Les nouveaux ligands des cyclophilines inhibent l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial et possèdent des propriétés hépatoprotectrices

Modulateurs du mPTP

Un grand nombre de substances peuvent influer sur l’ouverture du mPTP en augmentant ou en diminuant sa probabilité d’ouverture avec des effets qui peuvent être synergiques ou tout au moins additifs lorsqu’ils sont associés .

Le calcium

Le calcium est l’un des premiers inducteurs du mPTP identifié et reste à ce jour l’inducteur de référence dans de nombreux modèles expérimentaux (Hunter et al., 1976). Il existe de nombreux autres modulateurs du mPTP mais ces agents agissent généralement en modifiant la sensibilité du mPTP à la surcharge calcique. En effet, c’est la concentration matricielle de calcium qui, lorsqu’elle atteint un seuil, déclenche l’ouverture du mPTP. À l’inverse, le calcium cytosolique possède des propriétés inhibitrices en diminuant la probabilité d’ouverture du pore. Les ions calciques pénètrent dans la matrice mitochondriale ou s’en échappent en empruntant l’uniporteur calcique mitochondrial (MCU). L’utilisation d’un inhibiteur du MCU, le rouge de ruthénium, ou d’EGTA, un chélateur du calcium, permet de prévenir l’ouverture du mPTP induite par le calcium. Cependant, dans les conditions expérimentales comme celles des études dites de «swelling» ou celles visant à évaluer la capacité de rétention calcique mitochondriale, la concentration de calcium nécessaire à l’ouverture du mPTP est beaucoup plus élevée que celles qu’il est possible de rencontrer dans les situations physiologiques ou physiopathologiques. Ces observations conduisent à penser qu’in vivo la susceptibilité du mPTP est liée à l’association d’une surcharge calcique avec d’autres facteurs (Juhaszova et al., 2008).

Le potentiel de membrane

Si l’ouverture du mPTP est à l’origine de l’effondrement du ΔΨm, une dissipation du ΔΨm peut induire l’ouverture du mPTP (Bernardi et al., 1992). Cette situation nécessite cependant que la dissipation du gradient protonique ne soit pas associée à une diminution du pH matriciel puisque cette dernière empêche l’ouverture du mPTP. De la même façon le MCU doit être inhibé pour ne pas effluer le calcium vers le cytosol.
Le transporteur des nucléotides adényliques (adenine nucleotide translocase, ANT), l’un des composants putatifs du mPTP, pourrait quant à lui jouer un rôle de senseur électrique. En effet, une baisse du ΔΨm modifie la conformation de l’ANT qui passe d’une conformation cytosolique « c » à une conformation matricielle « m » et ce changement pourrait moduler l’état d’ouverture du mPTP (Halestrap et al., 1997a).

Le pH matriciel

Le pH matriciel influe également sur la vulnérabilité du mPTP. Une légère acidose possède des propriétés inhibitrices, probablement liées à la compétition des protons et des ions calcium au niveau des sites de fixation, tandis que l’alcalose augmente la probabilité d’ouverture du mPTP (Halestrap, 1991 ; Bernardi et al., 1992). D’autre part, lors d’une surcharge calcique, l’entrée de calcium à travers le MCU s’accompagne d’une diminution du ΔΨm rapidement compensée par une augmentation de l’activité de la chaîne respiratoire.
L’excrétion de protons vers l’espace intermembranaire qui s’ensuit fait augmenter le pH matriciel et sensibilise d’autant plus le mPTP.

