Les oléosines, de nouveaux émulsifiants d’origine végétale

Bioémulsifiants 

Malgré des coûts de production encore élevés, les émulsifiants dérivés de sources naturelles présentent des avantages sur les agents émulsifiants synthétisés chimiquement à partir de pétrole. Les bioémulsifiants sont en effet biodégradables et non toxiques (Banat, 2000). Du fait de la demande croissante de produits naturels par les consommateurs, les bioémulsifiants pourraient donc trouver des applications variées.

Définition
Les bioémulsifiants sont définis comme étant des molécules amphiphiles actives aux surfaces et produites par des cellules vivantes. Les émulsifiants s’accumulent aux interfaces et réduisent la tension de surface (Fiechter, 1992).

Rôle physiologique
Le rôle physiologique des bioémulsifiants est de permettre aux microorganismes qui les produisent de se développer sur des substrats non miscibles à l’eau. En effet, les bioémulsifiants permettent l’émulsification de la source de carbone et ainsi l’augmentation de la surface des substrats hydrophobes insolubles dans l’eau. Ils augmentent aussi la biodisponibilité de ces substrats en augmentant leur solubilité apparente ou en les désorbant des surfaces. Ils régulent l’adhésion et le détachement des cellules aux surfaces. Certains ont la capacité de se lier aux métaux lourds, d’autres sont associés à la synthèse de produits pathogènes par les microorganismes et enfin, nombre de bioémulsifiants ont des propriétés antibiotiques qui jouent un rôle lors de la sporulation (Rosenberg et Ron, 1999 ; Ron et Rosenberg, 2001).

Caractéristiques d’émulsifiants
Les émulsifiants sont caractérisés selon leur capacité à abaisser la tension interfaciale (IFT) et leur concentration micellaire critique (CMC). L’IFT de référence de l’eau pure avec de l’air est d’environ 73 mN.m-1 à 20 °C. La CMC est la concentration à partir de laquelle l’émulsifiant en solution dans l’eau se rassemble sous la forme de micelles. Lorsque la concentration d’un émulsifiant est supérieure à sa CMC, il tend à s’auto-agréger (Gupta et Muralidhara, 2001). Une brutale variation de l’IFT est associée à ce phénomène. L’HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) permet de caractériser un émulsifiant, généralement de basse masse moléculaire (BMM). L’HLB est notée sur 20 (Stauffer, 1999 ; De Gennes et al., 2002). Plus le nombre de sites hydrophiles est important dans la molécule par rapport au nombre de sites hydrophobes, plus l’HLB sera élevée et plus l’émulsifiant sera soluble dans l’eau. Un émulsifiant est généralement soluble dans la phase continue de l’émulsion ; ainsi des émulsifiants ayant des HLB comprises entre 3 et 6 favoriseront des émulsions eau dans huile et des valeurs de 8 à 18 des émulsions huile dans eau (Meylheuc et al., 2001).

On peut ici opposer deux types d’émulsifiants : ceux de BMM et ceux de haute masse moléculaire (HMM). Les bioémulsifiants de BMM sont les glycolipides et les lipopeptides. Ceux de HMM sont généralement des polysaccharides amphiphiles, des protéines, des lipopolysaccharides, des lipoprotéines ou des mélanges de ces biopolymères. En effet, les protéines ont des activités de surface permettant la diminution de la tension interfaciale de fluides. Les bioémulsifiants de BMM abaissent les tensions de surface et interfaciale plus fortement que les protéines mais les bioémulsifiants de HMM sont plus efficaces dans la stabilisation d’émulsions huile dans eau. Les émulsions et les mousses formées par des protéines sont plus résistantes à la coalescence (Rosenberg et Ron, 1999). Les phénomènes d’adsorption et de désorption des protéines sont beaucoup plus lents que ceux mis en jeu par les émulsifiants de BMM.  Le classement des émulsifiants de BMM est basé soit sur la charge de leur tête, soit sur leur capacité à se dissoudre dans une phase aqueuse ou huileuse, selon leur HLB. En fait, dans de nombreux systèmes alimentaires, les émulsifiants de BMM, tels que les phospholipides (PLs), sont utilisés en association avec des protéines (Bos et Van Vliet, 2001).

