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Les peptides pénétrants ou CPP
Le domaine de recherche portant sur les peptides pénétrants (cell-penetrating peptides, CPP), alternativement appelés « protein transduction domains » (PTD), a connu un intérêt grandissant ces vingt dernières années. Les peptides vecteurs constituent des outils prometteurs pour la délivrance de molécules bioactives dans les cellules. Ils joueraient donc un rôle clé dans le développement futur d’agents thérapeutiques. Il a été montré que les CPP amélioraient efficacement la délivrance intracellulaire à la fois in vitro et in vivo de diverses biomolécules. Les espèces transportées incluent des oligonucléotides et analogues dont des siRNA (petits ARN interférents), des PNA (acide nucléique peptidique), des peptides et protéines.
En 1988, il a été montré que la protéine d’activation de la transcription Tat, impliquée dans la réplication du virus de l’immunodéficience humaine VIH-1, était capable de pénétrer dans les cellules. Peu de temps après, en 1991, le facteur de transcription correspondant à l’homéoprotéine Antennapedia a également montré des capacités d’internalisation. Cela a conduit à la découverte de séquences, au sein de ces protéines, responsables de ce phénomène de pénétration. Cette découverte a stimulé la recherche de nouvelles séquences peptidiques ayant l’habilité à traverser la membrane plasmique et conduit à la conception rationnelle de CPP dits « synthétiques », comme les peptides MAP (model amphipatic peptide) ou encore le peptide cationique (Arg) . Des peptides chimères, composés de segments de différentes protéines, ont également été proposés comme le Transportan, Pep-1, et MPG.
Découverte des CPP : des séquences dérivées de domaines protéiques capables de pénétrer dans les cellules
La Pénétratine ou pAntp
Les homéoprotéines constituent une classe de facteurs de transcription impliqués dans certains processus clés du développement embryonnaire. Ces protéines se lient à l’ADN via un domaine conservé de 60 acides aminés, appelé homéodomaine, extrêmement structuré et comportant 3 hélices α et un coude β entre les hélices 2 et 3. En 1993, le groupe d’Alain Prochiantz a montré que la séquence correspondant à l’homéodomaine d’Antennapedia, issue d’un gène homéotique de la drosophile, était capable, in vitro, de traverser la membrane de neurones de rats, et d’atteindre leurs noyaux. Ce phénomène a été observé sur toutes les lignées cellulaires que les auteurs ont utilisées. Afin de mieux comprendre le processus d’internalisation, l’homéodomaine a été muté. Au cours de cette étude, le dérivé pAntp48S comportant diverses mutations au sein de l’hélice 3 a été généré, le résidu Gln50 étant remplacé par une sérine et les deux résidus hydrophobes Trp48 et Phe49 étant supprimés. Il a ainsi été montré que, contrairement à la version intégrale de l’homéodomaine, pAntp48S ne s’internalise pas. Il est à noter que ces deux résidus hydrophobes sont conservés dans tous les homéodomaines séquencés à ce jour, soulignant leur rôle important. Ce résultat suggérait que la région C-terminale de l’homéodomaine était essentielle pour l’internalisation. Par la suite, grâce à l’étude de différentes séquences dérivées de cette région (Figure 1), il a été montré que les 16 résidus (43-58) constituant l’hélice 3 étaient essentiels et suffisants pour l’entrée dans les cellules. Cette séquence est maintenant appelée Pénétratine. Des versions tronquées aux extrémités N ou C terminales du peptide, ont été testées, et n’ont montré aucune propriété de pénétration. Ainsi les études des séquences pAntp(41- 55) et pAntp(46-60) ont signalé l’importance de nombreux résidus basiques (Arg43, Lys57, Lys58) et hydrophobe (Trp56) se trouvant dans les régions qui avaient été tronquées. Le rôle majeur de ces résidus sur l’efficacité d’internalisation a été validé par des études de mutations.
Les mécanismes d’internalisation des CPP seront développés plus loin dans ce manuscrit (chapitre I.3). On peut néanmoins déjà mentionner l’existence de deux voies d’entrée. La première voie correspond à la translocation directe de la membrane plasmique, mécanisme qui ne requiert pas d’énergie et qui conduit dans un premier temps à une localisation du vecteur et de sa cargaison au niveau du cytosol. La seconde voie correspond à l’endocytose (mécanisme énergie dépendant), qui nécessitera le franchissement de la membrane endosomale afin d’atteindre une région d’intérêt de la cellule. Les premières études ont montré que, de la même manière que l’homéodomaine, la Pénétratine s’internalise à 37°C (par endocytose et translocation directe) et aussi à 4°C (température à laquelle l’endocytose est inhibée mais pas la translocation). Le peptide, après internalisation, est localisé dans le cytosol ainsi que dans le noyau et aucune dégradation du peptide n’est détectée après 2h30 d’incubation. De plus, la version composée d’aminoacides de configuration D et la version de séquence inversée gardent la même efficacité d’internalisation que le peptide Pénétratine d’origine. Ceci a conduit à la conclusion, qu’aucune reconnaissance par un récepteur membranaire chiral n’est requise pour l’internalisation cellulaire. C’est ainsi qu’a été proposé le premier CPP ou peptide Troyen, qui fut alors défini comme un peptide ayant la capacité de franchir la membrane des cellules selon un mécanisme n’impliquant pas de récepteur et ne nécessitant pas d’énergie appelé « translocation directe ». Ce concept était alors complètement nouveau, allant à l’encontre du dogme de l’imperméabilité de la membrane plasmique vis-à-vis de composés hydrophiles de poids moléculaire élevé.
