Soutenance mémoire
Formation d’un biofilm
La formation d’un biofilm représente un changement fondamental dans le mode de vie des bactéries. Cette transition correspond au passage d’un mode de vie planctonique et individuel à un mode de vie communautaire et sessile. C’est un processus dynamique et complexe. Il est caractérisé par une modification de l’expression génétique et par un changement de phénotypes des micro-organismes concernés . Par conséquent, les mêmes individus ne possèdent plus les mêmes propriétés ni les mêmes fonctions.
L’environnement particulier du biofilm permet aux cellules de coopérer et d’interagir de manière différente de lorsqu’elles sont sous forme planctonique dans un milieu liquide, fluide ou même solide. Ainsi, les bactéries vivant en biofilm ont des propriétés sensiblement différentes de celles des bactéries planctoniques de la même espèce. Il faut noter que dans la littérature, les facteurs génétiques et environnementaux permettant la transition entre ces deux modes de vie commencent tout juste à être identifiés et étudiés.
L’effet des biofilms sur le pH de leur environnement
Les biofilms ont des compositions hétérogènes de microbes et sont connus pour leur influence sur la chimie de leur environnement et spécifiquement dans le maintien de l’équilibre du pH. Leur intérêt pour la science de l’environnement, la médecine et la biocatalyse est bien établi, Leur sensibilité et leur réactivité à différents environnements hydrodynamiques a récemment commencé à attirer plus l’attention des chercheurs en microfluidique. Comme par exemple, le biofilm oral de bactérie type Streptococcus salivarius est connu par le changement du pH dans les bouches des mammifères. Lorsque cultivés dans un milieu enrichi en glucose dans un dispositif microfluidique, il est noté que le pH à proximité du biofilm varie rapidement lorsque la concentration du glucose dans la phase liquide augmente ou diminue .
La structure responsable de la résistance dans le biofilm
Les biofilms présentent une fonction primaire qui est la protection. Plusieurs études ont été réalisées pour examiner la diffusion des antibiotiques par les biofilms et elles ont montré que la matrice extracellulaire peut agir comme une barrière limitant la pénétration des composants antimicrobiens . En effet, lors du traitement antibiotique les cellules près de l’interface liquide du biofilm meurent, tandis que les cellules bactériennes intégrées profondément à l’intérieur du biofilm sont capables de survivre. Un des facteurs expliquant cette résistance des biofilms aux agents antimicrobiens est la matrice polymérique qui agit comme barrière réduisant ou empêchant la diffusion des agents antimicrobiens .
Les biofilms dans les écosystèmes naturels et leurs effets néfastes
Les avancées scientifiques dans le domaine de la microbiologie ont montré l’existence de biofilms bactériens dans des écosystèmes naturels à savoir le fond des océans, les fleuves, les lacs, les tissus vivants, ou même encore dans l’air atmosphérique . Ces biofilms sont responsables de nombreux problèmes de santé publique. Ils représentent une source de contaminations et se manifestent dans un grand nombre de secteurs. Les secteurs hospitaliers, médicaux et agroalimentaires sont particulièrement les plus touchés. Par exemples, La contamination des canalisations des réseaux d’eau potable, des instruments chirurgicaux (cathéters, implants, prothèses, endoscopes) et des appareillages utilisés dans l’agroalimentaire (laiteries, planches de découpe de viande) font partie des problèmes rencontrés. La formation de biofilms sur les coques de navires, appelé phénomène de « biofouling » , conduit à une augmentation de résistance hydrodynamique, une diminution de la vitesse des bateaux et par conséquent des coûts énergétiques considérables.
Enfin, des biofilms se manifestent dans tous les environnements et sont associés à des surfaces minérales, végétales (surface des feuilles) ou animales (surfaces dentaires).
Le marquage des MSNs avec des fluorophores
La microscopie à fluorescence conventionnelle et la microscopie confocale sont les procédés principaux de l’imagerie optique. L’imagerie optique de fluorescence est basée sur la fluorescence des tissus ou sur celle des fluorophores. Cette technique est très utilisée pour l’étude cellulaire et les essais in vitro. Les colorants fluorescents et les points quantiques (quantum dots) sont les sondes d’imagerie optique de fluorescence les plus utilisés. Dans la littérature, le marquage des nanoparticules de silice mésoporeuses est généralement élaboré par greffage (au niveau de la surface interne) de colorants fluorescents (l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la rhodamine B, l’alexa fluor 750, le vert d’idocyanine et le colorant rouge). Ces colorants sont des molécules organiques, appelées fluorochromes, qui se caractérisent par la présence de groupements chromophores capables d’émettre une lumière fluorescente suite à leur excitation à une certaine longueur d’onde.