Structure du mPTP

La cyclophiline D, un acteur majeur :La cyclophiline D est une protéine chaperonne ubiquitaire à activité peptidyl-proline cis trans isomérase (PPIase) située dans la matrice mitochondriale et dont le rôle physiologique exact n’est pas connu. Elle est, parmi les 17 cyclophilines identifiées chez l’Homme à ce jour, la seule à être adressée spécifiquement à la mitochondrie après sa synthèse. Toutes les cyclophilines présentent une activité enzymatique de repliement protéique liée à leur fonction PPiase mais elles se distinguent les unes des autres par une fonction propre qui dépend de déterminants structuraux (Galat, 1993).
Le rôle primordial joué par la CypD dans l’ouverture du mPTP a été démontré par l’utilisation de la CsA (Fournier et al., 1987 ; Crompton et al., 1988). La CsA est un inhibiteur non sélectif des cyclophilines. Surtout connue pour ses effets immunosuppresseurs dus à l’inhibition de la prolifération lymphocytaire via l’inhibition de l’interaction entre la cyclophiline A cytosolique et la calcineurine (voie du facteur nucléaire des lymphocytes T activés), la CsA est également un puissant inhibiteur de l’ouverture du mPTP par son action sur la CypD mitochondriale dont elle inhibe l’activité enzymatique et la liaison aux membranes. L’utilisation de la CsA permet d’inhiber l’ouverture du mPTP de mitochondries isolées à partir de différents tissus chez de nombreux animaux en augmentant fortement la quantité de calcium nécessaire à son ouverture. Pour s’affranchir des contraintes liées au pouvoir immunosuppresseur de la CsA, des dérivés non immunosuppressifs de la CsA comme le NIM-811 et le Debio-025 ont été synthétisés et conservent leur effet inhibiteur du mPTP.
La Sangliferhin A, un immunosuppresseur de structure très différente de la CsA s’est révélée être également un puissant inhibiteur du mPTP. Comme la CsA, la Sangliferhin A inhibe la fonction PPIase de la CypD. En revanche, elle n’empêche pas sa fixation aux composants putatifs du mPTP, ce qui indique que l’activité enzymatique de la CypD est essentielle pour moduler l’ouverture du mPTP (Clarke et al., 2002).

Autres protéines impliquées dans la régulation du mPTP

Faute d’identifier les composants structuraux du mPTP, de nombreux travaux ont contribué à l’identification de plusieurs protéines impliquées dans la régulation de l’ouverture du mPTP. La TSPO (18 kDa Translocator Protein), anciennement appelée récepteur périphérique aux benzodiazépines en raison de sa capacité à lier ces molécules, est une protéine de 18 kDa en charge du transport du cholestérol et localisée au niveau de la membrane externe mitochondriale. C’est sa capacité à co-précipiter avec l’ANT et le VDAC (McEnery et al., 1992) mais aussi le fait que des ligands naturels ou synthétiques de la TSPO sont capables d’inhiber l’ouverture du mPTP (Chelli et al., 2001 ; Li et al., 2007 ; Pastorino et al., 1994) qui ont impliqué cette protéine dans la structure du mPTP. Cependant, des travaux récents ont montré que la délétion de la TSPO au niveau cardiaque et hépatique chez des souris ne modifie pas la sensibilité du mPTP aux inducteurs classiques et mettent également en évidence un manque de spécificité des agents ciblant la TSPO (Sileikyte et al., 2014).
Les membres de la famille de Bcl-2 sont également capables de moduler l’ouverture du mPTP. En effet, si la protéine anti apoptotique Bcl-2 n’inhibe pas l’ouverture du mPTP (Yang et al., 2000), Bax et Bak semblent la favoriser puisque la délétion de ces protéines pro-apoptotiques inhibe le gonflement mitochondrial et la mort cellulaire liés au mPTP (Karch et al., 2013). D’autre part, chez ces animaux délétés, la réintégration d’une forme de Bax déficiente pour l’oligomérisation restaure la sensibilité du mPTP ce qui laisse penser que Bax peut en moduler l’ouverture indépendamment de son activité d’oligomérisation et de perméabilisation de la membrane externe.