Par la suite, des analyses de mutations sur la séquence de la Pénétratine, ont confirmé la contribution importante de certains résidus pour le phénomène d’entrée. Ainsi, les substitutions des résidus basiques lysine et arginine (K46A/R53A, K46A/K57A, R53A/K57A et R52A/K55A) par une alanine diminuent l’efficacité d’entrée. Ces mutations augmentent l’hydrophobie du peptide et diminuent considérablement sa capacité d’établir des interactions électrostatiques avec des composants membranaires chargés négativement potentiellement nécessaires pour l’entrée dans la cellule. La contribution de certains résidus hydrophobes a également été confirmée. En effet, la substitution des deux tryptophanes par deux résidus phénylalanine (W48/F, W56/F) diminue l’efficacité d’entrée dans les cellules certainement parce que les interactions peptide / membrane sont modifiées. En revanche, ni la structuration du peptide en hélice α, ni le caractère amphiphile de la séquence ne semblent nécessaires à l’internalisation. En effet, l’introduction de résidus proline au sein de la séquence de la Pénétratine (diminuant la structuration en hélice) n’entraine pas de diminution de l’efficacité d’entrée dans la cellule. De plus, l’augmentation du caractère amphipathique de la Pénétratine par les mutations N51/A, R52/A et K55/L, augmenterait plus sa toxicité que son efficacité d’internalisation.
Les tests d’internalisation de ces séquences ont alors révélé que le fragment Tat(37- 53) (délétion entre autre de trois Arg) ne s’internalise pas, même à très forte concentration, alors que les peptides Tat(43-60) et Tat(48-60) entrent efficacement dans la cellule. Le fragment Tat(48-60) composé uniquement du domaine basique, conduit à une meilleure efficacité d’internalisation dans le noyau comparé à toutes les autres séquences testées dans cette étude. La même année, ce groupe de recherche a également montré que la délétion des 3 résidus situés à l’extrémité C-terminale (P58, P59, Q60) n’a pas d’influence, et que le peptide Tat(48-57) conserve les mêmes propriétés que Tat(48-60). Il apparait donc, que la séquence responsable de l’internalisation est fortement cationique. Le groupe de Wender a par ailleurs montré qu’une modification apparemment minime, par la délétion d’une arginine en extrémité C ou N-terminale, diminue considérablement l’efficacité d’internalisation du peptide. Des études similaires à celles menées sur la Pénétratine, ont révélé que l’internalisation du peptide Tat n’impliquerait pas non plus une reconnaissance par un récepteur membranaire.
Différentes catégories de CPP
La découverte de ces peptides capables de transporter des composés bioactifs dans le cytosol et noyau, a suscité un vif intérêt au sein de la communauté scientifique, et a conduit à la recherche de nouveaux peptides pénétrants. Ainsi, de nombreux CPP ont été proposés dans la littérature ces dernières années. On peut les classer en trois catégories selon leur origine : les CPP correspondant, comme le peptide Tat et la Pénétratine, à des domaines de transduction protéiques, les CPP chimériques et enfin, les CPP synthétiques (Tableau 1). Au sein de chacune de ces classes, les CPP peuvent présenter des caractéristiques physico-chimiques différentes. Parmi les CPP chimériques issus de la juxtaposition de domaines de protéines différentes, le Transportan se définit comme un peptide vecteur de 27 acides aminés à l’amphipathie primaire. Il dérive de la fusion entre la Galanine, un neuropeptide de séquence hydrophobe (résidus 1 à 12 du Transportan), et le Mastoparan, peptide de venin de guêpe ayant une nature hydrophile (résidus 14 à 27). L’analyse de l’internalisation du peptide a montré que le Transportan conduisait à une distribution intracellulaire non homogène. Il se localise dans un premier temps dans plusieurs compartiments vésiculaires avant de converger vers le noyau. Afin d’optimiser le vecteur, les auteurs ont synthétisé plusieurs analogues. La délétion des 6 premiers acides aminés de la région hydrophobe a ainsi permis de réduire la toxicité du peptide tout en gardant la même efficacité d’internalisation et a conduit au CPP Tp10. Celui-ci a été largement utilisé pour le transport de cargaisons dans la cellule. Le peptide Pep-1 proposé par Morris et al., constitue un autre exemple de vecteur chimérique amphiphile primaire comportant un domaine riche en résidus tryptophane. Pep-1 permet de délivrer efficacement des peptides et protéines dans les cellules et ne présente aucune toxicité à des concentrations allant jusqu’à 100 µM.
