Soutenance mémoire
Caractères remarquables
La plante est une liane volubile de 3 à 4m, ligneuse à la base, capable de s’enrouler autour des arbustes.
Les feuilles sont alternes, paripennées avec 7 à 10 paires de folioles.
Les fleurs sont de couleur rose, regroupées en courtes grappes pédonculées avec des bractées à la base du calice.
Les gousses mesurent environ 3 cm de long et contiennent 5 à 6 graines ovoïdes de couleur rouge vif comportant une tache noire (Boullard, 2001 ; Adjanohoun et coll, 1979).
Habitat
C’est une espèce pantropicale, localisée dans les forêts denses et les galeries forestières en savane (Adjanohoun et coll, 1979).
Emplois
Elle est considérée comme une plante toxique, son utilisation est surtout externe :
Les graines sont écrasées pour traiter les abcès, les inflammations des bras et des jambes ;
Le macéré ou décocté des feuilles est employé contre les conjonctivites ;
Les feuilles sucrées sont aussi utilisées comme antitussif et antigastralgique (Kerharo et Adam, 1974).
Dans les ouvrages sacrés des indes, les graines servaient de médicament contre les affections du système nerveux et des maladies de la peau (Kerharo et Adam, 1974).
Elles sont aussi utilisées pour confectionner des chapelets d’où le nom d’arbre à chapelet donné à la plante (Arbonnier, 2002).
Au Mali, la plante est employée comme antitussif et aphrodisiaque (Adjanohoun et coll, 1979 ).
Drogue
Elle est constituée par les graines.
Les graines sont ovoïdes, brillantes, bicolores : la région du hile est pourpre presque noire, le reste étant rouge (Bruneton, 1987).
Phytochimie
On savait que les graines contiennent une phytoxine protéique : l’abrine qui est une aminoacide, le N- méthyltryptophane, constituée de l’albumine et la globine .
En plus de l’abrine, les graines renferment : de l’acide abrique, des terpènes, du β sistérol, du stigmastérol, de l’acide gallique, un alcaloïde, de l’acide polygalacturonique, du pentosane, des sucres réducteurs, un glucoside et une hémagglutinine qui se comporte comme enzyme lipolitique (Kerharo et Adam 1974).
Les racines, les tiges, et les feuilles sont riches en glycyrrhizine qui donne après hydrolyse deux molécules d’acide glucuronique (Iserin et coll, 2001).
Pharmacologie
La toxicité de la graine n’est possible qu’une fois le tégument externe dur est enlevé, sinon elle échappe à la désintégration lors de la digestion et la toxine ne serait pas libérée (Kerharo et Adam, 1974).
D’après Diacono, l’extrait aqueux des graines récentes possèdent une toxicité plus élevée que celui des anciennes graines sur le cobaye (Desai et Sirsi, 1966).
Par contre les extraits alcooliques sont doués d’une activité antibactérienne sur : Staphylococcus aureus, Escherichia coli… .
Cette activité antibactérienne est surtout élevée avec les extraits à base de tégument (Desai et Sirsi, 1966).
Par ailleurs des effets abortives et tératogènes de l’extrait des graines ont été observés après des essais histopathologiques sur des rats et des souris (Iserin etcoll, 2001).
Caractères remarquables
Arbuste buissonnant, originaire d’Amérique tropicale, long de 2 à 3 m, ramifié à la base, portant des branches tendres et cassantes.
Il porte de grandes feuilles composées, pennées, ayant environ 10paires de folioles opposées, arrondies aux extrémités.
Les fleurs sont jaunes très ornementales, situées à la cime où elles forment des grappes terminales.
Le fruit est une gousse droite à bordures parallèles, disponible presque toute l’année (Boullard, 2001; Lavergne et coll, 1989).
Habitat
Plante originaire d’Amérique, introduite dans toutes les régions tropicales, spontanée ou procultivée, rarement retrouvée dans les agglomérations (Adjanohoun et coll, 1983).
Emplois
Les feuilles fraîches écrasées sont utilisées pour traiter les affections de la peau (Co, 1989).
Elles sont aussi considérées comme purgatif en préparation buvable (Quisumbing, 1978).
Pour le traitement des céphalées, on place autour de la tête un bandeau contenant un mélange de feuilles fraîches, d’écorce et de racines pilées (Kerharo et Adam, 1974).
Contre les douleurs articulaires, le décocté des feuilles est administré par voie orale ou utilisé comme bain (Kerharo et Adam, 1974).