Substances assimilées à des protéines

• Cirigliano et Carman (1984) ont mis en évidence la synthèse d’un émulsifiant par la levure Yarrowia lipolytica uniquement lorsqu’elle est cultivée sur des substrats carbonés non miscibles à l’eau. Le liposan produit possède un pouvoir émulsifiant pour des pH acides ou neutres. Il est stable entre 30 et 90 °C et son activité n’est pas dépendante d’ions métalliques. Il est soluble dans l’eau. Après purification, il peut servir à stabiliser un grand nombre d’émulsions huile dans eau. En 1985, Cirigliano et Carman ont déterminé que le liposan était constitué à 83 % de sucres (hétéropolysaccharide de glucose, galactose, galactosamine et acide galacturonique) et à 17 % de protéines. Si son pouvoir émulsifiant et stabilisateur est inférieur aux Triton (80, 20 et X-100), il a un meilleur pouvoir émulsifiant que les caséines, les alginates, le dextran et il est meilleur stabilisateur que les caséines, les pectines et le dextran.

• L’alasane produite par Acinetobacter radioresistens KA53 est constituée d’un polysaccharide et de trois protéines. Sa composante protéique fait 35,77 kDa et comporte quatre régions hydrophobes. Ces quatre régions constituent des sites de liaisons hydrophobes qui permettent à la protéine d’avoir une conformation correcte à la surface des gouttelettes lipidiques et préviennent ainsi la coalescence (Toren et al., 2002).

• Un bioémulsifiant est produit par une souche de Bacillus lorsqu’elle est cultivée en présence de pesticides organophosphorés (Patel et Gopinathan, 1986). Il permet l’émulsion des substrats non miscibles. Ce glycopeptide a une haute masse moléculaire, il est thermostable. Un tel bioémulsifiant pourrait avoir des applications dans la formulation de pesticides ou dans leur retraitement.

• Cameron et ses collaborateurs (1988) ont montré qu’une mannoprotéine, composante majoritaire de la paroi cellulaire de Saccharomyces cerevisiae, était un bioémulsifiant efficace : les émulsions stabilisées sont résistantes au cours de cycles de congélation / décongélation. Torabizadeh et al. en 1996 ont purifié ce bioémulsifiant : sa masse moléculaire est de 14 à 15,8 kDa et à partir de 1 kg de cellules de Saccharomyces cerevisiae, 100 g de mannoprotéine peuvent être récupérés.

Applications

Les applications potentielles des molécules surfactantes microbiennes sont l’émulsion, la séparation de phases, la mouillabilité, la formation de mousses, la solubilisation, l’inhibition de la corrosion, la diminution de la viscosité.

Ainsi, les déchets de type huiles de friture constituent un très bon substrat pour le développement d’une souche de Pseudomonas aeruginosa et la production d’un bioémulsifiant de type rhamnolipide (Haba et al., 2000). Les applications potentielles de la surfactine sont les suivantes : la biodégradation de déchets d’hydrocarbones (Moran et al., 2000), l’enlèvement des métaux lourds de sédiments (Mulligan et al., 2001). Elle possède de plus une forte activité déstabilisatrice de membranes et un pouvoir antibiotique (Heerklotz et Seelig, 2001). Certaines molécules émulsifiantes se placent à la surface de globules lipidiques et les stabilisent.

Globules lipidiques 

Généralités
Les lipides sont des constituants primordiaux des cellules : ils ont un rôle structural et ce sont des intermédiaires métaboliques, des messagers inter- et intra- cellulaires, des sites de reconnaissance à la surface des cellules et des produits de stockage. Les corps lipidiques de réserve sont souvent constitués de triglycérides (TGs), lipides non chargés. Ces corps lipidiques ne jouent pas de rôle dans l’organisation des membranes ou dans la signalisation. En plus du stockage de lipides, les animaux sont capables de transporter les lipides, insolubles dans leur système circulatoire, sous la forme de lipoprotéines. Ces corps lipidiques de transport animaux sont très proches morphologiquement des corps lipidiques de réserve végétaux, microbiens et animaux. Ils consistent tous en un cœur de lipides neutres entouré d’une monocouche de PLs dans laquelle s’insèrent des protéines spécifiques (Murphy, 1990). Dans ce chapitre, nous avons choisi de développer quelques exemples de corps lipidiques significatifs pour notre étude.

Animaux
En 1972, Christiansen et Jensen étudient les particules lipidiques du muscle cardiaque bovin. Ils en déduisent l’organisation tripartite : un cœur de triglycérides (TGs), entouré d’une couche de PLs et de protéines. Il existe deux sortes de globules lipidiques animaux : ceux de transport et ceux de réserve.

