulentes
2.2.3. Transmission
2.2.3.1. Transmission horizontale
2.2.3.2. Transmission verticale
2.3. Pathogénie et expression clinique
2.3.1. Infection transitoire
2.3.2. Infection fœtale
2.3.3. Infection permanente
2.4. Diagnostic
2.4.1. Diagnostic différentiel
2.4.2. Diagnostic clinique et nécropsique
2.4.3. Diagnostic de laboratoire
2.4.3.1. Détection virale
2.4.3.1.1. Isolement viral en culture cellulaire
2.4.3.1.2. Immunohistochimie
2.4.3.1.3. ELISA antigène
2.4.3.1.4. RT-PCR
2.4.3.2. Détection des anticorps
2.4.3.2.1. Test de séroneutralisation
2.4.3.2.2. ELISA indirect
2.4.3.2.3. ELISA compétition
2.4.3.3. Utilisation pratique des résultats
3. MESURES DE LUTTE
3.1. Prophylaxie sanitaire
3.1.1. Contrôle à l’introduction de nouveaux animaux
3.1.2. Biosécurité
3.1.3. Détection et élimination des IPI
3.2. Prophylaxie médicale : la vaccination
3.2.1. Vaccination chez les bovins
3.2.2. Vaccination chez les ovins
4. LE CAS DU BASSIN DE ROQUEFORT
4.1. Epidémiosurveillance depuis 1988
4.2. Plan d’épidémiosurveillance actuel
4.2.1. Un double dépistage sérologique
4.2.2. Résultats des sérologies sur sérum
4.2.3. Résultats des sérologies sur lait de tank
4.3. Mesures de lutte
Deuxième partie : ETUDE EXPERIMENTALE
1. OBJECTIFS
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. Cultures cellulaires
2.2. Virus et titrage
2.3. Vaccination et infection
2.3.1. Animaux
2.3.2. Vaccination expérimentale
2.3.3. Infection expérimentale
2.3.4. Autopsie
2.4. Suivi expérimental
2.4.1. Suivi clinique
2.4.2. Suivi hématologique
2.4.3. Suivi sérologique
2.4.4. Suivi virologique
2.5. Statistiques
3. RESULTATS
3.1. Infection expérimentale et suivi des mères
3.1.1. Suivi clinique
3.1.2. Suivi hématologique
3.1.3. Suivi sérologique
3.1.4. Suivi virologique par RT-PCR
3.2. Suivi de l’infection fœtale
3.2.1. Suivi des avortements
3.2.2. Analyse des fœtus
3.2.3. Sérologie des fœtus
3.2.4. Virologie des fœtus
4. DISCUSSION
4.1. Analyse des fœtus
4.1.1. Anomalies et retards de croissance
4.1.2. Sérologie et virologie
4.2. Suivi expérimental des brebis
4.2.1. Suivi clinique
4.2.2. Suivi hématologique
4.2.3. Suivi sérologique
4.2.4. Suivi virologique
4.3. Discussion par rapport à la méthodologie utilisée
4.3.1. Souche
4.3.2. Voie et dose
4.3.3. Période d’inoculation
4.4. Discussion et perspectives sur la vaccination BDV
4.4.1. Vaccins
4.4.2. Protocole vaccinal
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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