Rôles physiologiques potentiels

L’impact de l’ouverture du mPTP sur le destin d’une cellule dépend avant tout de la proportion de mitochondries dont les pores sont ouverts et de la durée de cette ouverture.
Dans un contexte physiologique, des ouvertures transitoires et non coordonnées du mPTP pourraient permettre à la mitochondrie de libérer du calcium mais également d’autres agents tels que des ERO (Zorov et al., 2000). La mitochondrie est en effet le siège principal de la formation d’ERO au sein de la cellule. Une présence trop importante de ces ERO dans la mitochondrie, à proximité des complexes de la chaîne respiratoires et de lipides très sensibles à l’oxydation, peut contribuer à l’altération des fonctions respiratoires et participer activement au vieillissement cellulaire. Les ouvertures transitoires du mPTP permettraient donc d’éliminer ces produits de la chaîne respiratoire mitochondriale. Le relargage des ERO pourraient également jouer un rôle dans la signalisation cellulaire mais aussi dans la stimulation de canaux ioniques ou l’expression génique.
Bien que le calcium accumulé dans la matrice mitochondrial soit normalement efflué via les échangeurs Na+/Ca2+ et H+/Ca2+ mitochondriaux, le mPTP pourrait également servir de voie d’efflux additionnelle en cas de surcharge calcique prolongée (Bernardi et von Stockum, 2012; Ichas et Mazat, 1998). Cette hypothèse est supportée par la démonstration que l’inhibition prolongée du mPTP entraîne une accumulation de calcium au sein de la mitochondrie et est à l’origine de dysfonctions cardiaques (Elrod et Molkentin, 2013). Ainsi, l’ouverture transitoire du mPTP apparaît comme un moyen de vidanger le calcium intramitochondrial excédentaire.

Rôles pathologiques et mort cellulaire

L’ouverture du mPTP entraîne la perméabilisation de la membrane interne. Le premier effet de cette perméabilisation est l’abolition du gradient électrochimique et la dépolarisation de la membrane mitochondriale. Cette dépolarisation a pour conséquence d’arrêter le fonctionnement de l’ATP synthase et donc la production d’ATP. Pour tenter de rétablir le potentiel, l’ATP synthase fonctionne en sens inverse, en hydrolysant l’ATP, accélérant ainsi la déplétion énergétique. Un autre effet de l’ouverture du mPTP est lié à la pression oncotique importante qui règne dans la matrice mitochondriale. Du fait de cette pression oncotique, la perméabilisation entraîne un afflux d’eau et d’ions dans la mitochondrie à l’origine d’un gonflement mitochondrial. S’il est suffisamment important, ce gonflement peut aboutir à la rupture de la membrane externe et au relargage de médiateurs proapoptotiques tels que le cytochrome c, l’Apoptosis Inducing Factor (AIF) et le Second Mitochondria-derived Activator of Caspases ou Direct IAP Binding protein with low pI (SMAC/DIABLO). Bien que les protéines présentes dans le cytosol des cellules puissent tempérer l’effet de la différence de pression colloïdale et que le gonflement mitochondrial soit ainsi plus modéré que dans les conditions in vitro, il est admis que ce gonflement peut être suffisamment intense pour provoquer la rupture de la membrane externe (Martinou et Green, 2001). Des études sur mitochondries de foie de rat ont montré que le cytochrome c est majoritairement séquestré dans les crêtes mitochondriales et ne peut donc être libéré qu’à condition que les crêtes s’élargissent, phénomène observé lors du gonflement mitochondrial (Frey et Manella, 2000 ; Scorrano et al., 2002).