Hormis le traitement des maladies, la plante possède d’autres usages :
La plante entière sert de décor dans les jardins ;
L’écorce est utilisée dans les tanneries pour confectionner le cuir ;
Les feuilles servent à préparer un poison de pêche (Arbonnier, 2002).
Phytochimie
La plante entière contient une quantité importante d’acide chrysophanique surtout dans les fruits et de l’acide cyanhydrique.
Hauptmann et Lacerda Nazario ont isolé des feuilles des anthraquinones réduites qui par oxydation de la rhénine produisent du glucose et du rhamnose.
Dans les graines, Tiwari et Coll ont mis en évidence la chrysophanol et fait l’analyse des lipides.
Bouquet caractérisa dans les feuilles et les écorces de l’espèce congolaise des saponosides et des quinones (Kerharo et Adam, 1974).
Pharmacologie
L’usage de Cassia alata comme purgatif se justifie par la présence d’anthraquinones dans les feuilles (Quisumbing, 1978).
Le décocté des feuilles fraîches a une activité anti-fongique dans le traitement du pityriasis versicolore, de l’eczéma et le pied d’athlete.
En effet, l’acide chrysophanique trouvé dans plusieurs parties de la plante, produit une action curative sur les dermatoses (Co, 1989).
D’autre part, des études ayant porté sur les extraits bruts de feuilles ont prouvé des activités antalgiques et anti-inflammatoires de la plante (Villasenor et coll, 2002).
Généralité sur les lectines et le groupe sanguin A
Les lectines
Définition
Les lectines sont des protéines animales ou végétales capables de se fixer aux hydrates de carbone de la surface cellulaire et provoquer la liaison des cellules en amas (ABOVIE sur www.abovie.com).
D’autre part, les lectines sont considérées comme une famille hétérogène de récepteurs qui reconnaissent certaines structures oligosaccharidiques et jouent un rôle majeur dans les processus d’interactions entre les cellules (Hebert, 2001).
Historique
Les lectines ont été décrites pour la première fois en 1888 par Stillmark ;depuis lors, beaucoup de travaux furent consacrés aux lectines (Roken, 1948).
Ainsi des graines de céréale, la recherche des lectines fut élargie aux légumineuses, à la laiterie … (D’Adamo, 1999).
Elles ont surtout été utilisées pour étudier la physiologie ou certaines activités immunologiques des cellules (Sharon, 1972).
Dans les années 40, la purification des lectines a permis leur usage dans la détermination des groupes sanguins (Bird, 1974).
La spécificité des lectines aux sucres fut vérifiée sur plusieurs formes de vie (animaux, insectes, mycètes ) pour expliquer des phénomènes biologiques : défense des plantes contre les herbivores, insectes, mycètes (Pusztai et Ewen, 1999).
Ce n′est qu′au cours des années 70 que la recherche sur les lectines a commencé à augmenter dans le monde entier (Krispin, 1999).
Propriétés
Les lectines sont des protéines hydrosolubles retrouvées surtout dans les graines des légumineuses (Etzer, 1994).
Elles ressemblent à des glycoprotéines de la membrane des cellules végétales et se comportent comme des anticorps en assurant un rôle défensif contre les bactéries et les champignons (Guignard, 1985).
Ce sont des substances thermolabiles, responsables de la toxicité de certaines plantes : ricin, jéquirity, haricot … (Bruneton, 1993).
Elles sont aussi reconnues pour leur spécificité aux sucres, ce qui a permis leur usage dans la détermination des groupes sanguins (Bird, 1974) et à l’étude des structures osidiques de la membrane cellulaire, importantes pour élucider certains comportements de la cellule (Hebert, 2001).
Description de quelques lectines connues
L’abrine et la ricine sont des lectines à activité hémagglutinante extraites respectivement de l’arbre à chapelet et du ricin, reconnues pour leur toxicité.
Elles sont constituées de deux fragments protéiques :
– une chaîne A : incapable de franchir les membranes cellulaires, inhibiteur de la synthèse des protéines ;
– une chaîne B : non cytoxique, assurant la reconnaissance des sucres membranaires et la fixation de la lectine sur le récepteur pour faciliter la translocation de l’unité A à travers la membrane (Bruneton, 1987).
La phasine est une phytoagglutinine provenant du haricot, spécifique aux hématies du groupe A, constituée de deux dimères canoniques rattachés par des liaisons bêta (Hamelryck, 1996).