Dispositif microfluidique
La microfluidique est la science qui traite le contrôle et la manipulation de liquide dans les canaux avec, au moins une dimension inférieure à 1000 µm. Les dispositifs microfluidiques présentent une plateforme prometteuse pour les études de biofilms bactériens parce qu’ils fournissent un système fermé dans lequel les biofilms bactériens peuvent interagir avec les environnements hydrodynamiques. Le fluide qui circule dans ces dispositifs est très stable et le rendement de réponse est rapide en raison du faible nombre de Reynolds. En outre, dans les dispositifs microfluidiques, on peut créer des modèles in vivo avec des conditions précises dans les plates formes de culture en trois dimensions. L’approche microfluidique peut potentiellement révéler le mécanisme de formation d’un biofilm sous-jacent et de résoudre un certain nombre de problèmes lors de sa croissance .
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
I. THEORIE
I.1 Définition d’un biofilm
I.2 Structure d’un biofilm
I.2.1 La matrice extracellulaire polymérique
I.2.2 Les polysaccharides
I.2.3 Les protéines
I.2.4 Les acides nucléiques
I.3 Formation d’un biofilm
I.4 L’effet des biofilms sur le pH de leur environnement
I.5 La structure responsable de la résistance dans le biofilm
I.6 Le biofilm dans les écosystèmes naturels et leurs effets néfastes
I.7 Les techniques d’élimination des biofilms
I.7.1 Élimination de biofilms par le nettoyage mécanique
I.7.2 Élimination par les agents antibactériens
I.8 Les matériaux mésoporeux structurés
I.8.1 Les nanoparticules de silice mésoporeuses (MSNs)
I.8.2 La fonctionnalisation de la surface des MSNs
I.8.4 Le marquage des MSNs avec des fluorophores
I.8.6 Le déclanchement ciblé en fonction de la variation de pH
I.9 Dispositif microfluidique
I.10 Les avantages de dispositifs microfluidiques
I.10.1 Les faibles volumes
I.10.2 La taille de microcanaux
I.10.3 Les conditions hydrodynamiques précises
I.10.3.1 L’écoulement laminaire
I.10.3.2 Les forces de cisaillement
I.11 Fabrication des dispositifs microfluidiques
II. LES MATERIAUX ET APPAREILS UTILISES
II.1 Les nanoparticules type MCM-48
II.2 Les fluorophores
II.3 Les souches bactériennes, conditions de culture
II.4 Le dispositif microfluidique MF (matériels et équipements)
II.5 Les accessoires microfluidique
II.6 Les matériels expérimentaux
II.6.1 Le microscope optique à lumière blanche
II.6.2 Le microscope optique à lumière fluorescente
II.6.3 Le microscope confocale à balayage laser (CLSM)
II.6.4 La Spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée (ATR-FTIR)
II.7 Procédures expérimentales
II.7.1 La microfluidique
II.7.1.1 Conception géométrique du dispositif MF
II.7.1.2 Fabrication de moules par photolithographie
II.7.2 Fabrication du réacteur microfluidique
II.7.3 La culture du biofilm
II.7.4 Stratégies de fixation d’un dépôt de MSNs sur un microcanal MF
II.7.4.1 Les injections successives de suspension de NPS dans le microcanal
II.7.4.2 Dépôt par la technique « flow-deposition »
II.7.4.3 Test d’adhésion de dépôt et influence de flux hydrodynamique
II.7.5 Fixation du dépôt au milieu du microcanal MF ouvert par. Traitement par un surfactant anionique
II.7.6 Mesure des cinétiques de relargage aux différents débits par microscopie in situ
III. RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1 Solubilité de flourophore
III.2 Courbes de calibration
III.3 Mesure de la libération de fluorescéine dans les MSNs vide (sans fonctionnalisation)
III.4 Analyse de la libération de fluorescéine dans les MSNs vide (sans fonctionnalisation) avec des différents débits
III.5 Mesure de la libération de fluorescéinamine dans les MSNs avec fonctionnalisation avec un débit de 1 mL/h
III.5.1 Les MSNs sans fonctionnalisation
III.5.2 Les NPS MSN fonctionnalisés avec NH2dans les pores
III.5.3 Les NPS MSN fonctionnalisé avec le phosphonates
III.5.4 Comparaison de la libération de la fluorescéine entre les MSNset NPs sans pores
III.5.5 Efficacité en fonction du temps
III.6 Les mesures de la couche des nano silice obtenues avec le microscope confocale CLSM
III.7 Vérification de la séchage total de MSNs après l’adsorption de fluorophore en utilisant la Spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée (ATR)
III.8 Étude de biocompatibilité de dépôt MSNs et le biofilm
IV. CONCLUSION
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