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Table des matières
CHAPITRE I : INTRODUCTION
1. LES PEPTIDES PENETRANTS OU CPP
1.1 Découverte des CPP : des séquences dérivées de domaines protéiques capables de pénétrer dans les cellules
1.1.1 La Pénétratine ou pAntp
1.1.2 Le peptide Tat(48-60)
1.2 Différentes catégories de CPP
2. LA MEMBRANE PLASMIQUE
2.1 Composants de la membrane pouvant être impliqués dans les processus d’internalisation des CPP
2.1.1 Les lipides membranaires
2.1.2 Les sucres membranaires
3. MECANISMES D’INTERNALISATION CELLULAIRE DES CPP
3.1 Une première étape décisive : l’interaction des CPP avec la membrane plasmique
3.2 L’endocytose
3.3 La translocation directe de la membrane
4. METHODES DE SUIVI DE L’INTERNALISATION
4.1 Techniques basées sur la fluorescence
4.2 Technique basée sur la spectrométrie de masse
4.3 Microscopie électronique
4.4 Techniques basées sur une réponse biologique induite
5. OPTIMISATION DES PROPRIETES DES CPP
5.1 Favoriser la fuite des endosomes
5.2 Modifications chimiques des CPP
5.2.1 Pseudo-peptides linéaires
5.2.2 Structures arborescentes
5.2.3 CPP fonctionnalisés par des chaînes d’acide gras
5.2.4 CPP cycliques
CHAPITRE II : JUSTIFICATION DU DESIGN ET DE L’APPROCHE SYNTHETIQUE
1. OBJECTIFS
2. STRUCTURES DES CONJUGUES
2.1 Incorporation de chaînes aliphatiques et cyclisation
2.2 Nature du lien entre le CPP et l’espèce transportée
3. CHOIX DE L’APPROCHE SYNTHETIQUE UTILISEE
3.1 Méthodes de synthèses des CPP cycliques utilisées dans la littérature
3.2 Synthèse des peptides cycliques par ligation chimique native (Native Chemical Ligation NCL)
3.2.1 La ligation chimique native
3.2.2 Stratégies existantes pour générer les peptides thioester sur support solide
CHAPITRE III : DEVELOPPEMENT DE NOUVEAUX PEPTIDES VECTEURS CYCLIQUES
1. SYNTHESES DES TRANSPORTEURS PEPTIDIQUES
1.1 Cyclisation de CPP classiques
1.1.1 Synthèse sur support solide en stratégie Boc des peptides thioester
1.1.2 Cyclisation des peptides thioester par ligation chimique native
2. SYNTHESE SUR SUPPORT SOLIDE EN STRATEGIE FMOC DE PEPTIDES COMPORTANT UNE α-METHYLE CYSTEINE C-TERMINALE
2.1 Cyclisation des dérivés α-méthyle cystéine
3. SYNTHESE DES VECTEURS LIPOPEPTIDIQUES CYCLIQUES
4. CONJUGAISON DES CPP CYCLIQUES A LEUR CARGAISON
4.1 Synthèse et conjugaison des CPP linéaires de référence
CHAPITRE IV : EVALUATIONS BIOLOGIQUES
1. L’ESPECE VECTORISEE : LE PKCI, UN PEPTIDE INHIBITEUR DES PROTEINES KINASES C
2. QUANTIFICATION DE L’INTERNALISATION CELLULAIRE DE PEPTIDES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE
2.1 Principe de la technique
2.2 Protocole de quantification par spectrométrie de masse MALDI-TOF
3. EVALUATION DES PROPRIETES DE VECTORISATION
3.1 Peptides vecteurs classiques linéaires
3.2 Effet de la cyclisation de ces CPP classiques
3.3 Impact de la fonctionnalisation des CPP [R9] et [Pen] par une chaîne lauryl
3.4 Etude du mécanisme d’entrée des CPP classiques linéaires et cycliques
4. ETUDE DE TRANSPORTEURS OLIGO-ARGININE CYCLIQUES FONCTIONNALISES PAR UNE CHAINE D’ACIDE GRAS
4.1 Etude des transporteurs lipopeptidiques : influence de la taille de la chaîne aliphatique
4.2 Etude des transporteurs lipopeptidiques : influence du nombre d’arginines
4.3 Etude des transporteurs lipopeptidiques : influence de la position de la chaîne aliphatique
4.4 Etude des transporteurs lipopeptidiques : effet de la substitution de la chaîne lauryl par des aminoacides hydrophobes
4.5 Etude des transporteurs lipopeptidiques : évaluation de la participation des GAG de surface dans le mécanisme d’entrée
5. Etude de la survie cellulaire
5.1 Principe du test de viabilité cellulaire
5.2 Etude de la cytotoxicité
CHAPITRE V : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
CHAPITRE VI : MATERIELS ET METHODES
CHAPITRE VII : REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE VIII : PUBLICATION