En général, on distingue trois types majeurs de lectines végétales que sont :
– Les mérolectines incapables de se lier aux cellules (lectines des orchidées) ;
– Les hololectines capables d’agglutiner les cellules (lectines des légumineuses) ;
– Les chimérolectines qui se comportent soit en hololectines ou en mérolectines (ricine).
Le groupe sanguin A
Définition
Les groupes sanguins constituent un ensemble d’antigènes allotypiques regroupés en systèmes génétiquement induits (Sultan, 1978). Le groupe sanguin A est une composante du système ABO, caractérisé par un antigène non protéique, donc qui n’est pas un produit direct de gène, de nature glucidique : la N-acétylgalactosamine (Genetet et Muller, 1999).
Structure chimique
Le groupe sanguin A comprend plusieurs variantes antigéniques ; en pratique courante, ce n’est que deux phénotypes qui sont recherchés : A1(80%) et A2 (20%) possédant 2 à 3 fois moins d’antigènes que A1 (Bastie, 1998).
L’expression phénotypique de l’antigène A est sous la dépendance du gène A responsable de la formation de l’antigène A dont la structure chimique est la NAcetyl- D-Galactosamine (representé ci-dessous).
L’antigène A ainsi constitué est accolé à la substance H qui est la structure de base des groupes sanguins du système ABO (Najman, 1994).
Les lectines spécifiques au groupe sanguin A
La spécificité de la lectine du Phaseolus limensis au groupe sanguin A est due à son affinité très élevée de liaison à la N-acétyl galactosamine (Hamelryck et coll, 1996).
Cette lectine a une structure quaternaire semblable à celle de la phytoagglutinine de la Glycine soja qui agglutine en plus du GalNac, le galactose, et les glycoprotéines à galactose terminal (Sharon, 1972).
La lectine du Dolichos biflorus agglutine fortement les hématies A1 et très faiblement celles du type A2 (Chassaigne, 1984).
Cela s’explique par la préférence de cette lectine au trisaccharide GalNac α1-3 Fuc α1-2 Gal beaucoup plus retrouvé chez les hématies A1 (Hamelryck et coll, 1999).
Sélection des hématies du groupe A
Les hématies du groupe A ont été testées à l’anticorps anti A1 : les hématies qui ont produit une forte agglutination sont du sous groupe A1et celles qui ont donné une agglutination très faible ou un test négatif sont du groupe A2 .
Les hématies ainsi obtenues ont été au préalable soumises à un lavage puis à une dilution.
Lavage des hématies
Nous avons disposé d’échantillons de sang du groupe A1 et A2 dans des tubes à essai différents.
Sur chaque échantillon de sang est mentionné le groupe correspondant.
Dans les tubes, il y a environ 3 cc de sang auquel, nous avons ajouté 1ml d’eau physiologique.
Après agitation, le mélange obtenu est soumis a une centrifugation (1000trs /mn) pendant 5mn.
Le surnageant formé est versé et le culot d’hématies obtenu est de nouveau mis en suspension sous agitation avec de l’eau physiologique.
Cette opération est reprise quatre fois de suite dans les mêmes conditions.
Dilution des hématies
Elle est faite à 5%, soit une goutte d’hématies lavées pour 19 gouttes d’eau physiologique dans de nouveaux tubes portant le nom des sous groupes A correspondant aux hématies utilisées .
Techniques d’agglutination
Technique en tube
Nous avons utilisé deux tubes contenant respectivement trois gouttes d’hématies diluée à 5% du groupe A1 et A2, pour chaque extrait. 50μl d’extrait végétale est ajouté dans chacun des tubes.
Après 5mn d’incubation, le mélange est centrifugé à 1000trs/mn pendant 1mn.
Le culot d’hématies formé au fond du tube est lavé à 3 reprises à l’eau physiologique.
En cas de réaction positive, les hématies se présentent sous forme de lambeaux fins.
Technique sur plaque
Nous avons étalé sur une plaque d’opaline, une goutte de sang dilué à 5% des groupes A1 et A2.
A chaque goutte de sang est ajouté l’extrait végétal à volume égal .
Le mélange est ensuite trituré avec de l’extrémité inférieure d’un tube à hémolyse.
Après, la plaque est oscillée lentement pendant quelques secondes, puis laissée au repos.