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Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE 
SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : LE PORE DE TRANSITION DE PERMÉABILITÉ MITOCHONDRIAL
1. HISTORIQUE
2. MODULATEURS DU MPTP
2.1. Le calcium
2.2. Le potentiel de membrane
2.3. Le pH matriciel
2.4. Le phosphate inorganique (Pi) et les nucléotides adényliques
2.5. Le stress oxydant
3. STRUCTURE DU MPTP
3.1. La cyclophiline D, un acteur majeur
3.2. Hypothèse initiale : association ANT/PiC/VDAC
3.3. Hypothèse : formation d’agrégats protéiques
3.4. Hypothèse actuelle : implication de la FoF1-ATP Synthase
3.5. Autres protéines impliquées dans la régulation du mPTP
4. RÔLES PHYSIOLOGIQUES POTENTIELS 
5. RÔLES PATHOLOGIQUES ET MORT CELLULAIRE 
5.1. Implications pathologiques
5.2. Exemple de l’ischémie-reperfusion cardiaque et cardioprotection
5.2.1. Physiopathologie de l’infarctus du myocarde
5.2.1.1. Déclenchement de l’infarctus du myocarde
5.2.1.2. Conséquences de l’épisode d’ischémie-reperfusion
5.2.1.2.1. Perturbations homéostasiques liées à l’ischémie
5.2.1.2.2. Perturbations homéostasiques liées à la reperfusion
5.2.1.2.2.1. Surcharge calcique
5.2.1.2.2.2. Stress oxydant
5.2.1.2.2.3. Ouverture du mPTP
5.2.1.3. Prise en charge actuelle de l’infarctus
5.2.1.4. Stratégies cardioprotectrices expérimentales spécifiques à la reperfusion
5.2.1.4.1. Pré/post-conditionnements ischémiques
5.2.1.4.1.1. Concept de conditionnement ischémique
5.2.1.4.1.2. Mécanismes d’action du conditionnement
5.2.1.4.1.3. Effets métaboliques et homéostasiques
5.2.1.4.1.4. Stimulation des voies de survie cellulaire
5.2.1.4.1.4.1.Activation de la voie RISK
5.2.1.4.1.4.2.Activation de la voie SAFE
5.2.1.4.1.5. Inhibition du mPTP
5.2.1.4.2. Post-conditionnement pharmacologique
5.2.1.4.2.1. Agents pharmacologiques limitant la surcharge calcique
5.2.1.4.2.2. Agents limitant le stress oxydant
5.2.1.4.2.3. Agents pharmacologiques activant la voie RISK
5.2.1.4.2.4. Agents ciblant la mitochondrie
5.2.1.4.2.5. Perspectives du post-conditionnement pharmacologique
CHAPITRE II : LA CYCLOPHILINE D
1. GÉNÉRALITÉS SUR LES CYCLOPHILINES
1.1. Structure
1.2. Fonctions
1.3. Localisation subcellulaire
1.4. Cyclophiline D
2. LA CYCLOPHILINE D – HISTORIQUE
2.1. Rôles de la CypD
2.1.1. Mort cellulaire, nécrose et apoptose
2.1.2. Rôles physiologiques
2.1.2.1. Homéostasie calcique
2.1.2.2. Adaptation métabolique
2.1.2.3. Mitophagie
2.1.3. Régulation de la CypD et implications pathologiques
2.1.3.1. S-Nitrosylation
2.1.3.2. Phosphorylation
2.1.3.3. Acétylation
2.1.3.4. Oxydation
2.1.3.5. Régulation par interaction avec les protéines
3. INHIBITION PHARMACOLOGIQUE DE LA CYPD ET DU MPTP 
3.1. La cyclosporine A
3.2. Les dérivés de la cyclosporine A
3.3. Petits inhibiteurs de CypD
3.4. Les Small-molecules cyclophilin inhibitors (SmCypI)
3.4.1. Indication initiale : vers de nouveaux antiviraux
3.4.2. Rationnel de développement : Fragment Based Drug Discovery
3.4.3. Première caractérisation
OBJECTIFS DU TRAVAIL 
PARTIE EXPÉRIMENTALE
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. MODÈLES ANIMAUX
2. RÉACTIFS 
3. ÉTUDE DES FONCTIONS MITOCHONDRIALES
3.1. Isolement des mitochondries de foie et de cœur de rat
3.2. Étude du gonflement mitochondrial