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Table des matières

Introduction
1.1. Avant-propos
1.2. Bioémulsifiants
1.2.1. Définition
1.2.2. Rôle physiologique
1.2.3. Caractéristiques d’émulsifiants
1.2.4. Grandes classes de bioémulsifiants d’origine microbienne
1.2.4.1. Émulsifiants glycolipidiques
1.2.4.2. Complexes lipides-polysaccharides
1.2.4.3. Bioémulsifiants lipides-acides aminés
1.2.4.4. Substances assimilées à des protéines
1.2.5. Applications
1.3. Globules lipidiques
1.3.1. Généralités
1.3.2. Animaux
1.3.2.1. Rôle physiologique
1.3.2.2. Protéines associées
1.3.3. Microorganismes
1.3.4. Graines des végétaux soumis à dessiccation .
1.3.4.1. Localisation des corps lipidiques de réserve de la graine
1.3.4.2. Structure des organites de réserve
1.3.4.3. Caractéristiques physico-chimiques
1.3.4.4. Mobilisation des réserves
1.3.5. Conclusion sur les globules lipidiques
1.4. Oléosines
1.4.1. Séquences des oléosines
1.4.1.1. Nucléotidiques
1.4.1.2. Protéiques
1.4.2. Structure
1.4.2.1. Extrémité N-terminale
1.4.2.2. Extrémité C-terminale
1.4.2.3. Segment central hydrophobe
1.4.3. Adressage des oléosines dans l’oléosome de la graine
1.4.3.1. Modèle de la biogénèse de l’oléosome
1.4.3.2. Domaines de l’oléosine requis pour l’adressage
1.4.3.3. Modèle consensuel
1.4.3.4. Régulation de l’expression des oléosines
1.4.4. Autres oléosines
1.4.4.1. Oléosines du tapetum floral et du pollen
1.4.4.2. Oléosines de la racine
1.4.4.3. Oléosines de la drupe de l’olive
1.4.5. Rôles physiologiques des oléosines
1.4.5.1. Stabilisation des oléosomes
1.4.5.2. Site de fixation pour la lipase
1.4.6. Applications industrielles pour les oléosines
1.4.6.1. Utilisation du promoteur des oléosines pour une expression ciblée vers la
graine
1.4.6.2. Expression et ciblage de protéines chimériques vers l’oléosome
1.4.6.3. Agents émulsifiants
1.4.7. Allergies
1.5. Deux organismes modèles
1.5.1. Plante : A. thaliana
1.5.2. Levure : Y. lipolytica
1.5.2.1. Physiologie de la cellule
1.5.2.2. Métabolisme des lipides
1.5.2.3. Expression de protéines hétérologues
1.6. But du travail
2. Matériel et méthodes
2.1. Stabilité d’émulsions huile /eau
2.1.1. Composants
2.1.1.1. PLs
2.1.1.2. TGs
2.1.2. Fabrication de l’émulsion
2.1.3. Suivi de la stabilité de l’émulsion
2.1.3.1. Spectrophotométrie
2.1.3.2. Microscopie optique
2.1.3.3. Diffusion dynamique de la lumière
2.2. Globules lipidiques d’A. thaliana
2.2.1. Isolement des corps lipidiques
2.2.2. Analyse des protéines
2.2.2.1. Électrophorèse en milieu dénaturant
2.2.2.2. Immunochimie
2.3. Isolement des globules lipidiques de levure
2.3.1. Souche
2.3.2. Culture
2.3.3. Extraction des lipides totaux
2.3.4. Dosage des phospholipides
2.3.4.1. Dosage du phosphore
2.3.4.2. Séparation des phospholipides
2.3.4.3. Dosage des phospholipides
2.3.5. Dosage des ergostérols et des esters d’ergostérols
2.3.6. Dosage des triglycérides
2.3.7. Dosage des acides gras
2.3.7.1. Méthylation des acides gras
2.3.7.2. CPG
2.3.8. Isolement des corps lipidiques
2.3.8.1. Analyse quantitative des protéines totales
2.3.8.2. Pureté des corps lipidiques
2.4. Méthodes d’étude de la tension interfaciale
3. Résultats et discussion
3.1. Propriétés interfaciales des lipides
3.1.1. Comportement dans des émulsions
3.1.2. Comportement sur une surface plane comprimée
3.2. Comparaison des globules lipidiques de plante et de levure
3.2.1. Oléosomes natifs d’A. thaliana
3.2.1.1. Analyse de la taille et des protéines spécifiques des oléosomes
3.2.1.2. Comportement des oléosomes en film
3.2.2. Corps lipidiques de Y. lipolytica
3.2.2.1. Isolement des corps lipidiques
3.2.2.2. Dosage des lipides
3.2.2.3. Comportement des particules lipidiques en film
Conclusion

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