Au bout de 2 mn, nous avons procédé à la lecture des réactions d’agglutination à l’oeil nu.
Les tests négatifs sont contrôlés au microscope optique à l’objectif 10.
Technique
A 150μl d’une solution de sucre dosée à 2g / ml est ajouté 20μl de solution d’extrait.
Ce mélange est agité et laissé au repos pendant 5mn puis testé à volume égal sur 50μl d’hématies diluées à 5%, étalées sur une plaque.
Ces hématies sont triturées ; après oscillation de la plaque , la lecture de l’agglutination est faite à l’oeil nu dans les 2 à 3mn..
Interprétation
Un extrait est considéré comme spécifique à un sucre dans le cas ou ce dernier parvient à inhiber au préalable les réactions d’agglutination en agissant probablement avec les lectines sensées être dans l’extrait.
COMMENTAIRES ET DISCUSSIONS
Le travail que nous avons réalisé, rentre dans le cadre de l’étude de l’activité hémagglutinante des phytoagglutinines que sont les lectines.
Pour mener ce travail à bien, il nous a fallu adapter un protocole d’extraction et des techniques d’agglutination à nos conditions de laboratoire puisque la manipulation des extraits de lectine n’est pas aisée.
C’est pourquoi, nous avons tenu compte dans notre protocole d’extraction de la nature protéique des lectines en utilisant l’eau physiologique comme solvant à basse température.
Nous avons également procédé à une méthode d’extraction proche de celle d’Animashaun qui a beaucoup travaillé sur l’activité agglutinante des lectines sur les hématies (Animashaun, 1983).
Quand aux techniques d’agglutination que nous avons employées, elles ont été élaborées par Beth Vincent et permettent d’identifier des antigènes à la surface des hématies à l’aide d’anticorps ou de phytoagglutinines (Letonturier, 1996).
Nous avons observé l’activité hémagglutinante des extraits de quatre plantes dont deux ont donné un test positif, il s’agit des extraits d’Erythrina senegalensis et d’Arbrus precatorius.
Les extraits de Cassia alata et de Swartia madagascariensis n’ont pas agglutiné les hématies ; mais il est à noter que les extraits de Swartzia madagascariensis ont provoqué une hémolyse, comme cela a été précedemment annoncée par Pousset en 2004.
Cette activité hémolytique est due à la présence de saponoside dans les graines (Kerharo et Adam, 1974).
Dans le but d’améliorer l’activité hémagglutinante des extraits, nous avons procédé à leur purification par la chromatographie sur gel.
En effet, les filtrats obtenus à la purification ont eu une activité supérieure à celle des extraits initiaux.
Ce résultat pourrait insinuer que le filtrat contient moins d’impureté sans être un extrait pur de lectine, car comme l’a dit Bruneton : l’obtention d’extrait pur de lectine n’est pas facile à réaliser (Bruneton, 1987).
En tout cas, une augmentation de l’activité des extraits est importante pour la suite de nos investigations.
Ainsi, nous avons procédé à la lyophilisation des extraits actifs pour éviter leur détérioration lors de la conservation.
Aussi, les tests d’agglutination ont été opérés sur des hématies du groupe A dans les sous -groupes A1 et A2 ; ce qui a donné une activité plus élevée des extraits d’Arbrus precatorius par rapport à ceux d’Erythrina senegalensis.
Cela nous a amené à dire que les extraits d’Arbrus precatorius pourrait contenir plus de phytoagglutinine ou bien reconnaissent mieux ou plus d’antigène sur les globules rouges.
Pour lever cet équivoque, nous avons du point de vue quantitatif, observé que les agglutinations de l’extrait d’Arbrus precatorius nécessite une quantité de lyophilisat inférieure à celle utilisée dans le cas d’Erythrina senegalensis pour un même volume de solvant (en comparant les résultats du Tableau 4 et Tableau 5).
Cette évaluation quantitative n’est pas une indication précise parce qu’elle n’exprime pas directement les doses de lectine pure.
Sur le plan qualitatif, les tests d’inhibition des agglutinations ont permis de faire une évaluation des extraits relative à leur spécificité à des sucres témoins, portés par certains antigènes de groupe sanguin.
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Table des matières
Première partie
Introduction
Objectifs
Deuxième partie
Revue de la littérature
Troisième partie : Notre étude
Matériels et Méthodes
Résultats et Analyses
Commentaires et Discussions
Conclusion
Références bibliographiques
Annexes
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