3.3. Évaluation de la capacité de rétention calcique mitochondriale
3.4. Évaluation du potentiel de membrane mitochondrial
3.5. Mesure de la phosphorylation oxydative
4. MESURE DE L’ACTIVITE PEPTIDYLPROLYL CIS-TRANS ISOMERASE DES EXTRAITS CYTOSOLIQUES ET MITOCHONDRIAUX DE CŒUR ET DE FOIE DE SOURIS
4.1. Préparation des extraits protéiques
4.2. Mesure de l’activité PPIase
5. EXPERIENCES DE MICROSCOPIE A FLUORESCENCE SUR CELLULES
5.1. Acquisition et analyse des résultats
5.2. Ouverture du mPTP dans les hépatocytes primaires
5.2.1. Modèle cellulaire
5.2.2. Marquage des cellules
5.2.3. Ouverture du mPTP
5.3. Etudes sur cardiomyocytes adultes isolés de souris
5.3.1. Isolement de cardiomyocytes de souris adultes
5.3.1.1. Prélèvement du cœur
5.3.1.2. Perfusion de type Langendorff et digestion enzymatique
5.3.1.3. Réintroduction du calcium
5.3.1.4. Evaluation de la viabilité cellulaire
5.3.1.5. Ensemencement des cardiomyocytes isolés
5.3.2. Marquage des cellules
5.4. Effet des ionophores calciques
5.5. Hypoxie-réoxygénation
6. ÉTUDE DE L’EFFET DU COMPOSÉ C31 IN VIVO
6.1. Administration intraveineuse chez les animaux sains
6.2. Modèle d’ischémie-reperfusion hépatique chez la souris
7. ÉTUDE DU COMPOSÉ C31 EX VIVO, DANS UN MODÈLE DE CŒUR ISOLÉ-PERFUSÉ
8. ANALYSE STATISTIQUE
RÉSULTATS
RÉSULTATS 1 : LES NOUVEAUX LIGANDS DES CYCLOPHILINES INHIBENT L’OUVERTURE DU PORE DE TRANSITION DE PERMÉABILITÉ MITOCHONDRIAL ET POSSÈDENT DES PROPRIÉTÉS HÉPATOPROTECTRICES
1. OBJECTIF DU TRAVAIL
2. MODÈLES EXPÉRIMENTAUX
3. RÉSULTATS
3.1. Les nouveaux ligands de la CypD inhibent l’ouverture du mPTP de mitochondries hépatiques isolées
3.2. Le composé C31 inhibe l’ouverture du mPTP par un mécanisme d’action original
3.3. Le composé C31 inhibe l’ouverture du mPTP dans les hépatocytes primaires
3.4. L’administration in vivo de C31 protège les mitochondries au cours de l’ischémie-reperfusion hépatique
4. CONCLUSIONS
5. RÉSULTATS COMPLEMENTAIRES
RÉSULTATS 2 : LES IONOPHORES CALCIQUES NE SONT PAS UTILISABLES POUR ÉTUDIER L’OUVERTURE DU MPTP DANS DES CARDIOMYOCYTES ADULTES ISOLÉS MURINS
1. OBJECTIF DE L’ÉTUDE
2. PROTOCOLES EXPÉRIMENTAUX
3. RÉSULTATS
3.1. Effets des ionophores électroneutres : A23187 et ionomycine
3.2. L’ETH129 induit l’entrée de calcium dans la mitochondrie et provoque l’hypercontracture cellulaire suivie de la mort des cardiomyocytes
3.3. Le modèle d’hypoxie-réoxygénation induit une ouverture du mPTP dépendante de la CypD
4. CONCLUSION
RÉSULTATS 3 : LE NOUVEAU LIGAND DE LA CYPD, C31, INHIBE
L’OUVERTURE DU MPTP DANS DES MITOCHONDRIES CARDIAQUES
1. OBJECTIF DU TRAVAIL
2. PROTOCOLES EXPÉRIMENTAUX
3. RÉSULTATS
3.1. Le C31 atteint les mitochondries hépatiques mais pas les mitochondries cardiaques in
vivo
3.2. Le C31 inhibe l’ouverture du mPTP de mitochondries cardiaques isolées
3.3. Le C31 inhibe l’ouverture du mPTP dans les cardiomyocytes isolés et retarde la mort
cellulaire induite par l’hypoxie-reoxygenation
3.4. De fortes concentrations d’inhibiteurs de CypD sont nécessaires pour inhiber
l’ouverture du mPTP dans un modèle de cœur isolé-perfusé
3.5. Les cyclophilines cytosoliques ne sont pas responsables de l’absence d’effet de la CsA
et du C31 in vivo
4. CONCLUSION
DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSION

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